氨基化硅膠協(xié)同hsccc提取醬油渣中大豆異黃酮的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了氨基化硅膠協(xié)同HSCCC提取醬油渣中大豆異黃酮的方法。該方法將醬油渣提取物經(jīng)MPLC純化，洗脫；將正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水放置，分離上相與下相；以上相作為固定相，下相為流動相，制得分離樣品溶液；在無水乙醇‐蒸餾水中加入正硅酸酯，調(diào)節(jié)pH值，反應(yīng)，加入γ‐氨丙基三乙氧基硅烷，靜置陳化，制得γ‐氨丙基硅膠微球；將上相作為固定相，下相為流動相泵入高速逆流色譜儀，注入加有γ‐氨丙基硅膠微球的上相與下相的混合液，進行高速逆流色譜分離，得大豆異黃酮。本發(fā)明利用逆流色譜的液液分配及其硅膠微球改性基團吸附的協(xié)同作用，改善強極性天然產(chǎn)物的分離效果，有效解決高速逆流色譜中強極性物質(zhì)分離的難題。
【專利說明】氨基化硅膠協(xié)同HSCCC提取醬油渣中大豆異黃酮的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及大豆異黃酮，特別是涉及一種氨基化硅膠協(xié)同HSCCC提取醬油渣中大豆異黃酮的方法，屬于農(nóng)副產(chǎn)品深加工及食品工業(yè)【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]醬油渣是醬油生產(chǎn)的副產(chǎn)品，生產(chǎn)過程有大量醬油渣生成。目前對其開發(fā)利用有限，主要用作飼料或肥料的配料，附加值低，對其有效成分的提取分離及高值化利用是醬油渣開發(fā)利用的一個重要方向。因此，提取分離出有藥用價值的大豆異黃酮，對醬油渣循環(huán)利用的研究將具有重要的意義。即使在制取醬油后的豆渣仍含有豐富的大豆異黃酮成分，大豆異黃酮是大豆中的一種天然植物雌激素，具有多種生物學(xué)作用，與人體健康密切相關(guān)，除具有抗腫瘤作用外，還對衰老、心血管疾病、骨質(zhì)疏松癥及更年期綜合癥具有預(yù)防和治療作用。因此，為了利用醬油渣資源，提取分離出有藥用價值的大豆異黃酮，對醬油渣循環(huán)利用的研究將具有重要的意義。
[0003]中壓色譜(MPLC)相對于常壓色譜來說，分離效率更高；比高壓制備色譜來的經(jīng)濟，儀器要求配置低；使用預(yù)裝柱，可以提高效率。主要用于大量的復(fù)雜有機混合物、組合化學(xué)、新藥開發(fā)或天然產(chǎn)物研究過程中的分離和純化，具有速度快、省溶劑、分離量大和重復(fù)性好等特點。
[0004]高速逆流色譜(HSCCC)是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一種連續(xù)高效的液-液分配色譜分離技術(shù)。其原理是螺旋管分離柱在做行星式運動時產(chǎn)生的變化離心力場將一部分固定相永久的保留在螺旋管中，使兩相溶劑在分離柱中呈單向性分布，形成單相流體動力平衡體系。流動相與固定相反復(fù)接觸，溶質(zhì)被兩相多次萃取、分配，最終按照分配系數(shù)的不同，實現(xiàn)分離。其不僅使樣品能夠全部回收，回收的樣品更能反映其本來的特性，特別適用于天然生物活性成分的分離。
[0005]現(xiàn)時對大豆異黃酮進行提取，主要是以加熱回流提取為主，但加熱回流提取對熱不穩(wěn)定成分不適用，溫度過高導(dǎo)致部分黃酮類化合物分解；在放大到工業(yè)生產(chǎn)時超聲提取效果較差。高速逆流色譜技術(shù)在分離一些簡單體系和中、低極性樣品體系方面存在其它分離技術(shù)無可超越的優(yōu)勢，但對于強極性的物質(zhì)分離效果卻受到溶劑體系的制約。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，提供一種氨基化硅膠協(xié)同HSCCC提取醬油渣中大豆異黃酮的方法。
[0007]本發(fā)明利用逆流色譜的液液分配及其硅膠微球改性基團吸附分離的協(xié)同作用，來改善逆流色譜的分離效果，提高分離效率。本發(fā)明在高效逆流色譜分離天然產(chǎn)物的過程中加入Y -氨丙基硅膠微球，利用HSCCC溶劑系統(tǒng)和硅膠微球的協(xié)同作用，來改善天然產(chǎn)物的分離效果。本發(fā)明通過把強極性的氨基鍵合到硅膠微球的表面，可解決強極性物質(zhì)的分離問題，而親水作用色譜可滿足這種分離的需要；本發(fā)明將逆流色譜柱中引入Y -氨丙基硅膠微球，利用逆流色譜的液液分配及其硅膠微球改性基團吸附的協(xié)同作用，來改善強極性天然產(chǎn)物的分離效果；本發(fā)明在不改變逆流色譜儀器的基礎(chǔ)上，借鑒高效液相色譜的研究思路，將逆流色譜液液分配原理與Y -氨丙基硅膠微球的吸附分離功能有機的結(jié)合起來，在逆流色譜柱中填入Y -氨丙基硅膠微球并對其進行改性，引入功能化基團，利用逆流色譜的液液分配及其硅膠微球改性基團吸附分離的協(xié)同作用，來改善逆流色譜的分離效果，提高分離效率。
[0008]本發(fā)明為了實現(xiàn)上述目的，采用如下技術(shù)方案:
[0009]一種氨基化硅膠協(xié)同HSCCC提取醬油渣中大豆異黃酮的方法，包括以下步驟:
[0010](1)粗提物的制備:將醬油渣提取物經(jīng)MPLC純化，以乙醇-蒸餾水為洗脫液，流速為15 - 25ml/min進行梯度洗脫，然后將溶劑減壓濃縮，得到大豆異黃酮粗提物，置冰箱保存；
[0011](2)樣品溶液的制備:將正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水加入到分液漏斗中，充分震蕩后放置12 - 24小時，將上相與下相分離；按體積份數(shù)計，正己烷為100份，乙酸乙酯為150 - 200份，甲醇為150 - 250份，水為150 - 200份；以上相作為固定相，下相為流動相；將100體積份上相與80 -130份下相混合，每毫升上相與下相的混合物中溶解大豆異黃酮粗提物3 - 15毫克，制得分離樣品溶液；
[0012](3) Y -氨丙基硅膠微球的制備:按體積份數(shù)計，在100 -120份無水乙醇-蒸餾水中加入13- 15份正硅酸酯，調(diào)節(jié)pH值到7-9，反應(yīng)0.5- 1.0h后，再加入2 - 3份Y -氨丙基三乙氧基硅烷，靜置陳化24 - 48h，制得Y -氨丙基硅膠微球；無水乙醇與蒸餾水的體積比為3:5 - 3:7 ；
[0013](4)高速逆流分離:將上相作為固定相泵入高速逆流色譜儀，將高速逆流色譜儀的多層膠管柱充滿；當(dāng)高速逆流色譜儀穩(wěn)定運行時，將下相為流動相，將流動相泵入到多層膠管前端；當(dāng)有15 - 25ml的固定相被推出的時候,注入1- 3ml加有、-氨丙基硅膠微球的上相與下相的混合液，且每毫升上相與下相的混合物中加入Y -氨丙基硅膠微球100 -300毫克；當(dāng)有流動相從多層膠管尾端流出時，將5 - 15ml樣品溶液從進樣口注入，再補充注入10 - 20ml固定相，進行高速逆流色譜分離，得大豆異黃酮。
[0014]為進一步實現(xiàn)本發(fā)明目的，優(yōu)選地，所述梯度洗脫是在前15min內(nèi)，以純水進行洗脫；15 - 30min內(nèi)，洗脫液為20%乙醇-80%水；30 - 45min內(nèi)，洗脫液為40%乙醇-60%水；45 - 60min內(nèi)，洗脫液為60%乙醇-40%水；60 - 75min內(nèi)，以80%乙醇-20%水進行洗脫；75 -90min內(nèi)，以95%乙醇-5%水進行洗脫；然后將溶劑減壓濃縮，得到大豆異黃酮粗提物，置冰箱保存；
[0015]所述將上相作為固定相泵入高速逆流色譜儀是以8.5 - 10.5ml/min的流速將上相作為固定相泵入高速逆流色譜儀。所述將流動相泵入到多層膠管前端是將流動相以1.2 - 1.8ml/min的流速泵入到多層膠管前端。所述穩(wěn)定運行的速度優(yōu)選為600 - 800rpm。
[0016]用紫外檢測器在254nm波長持續(xù)檢測高速逆流色譜分離的流出物，得到醬油渣提取物的HSCCC色譜圖，根據(jù)譜圖中不同峰的出峰時間，收集每個峰的流出物，得大豆異黃酮。
[0017]與已有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果:
[0018](1)本發(fā)明不用任何固態(tài)載體的液、液色譜技術(shù)，分離效率高，產(chǎn)品純度高。[0019](2)本發(fā)明不存在載體對樣品的吸附和污染，制備量大和溶劑消耗少。
[0020](3)本發(fā)明顯著提高了醬油渣的附加值，有利于醬油渣的綜合開發(fā)利用。
[0021](4)本發(fā)明也適用于其他中高極性天然產(chǎn)物的提取，對極性樣品的吸附作用更顯著。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1A、1B、1C、1D為對比實施例和實施例1中Y -氨丙基硅膠微球加入量分別為0mg、200mg、400mg和600mg的醬油渣提取物的HSCCC色譜圖。
[0023]圖2A、2B為實施例2流速分別為1.2mL/min和1.8mL/min時醬油渣提取物的HSCCC
色譜圖。
[0024]圖3A、3B、3C為實施例進樣量分別為50mg、150mg和200mg的HSCCC色譜圖。【具體實施方式】
[0025]以下結(jié)合具體實施例來對本發(fā)明作進一步說明，但本發(fā)明所要求保護的范圍并不局限于實施例所表述的范圍。
[0026]以高速逆流色譜法提取醬油渣中大豆異黃酮的方法為對比實施例。
[0027]對比實施例
`[0028]將醬油渣提取物經(jīng)中壓色譜(MPLC)純化，以乙醇-蒸餾水為洗脫液，流速為20ml/min進行梯度洗脫。O - 15min時，以100%水進行洗脫；15 - 30min時，洗脫液為20%乙醇，80%水；30 -45min時，洗脫液為40%乙醇，60%水；45 -60min時，洗脫液為60%乙醇，40%水；60 - 75min時，以80%乙醇，20%水進行洗脫；75 - 90min時，以95%乙醇，5%水進行洗脫。以波長254nm檢測目標(biāo)物大豆異黃酮。然后將溶劑減壓濃縮，得到大豆異黃酮粗提物，置冰箱保存；
[0029]將正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水按體積比1:2:2:1.8加入到分液漏斗中，充分震蕩后放置一晚，將上相與下相分離，以上相作為固定性，下相為流動相。每毫升上相與下相(體積比為1:1)的混合物中溶解粗提物5毫克，制得分離樣品溶液。
[0030]將上相作為固定相以9.9ml/min通過輸液泵輸入高速逆流色譜儀，將多層膠管中充滿。將儀器以700rpm的速度穩(wěn)定運行，使儀器內(nèi)形成單向流體動力體系，將下相為流動相以1.2ml/min的流速泵入到多層膠管前端，達到單向流體動力平衡狀態(tài)。當(dāng)有流動相從尾端流出時，將2ml分離樣品溶液(每毫升上相與下相混合物中溶解50mg樣品)從進樣口注入，繼續(xù)用流動相進行洗脫。用紫外檢測器在254nm持續(xù)檢測膠管尾部的流出物，如圖1A所示，根據(jù)譜圖中不同峰的出峰時間，從出峰時間初到出峰時間末手動收集每個峰的流出物，然后經(jīng)高效液相鑒定純度。以甲醇一 0.1%乙酸水作為流動相，流動相的流速為0.8mL/min,進行二元線性梯度洗脫(甲醇:10 - 20min, 45 - 65%; 20 - 50min, 65%; 20 - 25min, 65 - 75%)，以波長254nm檢測目標(biāo)物大豆異黃酮。最后用量筒測得相應(yīng)的保留值。
[0031]實施例1
[0032]將醬油渣提取物經(jīng)MPLC純化，以乙醇-蒸餾水為洗脫液，流速為20ml/min進行梯度洗脫。O -15min時，以100%水進行洗脫；15 -30min時，按體積計，洗脫液為20%乙醇，80%水；30 - 45min時，按體積計，洗脫液為40%乙醇，60%水；45 - 60min時，按體積計，洗脫液為60%乙醇，40%水；60 - 75min時，按體積計，以80%乙醇，20%水進行洗脫；75 - 90min時，以
95%乙醇，5%水進行洗脫。以波長254nm檢測目標(biāo)物大豆異黃酮。然后將溶劑減壓濃縮，得到大豆異黃酮粗提物，置冰箱保存；
[0033]將正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水按體積比1:2:2:1.8加入到分液漏斗中，充分震蕩后放置一晚，將上相與下相分離；每毫升上相與下相(體積比為1:1)的混合物中溶解粗提物5毫克，制得分離樣品溶液；
[0034]加入100ml無水乙醇/蒸餾水(ν: v=3:7)，再加入15ml正硅酸酯，調(diào)節(jié)pH值到9。反應(yīng)0.5h后，再加入3ml Y -氨丙基三乙氧基硅烷，靜置陳化24h，制得Y -氨丙基硅膠微球。
[0035]高速逆流色譜技術(shù)是一種無固體載體的連續(xù)高效的液液分配色譜分離技術(shù)，采用多層纏繞的螺旋膠管柱，由柱體的高速行星式運動產(chǎn)生的不對稱離心力場實現(xiàn)兩相溶劑體系的高效混合、分配及充分保留，形成連續(xù)流萃取，從而實現(xiàn)不同溶解分配系數(shù)的溶質(zhì)在兩相溶劑中的高效分離。以9.8ml/min的流速將上相作為固定相泵入高速逆流色譜儀，將多層膠管柱充滿；當(dāng)儀器以700rpm的速度穩(wěn)定運行時，將下相為流動相以1.2ml/min的流速泵入到高速逆流色譜儀中的多層膠管前端；觀察到有20ml的固定相被推出的時候(已經(jīng)充滿)，通過六通閥注入2ml Y -氨丙基硅膠微球的上下相混合液；當(dāng)有流動相從多層膠管尾端流出時，將IOml分離樣品溶液從進樣口注入，緊隨其后再補充注入15ml固定相，進行高速逆流色譜分離；用紫外檢測器在254nm波長持續(xù)檢測流出物，根據(jù)如下不同的、-氨丙基硅膠微球的加入量(圖1A表示的情況未加入Y -氨丙基硅膠微球)，分別得到圖1B、1C、ID為所示的Y -氨丙基硅膠微球加入量分別為200mg、400mg和600mg的醬油渣提取物的HSCCC色譜圖。根據(jù)圖1A、1B、1C、1D中峰I和峰II的出峰時間，手動分別收集每個峰的流出物，得到溶于流動相的大豆異黃酮，然后經(jīng)高效液相色譜鑒定純度，根據(jù)大豆異黃酮的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的HPLC測定結(jié)果比對，表明峰I為大豆苷元，峰II為染料木素(統(tǒng)稱為大豆異黃酮)。最后用量筒測得相應(yīng)的保留值。檢測結(jié)果如表1所示，表1中加入的Y -氨丙基硅膠微球的量為200mg，400mg，600mg，即每毫升上相與下相(體積比為1:1)的混合物中加入Y -氨丙基硅膠微球100，200，300毫克。對比實施例未加入-氨丙基硅膠微球。
[0036]表1不同量的Y -氨丙基硅膠微球?qū)SCCC分離參數(shù)影響
【權(quán)利要求】
1.氨基化硅膠協(xié)同HSCCC提取醬油渣中大豆異黃酮的方法，其特征在于包括以下步驟:(1)粗提物的制備:將醬油渣提取物經(jīng)MPLC純化，以乙醇-蒸餾水為洗脫液，流速為15 - 25ml/min進行梯度洗脫，然后將溶劑減壓濃縮，得到大豆異黃酮粗提物，置冰箱保存； (2)樣品溶液的制備:將正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水加入到分液漏斗中，充分震蕩后放置12 - 24小時，將上相與下相分離；按體積份數(shù)計，正己烷為100份，乙酸乙酯為150 - 200份，甲醇為150 - 250份，水為150 - 200份；以上相作為固定相，下相為流動相；將100體積份上相與80 -130份下相混合，每毫升上相與下相的混合物中溶解大豆異黃酮粗提物3-15毫克，制得分離樣品溶液； (3)Y -氨丙基硅膠微球的制備:按體積份數(shù)計，在100 - 120份無水乙醇-蒸餾水中加入13- 15份正硅酸酯，調(diào)節(jié)pH值到7-9，反應(yīng)0.5- 1.0h后，再加入2 - 3份Y -氨丙基三乙氧基硅烷，靜置陳化24 - 48h，制得Y -氨丙基硅膠微球；無水乙醇與蒸餾水的體積比為 3:5 - 3:7 ; (4)高速逆流分離:將上 相作為固定相泵入高速逆流色譜儀，將高速逆流色譜儀的多層膠管柱充滿；當(dāng)高速逆流色譜儀穩(wěn)定運行時，將下相為流動相，將流動相泵入到多層膠管前端；當(dāng)有15 - 25ml的固定相被推出的時候,注入1- 3ml加有、-氨丙基硅膠微球的上相與下相的混合液，且每毫升上相與下相的混合物中加入Y -氨丙基硅膠微球100 - 300毫克；當(dāng)有流動相從多層膠管尾端流出時，將5 - 15ml樣品溶液從進樣口注入，再補充注入10 - 20ml固定相，進行高速逆流色譜分離，得大豆異黃酮。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的氨基化硅膠協(xié)同HSCCC提取醬油渣中大豆異黃酮的方法，其特征在于:所述梯度洗脫是在前15min內(nèi)，以純水進行洗脫；15 - 30min內(nèi)，洗脫液為20%乙醇-80%水；30 - 45min內(nèi)，洗脫液為40%乙醇-60%水；45 - 60min內(nèi)，洗脫液為60%乙醇-40%水；60 - 75min內(nèi)，以80%乙醇-20%水進行洗脫；75 - 90min內(nèi)，以95%乙醇-5%水進行洗脫；然后將溶劑減壓濃縮，得到大豆異黃酮粗提物，置冰箱保存。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的氨基化硅膠協(xié)同HSCCC提取醬油渣中大豆異黃酮的方法，其特征在于:所述將上相作為固定相泵入高速逆流色譜儀是以8.5 - 10.5ml/min的流速將上相作為固定相泵入高速逆流色譜儀。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的氨基化硅膠協(xié)同HSCCC提取醬油渣中大豆異黃酮的方法，其特征在于:所述穩(wěn)定運行的速度為600 - 800rpm。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的氨基化硅膠協(xié)同HSCCC提取醬油渣中大豆異黃酮的方法，其特征在于:所述將流動相泵入到多層膠管前端是將流動相以1.2 - 1.8ml/min的流速泵入到多層膠管前端。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的氨基化硅膠協(xié)同HSCCC提取醬油渣中大豆異黃酮的方法，其特征在于:用紫外檢測器在254nm波長持續(xù)檢測高速逆流色譜分離的流出物，得到醬油渣提取物的HSCCC色譜圖，根據(jù)譜圖中不同峰的出峰時間，收集每個峰的流出物，得大豆異黃酮。
【文檔編號】C07D311/40GK103755674SQ201410013130
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月10日
【發(fā)明者】梁勇, 吳繼明, 楊明泉, 陳穗, 劉占, 孫麗霞, 樊瑞 申請人:廣東美味鮮調(diào)味食品有限公司