一種金屬螯合肽的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種利用復(fù)合蛋白酶及風(fēng)味蛋白酶酶解乳清蛋白制備金屬（Ca、Fe、Zn）螯合肽，以乳清蛋白為原料，通過復(fù)合蛋白酶及風(fēng)味蛋白酶酶解，再經(jīng)過分離純化得到純化的特異性金屬（Ca、Fe、Zn）螯合肽，氨基酸序列為：fd。本發(fā)明制備的金屬螯合肽可用于生產(chǎn)新型的金屬補充劑—肽螯合鈣、肽螯合鐵、肽螯合鋅，其具有獨特的螯合體制和轉(zhuǎn)運機制，易被吸收、安全無毒、價格低、可同時補充氨基酸和金屬離子，必將成為鈣、鐵、鋅補充劑的首選。本發(fā)明為乳清蛋白的應(yīng)用提供了一條新思路。
【專利說明】一種金屬螯合肽的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種金屬(Ca、Fe、Zn)螯合肽，更具體地涉及了一種利用復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶酶解乳清蛋白制備的金屬螯合肽，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著乳源活性肽研究與產(chǎn)品開發(fā)的興起，發(fā)現(xiàn)乳清蛋白中含有具有免疫調(diào)節(jié)、降血壓、降血糖、降膽固醇、抗氧化、抗菌和抗病毒等生物活性的潛在肽段。乳清蛋白源生物活性肽具有極高的營養(yǎng)價值、食用安全性及生理保健功能，在促進機體的生長、發(fā)育和疾病防治等方面都起著重要的作用，可作為功能性食品或食品添加劑乃至藥品應(yīng)用到人們?nèi)粘Ｉ钪小?br> [0003]目前，鈣質(zhì)缺乏是全球性的營養(yǎng)問題，我國人民由于以植物性膳食為主，缺鈣的現(xiàn)象更加嚴重，因此補鈣成為我國膳食營養(yǎng)研究中的重要課題。傳統(tǒng)的無機鈣鹽，如碳酸鈣、磷酸鈣、氯化鈣等，對維生素有一定破壞作用，生物學(xué)效價較低；有機鈣鹽，如檸檬酸鈣、乳酸鈣、葡萄糖鈣等，雖然鈣吸收率有所提高，但其溶解度大易溶失，且價格高。研究表明，多肽螯合鈣由于其獨特的螯合體制和轉(zhuǎn)運機制，易被吸收、安全無毒、價格低、可同時補充氨基酸和鈣，而成為補鈣首選。
[0004]微量元素鐵對人類健康特別是對嬰幼兒和兒童的生長發(fā)育有重要作用。雖然大分子蛋白質(zhì)也可以與鐵離子結(jié)合，但這些大分子蛋白質(zhì)本身也存在相對分子質(zhì)量較大而很難通過腸黏膜的問題。而研究發(fā)現(xiàn)，氨基酸、多肽螯合鐵可以大大提高鐵離子的吸收率。
[0005]盡管自然界中鋅源十分豐富，但鋅在人體內(nèi)的吸收代謝受種種因素的限制，鋅缺乏已成為我國及許多發(fā)展中 國家的公共衛(wèi)生問題。研究發(fā)現(xiàn)氨基酸和小肽具有促進鋅吸收的作用，而且氨基酸或肽的金屬復(fù)合體如Fe、Zn的生物學(xué)利用率比無機鹽高且無毒副作用。因此，研究開發(fā)這種生物態(tài)鋅-蛋白酶解物螯合鋅，具有十分重要的意義。
[0006]因此，如何獲得具有金屬螯合活性的肽，就成為制備新型金屬元素補充劑迫切的研究方向。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種利用復(fù)合蛋白酶及風(fēng)味蛋白酶酶解乳清蛋白制備的金屬螯合肽,使金屬(Ca、Fe、Zn )螯合活性得以高效地實現(xiàn)。
[0008]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
一種金屬螯合肽，是由2個氨基酸所構(gòu)成的二肽，所述肽的氨基酸序列為:fd。
[0009]所述的金屬為Ca、Fe或Zn。
[0010]一種金屬螯合肽的制備方法，以乳清蛋白為原料，采用復(fù)合蛋白酶及風(fēng)味蛋白酶復(fù)配對其進行酶解，分離純化、冷凍干燥得到金屬螯合肽。
[0011]所述酶解條件為:底物濃度5%，酶解pH為7.0、溫度49°C、酶解時間為7小時、酶-底物重量配比為1:25。[0012]所述酶為復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶，兩種酶的重量復(fù)配比為復(fù)合蛋白酶:風(fēng)味蛋白酶=2:1。
[0013]所述分離純化的具體步驟為:酶解產(chǎn)物首先利用TOYOPEARL DEAE-650M陰離子交換色譜進行分離，洗脫液為濃度梯度為含有0-0.5 M NaCl的0.02 mol/L pH 9.0的磷酸緩沖液，流速為0.5 mL/min，洗脫峰在214 nm下進行測量；收集具有最高金屬螯合活性的峰，再用Sephadex G-25凝膠過濾色譜進行分離,洗脫液為去離子水,流速為0.3 mL/min,洗脫峰在214 nm下進行測定；收集具有最高金屬螯合活性的峰，利用半制備RP-HPLC-C18反相高效液相色譜再進行進一步分離，分離條件是用體積比0-30%乙腈溶液作為洗脫液梯度洗脫，流速為4 mL/min，收集具有最高金屬螯合活性的洗脫峰，再利用分析型RP-HPLC-C18反相高效液相色譜再進行進一步分離，洗脫液為體積比0-10%乙腈溶液，流速為I mL/min，收集洗脫峰，再采用LC/MS液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜儀分析得出洗脫峰處為所述金屬螯合肽。
[0014]本發(fā)明立足于多肽具備與金屬離子螯合的作用位點，能夠與其形成穩(wěn)定的化合物，且多肽-金屬螯合物具有獨特的螯合體制和轉(zhuǎn)運機制，易被吸收、可同時補充氨基酸和金屬的理論基礎(chǔ)，以來自于乳清的乳清蛋白為原材料，通過復(fù)合蛋白酶及風(fēng)味蛋白酶的切割條件控制，切割制備具有高金屬(Ca、Fe、Zn)螯合活性的肽，而使金屬螯合活性得以高效地實現(xiàn)。本發(fā)明為乳清蛋白的應(yīng)用提供了一條新思路。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1純化乳清蛋白源金屬螯合肽的LC/MS微陣列圖。
【具體實施方式】
[0016]實施例1
本技術(shù)所采用的乳清蛋白(WPC 80)，購買于HILMAR公司(美國?德克薩斯)，酶購自諾維信生物技術(shù)有限公司(中國?天津)。采用單因素實驗，分別對四個酶解因素進行考察，分別為底物濃度(1%，3%，5%和7%)、酶解`溫度(40，50，55和60 °C )、酶的復(fù)配比(復(fù)合蛋白酶:風(fēng)味蛋白酶=1:1，1:2，1:3 和 2:1 w/w)，酶-底物配比(1: 100，1:50，1:25 和 1:20 w/w)以及酶解時間(1，3，5，7，9小時)。稱取一定質(zhì)量乳清蛋白溶解于蒸餾水中，然后用2mol/L NaOH將其pH調(diào)節(jié)至7.0。先將該溶液水浴加熱到需要溫度，接著再按不同的酶-底物配比加入相應(yīng)量的酶，按照預(yù)定的反應(yīng)時間開始反應(yīng)。接著再在沸水浴中滅酶10分鐘，冷卻后再1000Orpm離心10分鐘。上清液收集后，分別對金屬(Ca、Fe、Zn)螯合活性進行測定，以確定最佳酶解條件。得到具有最大金屬螯合活性的酶解液的酶解條件是:底物濃度5%，酶解pH為7.0、溫度49°C、酶解時間為7小時、酶-底物配比為1:25 (w/w);所述酶為復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶，兩種酶的復(fù)配比為復(fù)合蛋白酶:風(fēng)味蛋白酶=2:1 (w/w)。
[0017]稱取5.0克乳清蛋白溶解于100mL蒸餾水中，然后用2mol/L NaOH將其pH調(diào)節(jié)至
7.0。先將該溶液水浴加熱到49°C，接著再按照酶-底物配比為1:25的比例加入相應(yīng)量的酶，復(fù)合蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶的質(zhì)量比為2:1，酶解時間為7小時。接著在沸水浴中滅酶10分鐘，冷卻后再1000Orpm離心10分鐘，收集上清液備用。
[0018]將上清液用TOYOPEARL DEAE-650M陰離子交換色譜(長50 cm,外徑1.6cm)進行分離，洗脫液為濃度梯度0-0.5M的NaCl的0.02 mol/L pH 9.0的磷酸緩沖液，流速為0.5mL/min,收集各峰樣品并測定金屬(Ca、Fe、Zn)螯合活性。
[0019]對TOYOPEARL DEAE-650M陰離子交換色譜分離的具有最高金屬(Ca、Fe、Zn)螯合活性的洗脫峰再進行下一步的分離，用S印adex G-25凝膠過濾色譜(長100 cm，外徑2.0cm)收集具有最高金屬(Ca、Fe、Zn)螯合活性的峰，利用半制備RP-HPLC-C18反相高效液相色譜再進行進一步分離，洗脫液自含100% (v/v)的水開始，至30%乙腈和70%水(v/v)的混合液結(jié)束，進行梯度洗脫，洗脫時間為50 min,流速為4 mL/min,收集具有最高金屬(Ca、Fe,Zn)螯合活性的峰即保留時間為20.681 min的洗脫峰，再利用分析型RP-HPLC-C18反相高效液相色譜再進行進一步分離，洗脫液為0-10% (v/v)乙腈溶液，流速為I mL/min，收集各峰進行金屬(Ca、Fe、Zn)螯合活力測定，得到保留時間為21.627 min的洗脫峰具有最高金屬(Ca、Fe、Zn)螯合活性，再采用LC/MS液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜儀分析得出保留時間為5.84 min處的峰為所述金屬螯合肽。冷凍干燥得到本發(fā)明的金屬(Ca、Fe、Zn)螯合肽。
[0020]采用鄰-甲酚酞比色法，測定金屬螯合肽對鈣離子的螯合作用。將I mL 5 mmol/L的CaCl2和2 mL 0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH 8.0)加入具塞試管中，再加入I mL清蛋白肽溶液，置于恒溫加熱水浴搖床中37°C溫育2h，取出后10000 r/min常溫離心10 min。取I mL上清液，加入鄰-甲酚酞顯色液5 mL，搖勻。放置10 min后于分光光度計570 nm處測定吸光值，將數(shù)值代入標準曲線中計算出可溶性鈣結(jié)合量。
[0021]標準曲線的制作:分別取標準Ca工作液(10 ug/ mL) O,0.2,0.4,0.6,0.8, 1.0mL于10 mL試管中，分別加去離子水1.0，0.8，0.6，0.4，0.2，O mL，加入鄰-甲酚酞顯色液5 mL，搖勻，放置10 min后于分光光度計570 nm處測定吸光值。以可溶性鈣含量(ug/ mL)為橫坐標，吸光值為縱坐標做圖，得標準曲線公式為:y = 0.0974x - 0.0402, R2 = 0.9996。
[0022]本發(fā)明的制備金屬螯合肽的鐵螯合活性測定方法，采用鄰菲羅啉比色法，測定金屬螯合肽對鐵離子的螯合作 用。將0.05 g樣品置于100 mL燒杯中，加入2 mL濃鹽酸，待樣品完全溶解后，用蒸餾水定容至100 mL容量瓶中。準確吸取5 mL樣品液于50 mL容量瓶中，，加入I mol/L的HCl溶液I mL，10%的鹽酸羥胺I mL，0.12%鄰菲羅啉I mL，然后加入10%醋酸鈉5 mL，用水稀釋至刻度，搖勻。以不加鐵的試劑空白溶液作參比液，在510 nm波長處測定吸光度，將數(shù)值代入標準曲線中計算出鐵結(jié)合量。
[0023]標準曲線的制作:吸取10 ug/mL鐵的標準溶液0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL,分別置于50 mL容量瓶中，加入I mol/L的HCl溶液I mL，10%的鹽酸羥胺I mL，0.12%鄰菲羅啉I mL，然后加入10%醋酸鈉5 mL，用水稀釋至刻度，搖勻。以不加鐵的試劑空白溶液作參比液，在510 nm波長處測定吸光度，繪制標準曲線，得標準曲線公式為:y =
0.1717x+0.003，R2 = 0.9994。
[0024]本發(fā)明的制備金屬螯合肽的鋅螯合活性測定方法，采用EDTA滴定法，測定金屬螯合肽對鋅離子的螯合作用。稱量螯合物100 mg于100 mL小燒杯中，加水50 mL,加入6 mol/L鹽酸數(shù)滴。搖勻后于水浴上加熱使之完全溶解,冷卻后定容至100 mL,從中吸取10 mL于三角瓶，平3份，加入NH3-NH4CI緩沖液(pH 10)10 mL，鉻黑T指示劑適量，然后用0.01 mol/L Na2EDTA液滴至藍色；紀錄消耗EDTA的毫升數(shù)，計算螯合物含鋅量。
[0025]應(yīng)用TOYOPEARL DEAE-650M 陰離子交換色譜、Sephadex G-25 分子篩、RP-HPLC 反相高效液相色譜等分離純化手段，實現(xiàn)顯著活性的乳清蛋白金屬螯合肽的高效分離純化。
[0026]利用ESI 質(zhì)譜儀(WATERS MALDI SYNAPT Q-TOF MS, Waters C0.，U.S.A)測定特異性金屬螯合肽的氨基酸全序列。
[0027]純化得到的特異性金屬螯合肽具有很高的金屬(Ca、Fe、Zn)螯合活性，由表1可以看出，與酶解液相比，WPH-4的金屬螯合力有了很大提高。
[0028]表1純化的特異性金屬螯合肽的金屬螯合力
【權(quán)利要求】
1.一種金屬螯合肽，其特征在于:所述肽的氨基酸序列為:fd。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種金屬螯合肽，其特征在于:所述的金屬為Ca、Fe或Zn。
3.—種如權(quán)利要求1所述的一種金屬螯合肽的制備方法，其特征在于:以乳清蛋白為原料，采用復(fù)合蛋白酶及風(fēng)味蛋白酶復(fù)配對其進行酶解，分離純化、冷凍干燥得到金屬螯合肽。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種金屬螯合肽的制備方法，其特征在于:所述酶解條件為:底物濃度5%，酶解pH為7.0、溫度49°C、酶解時間為7小時、酶-底物重量配比為1:25。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種金屬螯合肽的制備方法，其特征在于:所述酶為復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶，兩種酶的重量復(fù)配比為復(fù)合蛋白酶:風(fēng)味蛋白酶=2:1。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種金屬螯合肽的制備方法，其特征在于:所述分離純化的具體步驟為:酶解產(chǎn)物首先利用TOYOPEARL DEAE-650M陰離子交換色譜進行分離，洗脫液為濃度梯度為含有0-0.5 M NaCl的0.02 mol/L pH 9.0的磷酸緩沖液，流速為0.5 mL/min,洗脫峰在214 nm下進行測量；收集具有最高金屬螯合活性的峰，再用Sephadex G-25凝膠過濾色譜進行分離，洗脫液為去離子水，流速為0.3 mL/min，洗脫峰在214 nm下進行測定；收集具有最高金屬螯合活性的峰，利用半制備RP-HPLC-C18反相高效液相色譜再進行進一步分離，分離條件是用體積比0-30%乙腈溶液作為洗脫液梯度洗脫，流速為4 mL/min，收集具有最高金屬螯合活性的洗脫峰，再利用分析型RP-HPLC-C18反相高效液相色譜再進行進一步分離，洗脫液為體積比0-10%乙腈溶液，流速為I mL/min，收集洗脫峰，再采用LC/MS液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜儀分析得出洗脫峰處 為所述金屬螯合肽。
【文檔編號】C07K1/18GK103880920SQ201410078882
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年3月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月6日
【發(fā)明者】汪少蕓, 黃順麗, 趙立娜, 邵彪, 方衛(wèi)東, 廖蘭 申請人:福州大學(xué)