一種野生型rhNGF的制備方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種野生型β-hNGF的制備方法，步驟為：hNGF片段獲??；酶切后與載體連接，誘導(dǎo)表達(dá)，親和層析純化；Factor?Xa或腸激酶或Genenase?I切除MBP標(biāo)簽蛋白，獲得野生型β-hNGF。此方法能夠產(chǎn)業(yè)化方法，純化得率高，純度高。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種野生型rhNGF的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及野生型rhNGF的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]自上世紀(jì)70年代以來(lái)，大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)一直是基因工程中應(yīng)用最為廣泛的表達(dá)系統(tǒng)。作為外源基因表達(dá)的宿主，大腸桿菌遺傳背景清楚，技術(shù)操作簡(jiǎn)單，培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，大規(guī)模發(fā)酵經(jīng)濟(jì)，倍受遺傳工程專(zhuān)家的重視。盡管基因工程表達(dá)系統(tǒng)已經(jīng)從大腸桿菌擴(kuò)大到酵母、昆蟲(chóng)、植物及哺乳動(dòng)物細(xì)胞，并且近年來(lái)出現(xiàn)了很多新型的真核表達(dá)系統(tǒng)，但是大腸桿菌仍然是基因表達(dá)的重要工具。尤其是進(jìn)入后基因組時(shí)代以來(lái)，有關(guān)蛋白結(jié)構(gòu)以及功能研究的開(kāi)展，對(duì)基因表達(dá)的要求更高，這時(shí)原核表達(dá)往往是表達(dá)的第一選擇。
[0003]眾所周知，原核表達(dá)存在兩個(gè)缺點(diǎn):第一，容易形成包涵體；第二，大多數(shù)的重組表達(dá)方案都會(huì)在重組蛋白的上游的引入多余的氨基酸殘基。無(wú)法獲得可溶性的、天然無(wú)多余氨基酸殘留的野生型目的蛋白。目前需要一種解決以上問(wèn)題的蛋白制備方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種能夠產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)野生型hNGF的方法。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種野生型β-hNGF的制備方法，其特征在于，包括如下步驟， [0006]I) hNGF 片段獲取:
[0007]PCR擴(kuò)增:上游引物5 ’端引入XmnI酶切識(shí)別位點(diǎn)序列GAAGGAGTTC，下游引物引入多克隆位點(diǎn)上其他任意酶切識(shí)別位點(diǎn)，同時(shí)下游引物的反義鏈3’端必須帶有終止密碼子；利用該對(duì)引物擴(kuò)增β-hNGF成熟肽編碼序列；或
[0008]通過(guò)人工合成或在上游引物中引入Ile-Glu-Gly-Arg或Asp-Asp-Asp-Asp-Lys或Pro-Gly-Ala-Ala-His-Tyr的編碼堿基進(jìn)行擴(kuò)增；
[0009]2)酶切:分別雙酶切PCR產(chǎn)物和載體并回收；所述載體帶有類(lèi)似XmnI酶切識(shí)別位點(diǎn)或表達(dá)產(chǎn)物可被Factor Xa的內(nèi)切酶酶切的載體；
[0010]3)連接:T4連接酶連接載體和雙酶切后的PCR產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌株并進(jìn)行鑒定；
[0011]4)誘導(dǎo)表達(dá):IPTG誘導(dǎo)表達(dá)；
[0012]5)親和層析純化:麥芽糖蛋白親和層析純化獲得MBP-NGF重組蛋白；
[0013]6)獲得野生型β-hNGF:Factor Xa或腸激酶或Genenase I切除MBP標(biāo)簽蛋白，獲得野生型β -hNGF。
[0014]所述I)步驟中的PCR擴(kuò)增，上游引物序列為SEQ ID NO:1，下游引物序列為SEQ IDNO: 2，下游引物帶HindIII酶切位點(diǎn)。
[0015]所述2)酶切中，所述載體為 PMAL-C2X，pMAL-p2X, pMAL-c2E, pMAL-p2E, pMAL-c2G,pMAL-p2G, pGEX-4T-l 或 pGEX_4T_2。[0016]所述5)親和層析純化為:
[0017](I)低溫離心收集目的蛋白表達(dá)菌體；
[0018](2)用Resuspending Buffer重懸菌體，在冰水浴中進(jìn)行超聲波破碎，所述Resuspending Buffer 為 20mM Tris-HCl;50mM NaCl;ImM CaCl2; ImM DTT ；pH6.5 ；
[0019](3)低溫離心，緩慢吸取上清液，濾膜過(guò)濾后移至新離心管中，置冰上待純化；
[0020](4)不溶物再用Resuspending Buffer重懸,重復(fù)以上步驟進(jìn)行超聲處理；離心獲取上清液，沉淀可再進(jìn)行超聲破碎或進(jìn)行再次重復(fù)；
[0021](5)重力柱純化或者Akta蛋白純化:
[0022]所用的填料為Dextrin Sepharose HP,
[0023]輕柔、充分翻轉(zhuǎn)搖勻填料懸濁液，用寬嘴槍頭吸取樹(shù)脂漿，待樹(shù)脂完全沉降，打開(kāi)層析柱下方旋鈕，當(dāng)儲(chǔ)存緩沖液即20%乙醇液面降到柱床上沿以下時(shí)，用5倍樹(shù)脂體積的ddH20洗樹(shù)脂,然后再用5倍樹(shù)脂體積Binding Buffer平衡樹(shù)脂；
[0024]待Binding Buffer流到柱床上沿以下,加入制備好的蛋白抽提液；將流速控制在每小時(shí)10倍柱體積；重復(fù)吸附一次，收集穿過(guò)組分并置于冰上；
[0025]用5倍樹(shù)脂體積Binding Buffer洗柱,收集穿過(guò)組分并置于冰上；
[0026]用8倍樹(shù)脂體 積Elution Buffer洗脫目的蛋白，收集洗脫組分置于冰上；
[0027]所述收集穿過(guò)組分即為純化后的MBP-NGF重組蛋白；
[0028]所述Binding Buffer 為 20mM Tris-HCl; 50mM NaCl; ImM CaCl2; ρΗ6.5、ElutionBuffer 為 20mM Tris-HCl; 50mM NaCl; ImM CaCl2; IOmM Maltose ；pH6.5 ;均用 ddH20 配置Binding Buffer、Elution Buffer, 0.22 μ m 過(guò)濾器過(guò)濾除菌。
[0029]所述5)親和層析純化為:
[0030](I)低溫離心收集目的蛋白表達(dá)菌體；
[0031](2)用IOmL Resuspending Buffer重懸200ml LB培養(yǎng)的浙干菌體,在冰水浴中進(jìn)行超聲波破碎，超聲破碎條件:25%脈沖，功率200w, IOmin,開(kāi)Is關(guān)2s ;所述ResuspendingBuffer 為 20mM Tris-HCl;50mM NaCl;ImM CaCl2; ImM DTT ；pH6.5 ；
[0032](3)4°C，12000rpm離心20min沉淀不溶物；緩慢吸取上清液，0.45 μ m濾膜過(guò)濾后移至新離心管中，置冰上待純化；
[0033](4)不溶物再用Resuspending Buffer重懸,重復(fù)以上步驟進(jìn)行超聲處理；離心獲取上清液，沉淀可再進(jìn)行超聲破碎或進(jìn)行再次重復(fù)；
[0034](5)重力柱純化或者Akta蛋白純化:
[0035]所用的填料為Dextrin Sepharose HP,
[0036]輕柔、充分翻轉(zhuǎn)搖勻填料懸濁液，用寬嘴槍頭吸取樹(shù)脂漿，待樹(shù)脂完全沉降，打開(kāi)層析柱下方旋鈕，當(dāng)儲(chǔ)存緩沖液即20%乙醇液面降到柱床上沿以下時(shí)，用5倍樹(shù)脂體積的ddH20洗樹(shù)脂,然后再用5倍樹(shù)脂體積Binding Buffer平衡樹(shù)脂；
[0037]待Binding Buffer流到柱床上沿以下,加入制備好的蛋白抽提液；將流速控制在每小時(shí)10倍柱體積；重復(fù)吸附一次，收集穿過(guò)組分并置于冰上；
[0038]用5倍樹(shù)脂體積Binding Buffer洗柱,收集穿過(guò)組分并置于冰上；
[0039]用8倍樹(shù)脂體積Elution Buffer洗脫目的蛋白，收集洗脫組分置于冰上；
[0040]所述收集的穿過(guò)組分和洗脫組分即為純化后的MBP-NGF重組蛋白；[0041]所述Binding Buffer 為 20mM Tris-HCl; 50mM NaCl; ImM CaCl2; ρΗ6.5、ElutionBuffer 為 20mM Tris-HCl; 50mM NaCl; ImM CaCl2; IOmM Maltose ；pH6.5 ;均用 ddH20 配置Binding Buffer、Elution Buffer, 0.22 μ m 過(guò)濾器過(guò)濾除菌。
[0042]最后還包括用5倍樹(shù)脂體積的ddH20洗樹(shù)脂，3倍樹(shù)脂體積的0.5M NaOH洗樹(shù)脂，5倍樹(shù)脂體積的ddH20洗樹(shù)脂，5倍樹(shù)脂體積的20%乙醇洗樹(shù)脂，最后注入等體積20%乙醇，樹(shù)脂即可長(zhǎng)期保存于4°C。
[0043]所述6)獲得野生型β-hNGF為利用Factor Xa Protease或腸激酶或GenenaseI切割MBP-NGF，再用Xa Removal Resin吸附去除殘留的Factor Xa ;切割下來(lái)的MBP標(biāo)簽和未切割的MBP-NGF融合蛋白利用Dextrin Sepharose HP吸附。
[0044]采用本發(fā)明的制備方法制備得到的目的蛋白表達(dá)量高、易于純化，基因表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)切割和二次純化后獲得完全不帶額外氨基酸殘基的純天然野生型的目的蛋白，克服了傳統(tǒng)方法(基因插入多克隆位點(diǎn)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)限制性酶酶切后，獲得帶有至少I(mǎi)個(gè)額外的氨基酸殘基的目的蛋白)表達(dá)所獲得的目的蛋白不是野生型的難題。
[0045]本發(fā)明提供一種通過(guò)對(duì)目的蛋白N端密碼子修飾或在基因N端添加蛋白特異性?xún)?nèi)切酶識(shí)別序列的編碼堿基，連接高效可溶表達(dá)載體，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)特異性酶切割去除標(biāo)簽獲得野生型目的蛋白的方法。
[0046]方式1:對(duì)目的蛋白N端密碼子修飾
[0047]上游引物5’端引入XmnI酶切識(shí)別位點(diǎn)序列GAA GGNN TTC (XmnI識(shí)別位點(diǎn)GAANNNN TTC, N表示任何堿基)，下游引物5’端引入多克隆位點(diǎn)上其他任意酶切識(shí)別位點(diǎn)，同時(shí)下游引物的反義鏈3’端必須帶有終止密碼子。
[0048]插入pMAL-c2X或pMAL_p2X (或類(lèi)似的，具備類(lèi)似XmnI酶切識(shí)別位點(diǎn)(GGA GGNNTTC, N表示任何堿基，下同)和表達(dá)產(chǎn)物可被類(lèi)似Factor Xa這樣的識(shí)別特異性位點(diǎn)的內(nèi)切酶酶切的載體)。
[0049]克隆成功后的目的基因表達(dá)載體序列含有如下信息:
[0050]malE…ATC GAG GGA AGG NNT TC...(目的基因序列)TGA…IacZa
[0051]該載體的表達(dá)產(chǎn)物帶有ATC-GAG-GGA-AGG的編碼的Ile-Glu-Gly-Arg氨基酸殘基，可被Factor Xa識(shí)別并切割，從而獲得以NNTTC為開(kāi)頭的基因編碼的天然野生型目的蛋白。
[0052]必須同時(shí)符合以下條件的蛋白，適合利用該方法中的該方式(引入XmnI酶切識(shí)別位點(diǎn)和插入pMAL-c2X或pMAL-p2X載體)制備野生型的重組蛋白:
[0053]第一，目的蛋白編碼基因內(nèi)部沒(méi)有XmnI酶切識(shí)別位點(diǎn)；
[0054]若有識(shí)別位點(diǎn)(GAA NNNN TTC)，則可在不改變氨基酸的基礎(chǔ)上突變GAATTC這六個(gè)堿基中的一個(gè)或一個(gè)以上，繼續(xù)使用該方法。
[0055]第二，目的蛋白的N端前兩個(gè)氨基酸是NNT TCN的編碼產(chǎn)物。
[0056]符合這個(gè)條件的目的蛋白的前兩個(gè)氨基酸可以是PheSer (編碼堿基TTTTCN，下同)，SerSer(TCTTCN, AGTTCN)，TyrSer(TATTCN)，CysSer(TGTTCN)，LeuSer(CTTTCN)，ProSer(CCTTCN), HisSer(CATTCN)， ArgSer(CGTTCN), IleSer(ATTTCN), ThrSer(ACTTCN),AsnSer(AATTCN)，ValSer(GTTTCN)，AlaSer(GCTTCN)，AspSer(GATTCN)，GlySer (GGTTCN)。
[0057]上述的是將目的基因連接pMAL_c2X或pMAL_p2X，重組表達(dá)后直接獲得可溶性野生型目的蛋白的方式之一。
[0058]同樣的，可以利用以下方式獲得可溶性野生型目的蛋白:
[0059]DN端前兩個(gè)氨基酸是ValPro (編碼堿基GTNCCN)的目的蛋白插入pMAL_c2E或pMAL-p2E,表達(dá)后的高度可溶的MBP融合蛋白經(jīng)腸激酶切除MBP標(biāo)簽后，獲得野生型目的蛋白。
[0060]2)N端第一個(gè)氨基酸是Val(編碼堿基GTN)的目的蛋白插入pMAL_c2G或pMAL_p2G，表達(dá)后的高度可溶的MBP融合蛋白經(jīng)Genenase I切除MBP標(biāo)簽后，獲得野生型目的蛋白。
[0061]3)N端前兩個(gè)氨基酸是GlySer (編碼堿基GGNTCN，GGNAGT，GGNAGC)的目的蛋白插入pGEX-4T-l或PGEX-4T-2，表達(dá)后的高度可溶的GST融合蛋白經(jīng)凝血酶切除GST標(biāo)簽后，獲得野生型目的蛋白。
[0062]pMAL-c2X, pMAL-p2X, pMAL_c2E, pMAL-p2E, pMAL-c2G, pMAL-p2G, pGEX_4T_l，pGEX-4T-2的多克隆位點(diǎn)序列見(jiàn)圖1和圖2。
[0063]方式2:在基因N端添加蛋白特異性?xún)?nèi)切酶識(shí)別序列的編碼堿基
[0064]I)通過(guò)人工合成或在上游引物中引入Ile-Glu-Gly-Arg的編碼堿基，插入pMAL_c2X, pMAL-p2X, pMAL-c2E, pMAL-p2E, pMAL-c2G, pMAL-p2G, pGEX_4T_l，pGEX_4T_2 任意一個(gè)載體的多克隆位點(diǎn)，表達(dá)產(chǎn)物用Factor Xa切割獲得野生型目的蛋白。
[0065]2)通過(guò)人工 合成或在上游引物中引入Asp-Asp-Asp-Asp-Lys的編碼堿基，插入上述任意一個(gè)載體，表達(dá)產(chǎn)物用腸激酶切割獲得野生型目的蛋白。
[0066]3)通過(guò)人工合成或在上游引物中引入Pro-Gly-Ala-Ala-His-Tyr的編碼堿基，插入上述任意一個(gè)載體，表達(dá)產(chǎn)物用Genenase I切割獲得野生型目的蛋白。
【【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】】
[0067]圖1 為載體 pMAL-c2X, pMAL-p2X、pMAL_c2E，pMAL-p2E, pMAL-c2G, pMAL-p2G 的多克隆位點(diǎn)圖。
[0068]圖2為載體pGEX-4T-l，pGEX_4T_2的多克隆位點(diǎn)圖。
[0069]圖3為制備野生型hNGF的技術(shù)流程圖。
[0070]圖4為hNGF-F/R擴(kuò)增NGF基因凝膠電泳檢測(cè)圖。
[0071 ] 圖5為表達(dá)載體和hNGF雙酶切凝膠檢測(cè)圖。
[0072]圖6為菌液PCR檢測(cè)陽(yáng)性克隆電泳圖。
[0073]圖7為SDS-PAGE檢測(cè)NGF的表達(dá)、純化、MBP的切除圖。
[0074]圖8為SDS-PAGE檢測(cè)hNGF單體圖。
[0075]圖9為雞胚背根神經(jīng)節(jié)培養(yǎng)鑒定hNGF的結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0076]下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例，所述實(shí)施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類(lèi)似的標(biāo)號(hào)表示相同或類(lèi)似的元件或具有相同或類(lèi)似功能的元件。下面通過(guò)參考附圖描述的實(shí)施例是示例性的，旨在用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。[0077]以下引物合成、序列合成和序列測(cè)序均為Invitrogen公司。
[0078]實(shí)施例1:可溶性高效原核表達(dá)野生型β -hNGF
[0079]技術(shù)流程如下:
[0080]上游引物5’端引入XmnI酶切識(shí)別位點(diǎn)序列GAAGGAGTTC，下游引物引入HindIII酶切位點(diǎn)，利用該對(duì)引物擴(kuò)增β -hNGF成熟肽編碼序列；雙酶切PCR產(chǎn)物和pMAL-c2X載體并回收；T4連接酶連接載體和NGF序列，轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌株并進(jìn)行鑒定；IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，麥芽糖蛋白親和層析純化獲得MBP-NGF重組蛋白factor Xa切除MBP標(biāo)簽蛋白，獲得野生型β-hNGF。整個(gè)技術(shù)流程圖見(jiàn)圖3。
[0081]1.NGF基因的擴(kuò)增
[0082]采用TRIzol法從人胎盤(pán)組織中(廈門(mén)市婦幼保健院)提取總RNA，RT-PCR反應(yīng)生成cDNA。利用hNGF-F和hNGF-R上下游引物擴(kuò)增NGF成熟肽編碼基因。hNGF_F和hNGF-R上下游引物序列如下:
[0083]hNGF-F:AGGGAAGGAGTTCATCCCATCCCATCTTCCAC (單下劃線(xiàn)為 XmnI 酶切位點(diǎn))(SEQID NO:1)
[0084]hNGF-R:CCAAGCTT TC4 TCTCACAGCCTTCCTGCTGAG (單下劃線(xiàn)為酶切位點(diǎn)，
雙下劃線(xiàn)的TCA反義鏈為T(mén)GA終止密碼子)(SEQ ID Ν0:2)
[0085]反應(yīng)條件為:95°C 2min
[0086](94°C，30s; 51。。，30s; 72。。，lmin) 32 個(gè)循環(huán)
[0087]72 °C IOmin
[0088]hNGF-F/R擴(kuò)增NGF基因序列的電泳結(jié)果見(jiàn)圖4。其中泳道1、2、3、4為4個(gè)重復(fù)，從圖中可以看出，其片段大小符合預(yù)期。
[0089]2.PMAL-c2X-hNGF表達(dá)載體和表達(dá)工程菌的構(gòu)建
[0090]2.1 構(gòu)建 pMAL-c2X_hNGF 表達(dá)載體
[0091]利用XmnI和HindIII(兩種酶購(gòu)于Fermentas)雙酶切上述的PCR產(chǎn)物和pMAL_c2X載體(購(gòu)于NEB)并膠回收；T4連接酶連接酶切后的載體和PCR產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a菌株(購(gòu)于Novagen)并進(jìn)行菌液PCR鑒定正確后，測(cè)序驗(yàn)證其序列正確性，正確的為重組載體pMAL-c2X-hNGF。表達(dá)載體和NGF雙酶切結(jié)果見(jiàn)圖5，菌液PCR檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖6。其中圖5的泳道I為hNGF酶切前(對(duì)照)，泳道2為hNGF酶切后樣品，泳道3為pMAL-c2X_hNGF酶切前(對(duì)照)，泳道4為PMAL-c2X-hNGF酶切后樣品；圖6的泳道1、2、3、4為4個(gè)重復(fù)，大小符合預(yù)期；
[0092]經(jīng)測(cè)序鑒定正確的β -hNGF成熟肽編碼序列為SEQ ID NO: 3及對(duì)應(yīng)的氨基酸序列為SEQ ID N0:4。人為改變了第一個(gè)氨基酸編碼堿基(TCA — AGT)，但不改變其氨基酸。均為絲氨酸(Ser)。
[0093]2.2陽(yáng)性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株
[0094]提取鑒定正確的重組載體pMAL-c2X_hNGF的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21 (DE3)(或BL21(DE3)pLysS)表達(dá)菌株中。具體方法如下:
[0095](1)取100 μ L冰浴上融化的感受態(tài)細(xì)胞，加入0.5 μ L重組質(zhì)粒，輕輕混合，在冰浴中放置30min ；
[0096](2) 42°C水浴中熱激60s，然后迅速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中2_3min ；[0097](3)向管中加入500 μ L無(wú)菌的不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，混勻后置于37°C，200rpm條件下振蕩培養(yǎng)lh，使細(xì)菌復(fù)蘇；
[0098](4)取150 μ L涂布在含有Amp的LB固體平板上，在37 °C恒溫箱中倒置培養(yǎng)過(guò)夜。
2.3表達(dá)工程菌保存
[0099](I)挑取單菌落接種于250mL培養(yǎng)瓶帶有50mL液體LB培養(yǎng)基(含50 μ g/mL Amp)中；
[0100](2)37°C，250rpm條件下振蕩培養(yǎng)至0D600=(X 6-(X 8 (同時(shí)對(duì)多個(gè)菌落進(jìn)行培養(yǎng)，選擇生長(zhǎng)速度最快的保存甘油菌)；
[0101](3)取920 μ L移至冷凍管，加入80 μ L甘油；
[0102](4)充分混勻，于液氮中快速冷凍，保存于_80°C。
[0103]3.NGF的可溶性重組表達(dá)和親和層析純化
[0104]3.1誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白
[0105](I)用滅菌接菌環(huán)刮取_80°C凍存的甘油菌，劃線(xiàn)于瓊脂板上，在37°C恒溫箱中倒置培養(yǎng)過(guò)夜，活化菌株；
[0106](2)挑取單菌落接種于20mL液體LB培養(yǎng)基(含50 μ g/mL Amp)中，37°C，300rpm條件下振蕩培養(yǎng)約10_12h ；
[0107](3)按1:50的比例轉(zhuǎn)接于新鮮的液體LB培養(yǎng)基中，37°C，300rpm條件下振蕩培養(yǎng)至 OD600 ^ 0.8 (約 2.0-2.5hr)；
[0108](4)立即加入IPTG至終濃度為0.1mM，在另一恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，25°C，180rpm (提前設(shè)置好)條件下振蕩培養(yǎng)10h-12h誘導(dǎo)表達(dá)，得到MBP-hNGF融合蛋白。
[0109]3.2MBP-hNGF融合蛋白純化
[0110](I) 4°C,3000rpm離心10min,收集目的蛋白表達(dá)菌體；
[0111](2)分另丨」用 10mT, Resuspending Buffer (20mM Tris-HCl; 50mM NaCl; ImMCaCl2; ImM DTT ；pH6.5)重懸200ml LB培養(yǎng)的浙干菌體，在冰水浴中進(jìn)行超聲波破碎，超聲破碎條件:25%脈沖(功率200w) IOmin,開(kāi)Is關(guān)2s ;
[0112](3)4°C,12000rpm離心20min沉淀不溶物；緩慢吸取上清液，0.45 μ m濾膜過(guò)濾后移至新離心管中，置冰上待純化。純化步驟參照PROTOCOL進(jìn)行。重力柱純化步驟見(jiàn)3.3;
[0113](4)不溶物再用Resuspending Buffer重懸,重復(fù)以上步驟進(jìn)行超聲處理。離心獲取上清液，沉淀可再進(jìn)行超聲破碎或進(jìn)行包涵體相關(guān)步驟的處理；
[0114](5) SDS-PAGE分析超聲破碎后的上清和沉淀樣品。
[0115]3.3重力柱純化步驟
[0116]純化MBP 重組蛋白所用的填料為 Dextrin Sepharose HP(GE,貨號(hào):28-9355-97)，大量處理樣品時(shí)采用Akta蛋白純化系統(tǒng)操作。利用重力柱可以小量快速純化所需的樣品，具體步驟如下:
[0117](I)用 ddH20配置Binding BufferC20mM Tris-HCl; 50mM NaCl; ImM CaCl2; ρΗ6.5)、Elution Buffer (20mM Tris-HCl;50mM NaCl;ImM CaCl2;IOmM Maltose ；pH6.5),0.22 μ m過(guò)濾器過(guò)濾除菌；
[0118](2)輕柔、充分翻轉(zhuǎn)搖勻Dextrin Sepharose HP填料懸池液,用寬嘴槍頭吸取樹(shù)脂漿。為了避免出現(xiàn)氣泡，往柱子中添加樹(shù)脂時(shí)將吸頭尖端始終置于柱子液面以下；[0119](3)待樹(shù)脂完全沉降，打開(kāi)層析柱下方旋鈕，當(dāng)儲(chǔ)存緩沖液(20%乙醇)液面降到柱床上沿以下時(shí)，用5倍樹(shù)脂體積的ddH20洗樹(shù)脂，然后再用5倍樹(shù)脂體積Binding Buffer平衡樹(shù)脂；
[0120](4)待Binding Buffer流到柱床上沿以下,加入制備好的蛋白抽提液。將流速控制在每小時(shí)10倍柱體積為宜。如果流速過(guò)快，洗脫的目的蛋白中會(huì)混入較多的雜質(zhì)。重復(fù)吸附一次，收集穿過(guò)組分并置于冰上；
[0121](5)用5倍樹(shù)脂體積Binding Buffer洗柱,收集穿過(guò)組分并置于冰上；
[0122](6)用8倍樹(shù)脂體積Elution Buffer洗脫目的蛋白，收集洗脫組分置于冰上待后續(xù)分析；將純化產(chǎn)物保存于_80°C ；
[0123](7 )用5倍樹(shù)脂體積的ddH20洗樹(shù)脂，3倍樹(shù)脂體積的0.5M NaOH洗樹(shù)脂，5倍樹(shù)脂體積的ddH20洗樹(shù)脂，5倍樹(shù)脂體積的20%乙醇洗樹(shù)脂，最后注入等體積20%乙醇，樹(shù)脂即可長(zhǎng)期保存于4°C ；
[0124](8) SDS-PAGE分析各組分，結(jié)果見(jiàn)圖7。其中泳道I為恩經(jīng)復(fù)原液，泳道2為菌體超聲破碎后的上清，泳道3為菌體超聲破碎后的沉淀，泳道4為上清液過(guò)完重力柱的流穿液，泳道5為緩沖液沖洗柱的樣品，泳道6為洗脫的目的融合蛋白，泳道7為利用Factor Xa酶切MBP-NGF后的樣品；MBP標(biāo)簽大小約43KDa，hNGF大小約為13KDa，MBP-hNGF融合蛋白大小約為56KDa，圖中所示結(jié)果與之相符合。
[0125]4.MBP親和標(biāo)簽的去除
[0126]利用Factor Xa Protease (QIAGEN，貨號(hào):33223)切割 MBP-NGF，按 protocol 進(jìn)行操作。切割效果見(jiàn)圖7泳道7 ;利用Xa Removal Resin(QIAGEN，貨號(hào):33213)吸附去除殘留的Factor Xa ;切割下來(lái)的MBP標(biāo)簽和未切割的MBP-NGF融合蛋白利用Dextrin SepharoseHP (GE,貨號(hào):28-9355-97)吸附；以上操作后可獲得高純度的β-rhNGF。SDS-PAGE檢測(cè)去除標(biāo)簽效果，結(jié)果見(jiàn)圖8。從圖8中可以看出，純化效果特別好，沒(méi)有雜質(zhì)。
[0127]純化獲得rhNGF的得率約為50%，純度可達(dá)99%。
[0128]5.β-rhNGF生物學(xué)活性檢測(cè)
[0129]細(xì)胞培養(yǎng)板用無(wú)菌L-多聚賴(lài)氨酸包被，取9d齡雞胚(白殼蛋雞)，顯微解剖鏡下，剝離背根神經(jīng)節(jié)，分散接種在無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基中，實(shí)驗(yàn)組中加入純化的β -hNGF, 37°C培養(yǎng)48h，倒置顯微鏡下觀察突起生長(zhǎng)。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖9，以7ng的恩經(jīng)復(fù)(mNGF)原液為對(duì)照(廈門(mén)北大之路生物工程有限公司上市產(chǎn)品)；hNGF為7ng純化的β -hNGF。從圖7可以看出:添加純化的β-hNGF的處理的背根神經(jīng)節(jié)四周長(zhǎng)出了放射狀的神經(jīng)纖維，生長(zhǎng)狀況與mNGF相當(dāng)，表明利用本方案表達(dá)、純化獲得的β -hNGF與恩經(jīng)復(fù)具有相當(dāng)?shù)纳锘钚浴?br> [0130]盡管上面已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，可以理解的是，上述實(shí)施例是示例性的，不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以對(duì)上述實(shí)施例進(jìn)行變化、修改、替換和變型。
【權(quán)利要求】
1.一種野生型β-hNGF的制備方法，其特征在于，包括如下步驟， 1)hNGF片段獲取: PCR擴(kuò)增:上游引物5 ’端引入XmnI酶切識(shí)別位點(diǎn)序列GAAGGAGTTC，下游引物引入多克隆位點(diǎn)上其他任意酶切識(shí)別位點(diǎn)，同時(shí)下游引物的反義鏈3’端必須帶有終止密碼子；利用該對(duì)引物擴(kuò)增β-hNGF成熟肽編碼序列；或 通過(guò)人工合成或在上游引物中引入Ile-Glu-Gly-Arg或Asp-Asp-Asp-Asp-Lys或Pro-Gly-Ala-Ala-His-Tyr的編碼堿基進(jìn)行擴(kuò)增； 2)酶切:分別雙酶切PCR產(chǎn)物和載體并回收；所述載體帶有類(lèi)似XmnI酶切識(shí)別位點(diǎn)或表達(dá)產(chǎn)物可被Factor Xa的內(nèi)切酶酶切的載體； 3)連接:T4連接酶連接載體和雙酶切后的PCR產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌株并進(jìn)行鑒定; 4)誘導(dǎo)表達(dá):IPTG誘導(dǎo)表達(dá)； 5)親和層析純化:麥芽糖蛋白親和層析純化獲得MBP-NGF重組蛋白； 6)獲得野生型β-hNGF =Factor Xa或腸激酶或Genenase I切除MBP標(biāo)簽蛋白，獲得野生型β -hNGF。
2.權(quán)利要求1所述野生型β-hNGF的制備方法，其特征在于，所述I)步驟中的PCR擴(kuò)增，上游引物序列為SEQ ID NO:1，下游引物序列為SEQ ID NO: 2，下游引物帶HindIII酶切位點(diǎn)。
3.權(quán)利要求1所述野生型β-hNGF的制備方法，其特征在于，所述2)酶切中，所述載體為 pMAL-c2X，pMAL-p2X, pMAL-c2E, pMAL-p2E, pMAL-c2G, pMAL-p2G, pGEX_4T_l 或PGEX-4T-2。
4.權(quán)利要求1所述野生型β-hNGF的制備方法，其特征在于，所述5)親和層析純化為: (1)低溫離心收集目的蛋白表達(dá)菌體； (2)用ResuspendingBuffer重懸菌體，在冰水浴中進(jìn)行超聲波破碎，所述Resuspending Buffer 為 20mM Tris-HCl;50mM NaCl;ImM CaCl2; ImM DTT ;ρΗ6.5 ； (3)低溫離心，緩慢吸取上清液，濾膜過(guò)濾后移至新離心管中，置冰上待純化； (4)不溶物再用ResuspendingBuffer重懸,重復(fù)以上步驟進(jìn)行超聲處理；離心獲取上清液，沉淀可再進(jìn)行超聲破碎或進(jìn)行再次重復(fù)； (5)重力柱純化或者Akta蛋白純化: 所用的填料為 Dextrin Sepharose HP, 輕柔、充分翻轉(zhuǎn)搖勻填料懸濁液，用寬嘴槍頭吸取樹(shù)脂漿，待樹(shù)脂完全沉降，打開(kāi)層析柱下方旋鈕，當(dāng)儲(chǔ)存緩沖液即20%乙醇液面降到柱床上沿以下時(shí)，用5倍樹(shù)脂體積的ddH20洗樹(shù)脂，然后再用5倍樹(shù)脂體積Binding Buffer平衡樹(shù)脂； 待Binding Buffer流到柱床上沿以下,加入制備好的蛋白抽提液；將流速控制在每小時(shí)10倍柱體積；重復(fù)吸附一次，收集穿過(guò)組分并置于冰上； 用5倍樹(shù)脂體積Binding Buffer洗柱,收集穿過(guò)組分并置于冰上； 用8倍樹(shù)脂體積Elution Buffer洗脫目的蛋白，收集洗脫組分置于冰上； 所述收集穿過(guò)組分即為純化后的MBP-NGF重組蛋白；
所述Binding Buffer 為 20mM Tris-HCl; 50mM NaCl; ImM CaCl2; ρΗ6.5、Elution Buffer為 20mM Tris-HCl ;50mM NaCl; ImM CaCl2; IOmM Maltose ;pH6.5 ;均用 ddH20 配置 BindingBuffer> Elution Buffer, 0.22 μ m 過(guò)濾器過(guò)濾除菌。
5.權(quán)利要求1所述野生型β-hNGF的制備方法，其特征在于，所述5)親和層析純化為: (1)低溫離心收集目的蛋白表達(dá)菌體； (2)用IOmLResuspending Buffer重懸200ml LB培養(yǎng)的浙干菌體,在冰水浴中進(jìn)行超聲波破碎，超聲破碎條件:25%脈沖，功率200w, IOmin,開(kāi)Is關(guān)2s ;所述ResuspendingBuffer 為 20mM Tris-HCl;50mM NaCl;ImM CaCl2; ImM DTT ；pH6.5 ； (3)4°C，12000rpm離心20min沉淀不溶物；緩慢吸取上清液，0.45 μ m濾膜過(guò)濾后移至新離心管中，置冰上待純化； (4)不溶物再用ResuspendingBuffer重懸,重復(fù)以上步驟進(jìn)行超聲處理；離心獲取上清液，沉淀可再進(jìn)行超聲破碎或進(jìn)行再次重復(fù)； (5)重力柱純化或者Akta蛋白純化: 所用的填料為 Dextrin Sepharose HP, 輕柔、充分翻轉(zhuǎn)搖勻填料懸濁液，用寬嘴槍頭吸取樹(shù)脂漿，待樹(shù)脂完全沉降，打開(kāi)層析柱下方旋鈕，當(dāng)儲(chǔ)存緩沖液即20%乙醇液面降到柱床上沿以下時(shí)，用5倍樹(shù)脂體積的ddH20洗樹(shù)脂，然后再用5倍樹(shù)脂體積Binding Buffer平衡樹(shù)脂； 待Binding Buffer流到柱床上沿以下,加入制備好的蛋白抽提液；將流速控制在每小時(shí)10倍柱體積；重復(fù)吸附一次，收集穿過(guò)組分并置于冰上； 用5倍樹(shù)脂體積Binding Buffer洗柱,收集穿過(guò)組分并置于冰上；` 用8倍樹(shù)脂體積Elution Buffer洗脫目的蛋白，收集洗脫組分置于冰上； 所述收集的穿過(guò)組分和洗脫組分即為純化后的MBP-NGF重組蛋白；
所述Binding Buffer 為 20mM Tris-HCl; 50mM NaCl; ImM CaCl2; ρΗ6.5、Elution Buffer為 20mM Tris-HCl ;50mM NaCl; ImM CaCl2; IOmM Maltose ;pH6.5 ;均用 ddH20 配置 BindingBuffer> Elution Buffer, 0.22 μ m 過(guò)濾器過(guò)濾除菌。
6.權(quán)利要求4或5所述野生型β-hNGF的制備方法，其特征在于，最后還包括用5倍樹(shù)脂體積的ddH20洗樹(shù)脂，3倍樹(shù)脂體積的0.5M NaOH洗樹(shù)脂，5倍樹(shù)脂體積的ddH20洗樹(shù)脂，5倍樹(shù)脂體積的20%乙醇洗樹(shù)脂，最后注入等體積20%乙醇，樹(shù)脂即可長(zhǎng)期保存于4°C。
7.權(quán)利要求1所述野生型β-hNGF的制備方法，其特征在于，所述6)獲得野生型β -hNGF 為利用 Factor Xa Protease 或腸激酶或 Genenase I 切割 MBP-NGF,再用 XaRemoval Resin吸附去除殘留的Factor Xa ;切割下來(lái)的MBP標(biāo)簽和未切割的MBP-NGF融合蛋白利用 Dextrin Sepharose HP 吸附。
【文檔編號(hào)】C07K14/48GK103880944SQ201410024634
【公開(kāi)日】2014年6月25日 申請(qǐng)日期:2014年1月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月20日
【發(fā)明者】張文宇, 章永壘, 陳星 , 白羊, 黃奮飛, 陳勝亮, 阮卡 申請(qǐng)人:廈門(mén)北大之路生物工程有限公司