六苯并苯衍生物探針、制備方法及基于六苯并苯衍生物探針與核酸適配體的蛋白質(zhì)檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種六苯并苯衍生物探針、制備方法及基于六苯并苯衍生物探針與核酸適配體的蛋白質(zhì)檢測(cè)方法。解決現(xiàn)有蛋白檢測(cè)方法操作繁瑣，過程復(fù)雜，靈敏度低的問題。該探針為1，2，7，8-四-(4-三甲基胺丁基氧-羰基)-六苯并苯，帶四個(gè)電荷，具有水溶性。本發(fā)明還提供一種六苯并苯衍生物探針的制備方法。本發(fā)明還提供一種基于六苯并苯衍生物探針與核酸適配體的蛋白質(zhì)檢測(cè)方法，本發(fā)明檢測(cè)蛋白質(zhì)的方法是免標(biāo)記的，不需要共價(jià)修飾，簡(jiǎn)單快捷，同時(shí)檢測(cè)給出的是熒光增強(qiáng)的信號(hào)，比起熒光減弱的信號(hào)，靈敏度更高。
【專利說明】六苯并苯衍生物探針、制備方法及基于六苯并苯衍生物探針與核酸適配體的蛋白質(zhì)檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種六苯并苯衍生物探針、制備方法及基于六苯并苯衍生物探針與核酸適配體的蛋白質(zhì)檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]目前醫(yī)學(xué)診斷、生物化學(xué)研究及環(huán)境分析等領(lǐng)域，檢測(cè)蛋白質(zhì)的最普遍的方法是基于抗原-抗體的特異性作用。然而，基于免疫的檢測(cè)方法也有它的缺點(diǎn):抗體的篩選、鑒定、及分離過程依賴于動(dòng)物和細(xì)胞培養(yǎng)，而且檢測(cè)過程需要進(jìn)行抗體的固定、信號(hào)輸出基團(tuán)的修飾，這無疑增加了研究工作的難度和要求，提高了相關(guān)產(chǎn)品的成本。
[0003]核酸適配體是通過一種模擬自然進(jìn)化過程的人工篩選技術(shù)指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(SELEX)，篩選得到的具有高效識(shí)別功能的新型核酸分子。適配體與相應(yīng)的靶物質(zhì)結(jié)合的特異性和親和力可與抗體媲美，而且與抗原抗體相比，核酸適配體還有很多優(yōu)勢(shì):核酸適配體是寡核苷酸，可以通過化學(xué)方法精確地合成，而且方法簡(jiǎn)單，現(xiàn)在人們已經(jīng)可以利用機(jī)器進(jìn)行自動(dòng)化合成，花費(fèi)很低；核酸適配體穩(wěn)定性好，可以長(zhǎng)期放置，而且可以重復(fù)利用。 [0004]HIV-1Tat蛋白是HIV-1編碼的反式轉(zhuǎn)錄激活因子，其主要功能是反式激活HIV-1病毒基因組轉(zhuǎn)錄的起始和延伸，啟動(dòng)病毒復(fù)制。人們已經(jīng)成功的篩選出幾種能與Tat蛋白特異性結(jié)合的核酸適配體(Genes to Cells, 2000，5，371-388)。一些基于Tat蛋白核酸適配體的蛋白質(zhì)檢測(cè)方法已經(jīng)被報(bào)道。如2004年M.Mascini等人利用石英晶體微天平的方法實(shí)現(xiàn)了對(duì) Tat 蛋白的檢測(cè)(Biosensors and Bioelectronics, 2004, 20, 1149-1156)。首先該方法利用生物素與鏈酶親和素之間的相互作用力將核酸適配體修飾在電極的表面，當(dāng)加入Tat蛋白后，核酸適配體會(huì)特異性的與其結(jié)合，導(dǎo)致電極表面的信號(hào)發(fā)生變化，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)Tat蛋白的檢測(cè)。2011年Hiroshi Kawarada等人將Tat蛋白的核酸適配體分成兩個(gè)部分，其中一部分修飾在電極上，另外一部分末端標(biāo)記染料Cy5,當(dāng)加入Tat蛋白后，染料分子被結(jié)合在電極表面，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)Tat蛋白的檢測(cè)(Applied PhysicsLetters, 2011, 99，123702-123702-3)但是現(xiàn)有檢測(cè)方法，主要存在著靈敏度低，步驟繁瑣，成本高等缺點(diǎn)，我們?cè)l(fā)現(xiàn)，核酸適配體(例如溶菌酶的適配體)可以誘導(dǎo)帶正電荷的二萘嵌苯探針集聚，從而使探針分子的熒光發(fā)生淬滅。加入溶菌酶后，由于適配體核酸和溶菌酶的特異性相互作用，使寡核苷酸誘導(dǎo)探針集聚能力減弱，探針分子單體被釋放出來，產(chǎn)生增強(qiáng)的熒光信號(hào)，可用來檢測(cè)溶菌酶(Angew.Chem.1nt.Ed.，2010, 49，1485)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有的蛋白質(zhì)檢測(cè)方法靈敏度低、步驟繁瑣成本高的缺陷，而提供一種六苯并苯衍生物探針、制備方法及基于六苯并苯衍生物探針與核酸適配體的蛋白質(zhì)檢測(cè)方法。[0006]本發(fā)明首先提供一種六苯并苯衍生物探針，該探針為1，2，7，8_四-(4-三甲基胺
丁基氧-羰基)-六苯并苯，其結(jié)構(gòu)式為:
[0007]
【權(quán)利要求】
1.一種六苯并苯衍生物探針，其特征在于，該探針為1，2，7，8_四-(4-三甲基胺丁基氧-羰基)-六苯并苯，其結(jié)構(gòu)式為:


2.一種六苯并苯衍生物探針的制備方法，其特征在于，包括: 步驟一:在反應(yīng)容器中加入茈、N-乙基馬來酰亞胺、四氯苯醌和對(duì)甲氧基苯酚，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，在230-280°C下反應(yīng)4-12小時(shí)，然后加入二甲基甲酰胺，反應(yīng)30-60分鐘，經(jīng)過濾、洗滌、干燥得到化合物I ; 步驟二:將步驟一得到的化合物1、氫氧化鉀和異丙醇混合，在85-100°C下反應(yīng)12-24小時(shí)，用稀鹽酸調(diào)PH至3-4，經(jīng)過濾、提純得到化合物2 ； 步驟三:將步驟二得到的化合物2加入氫氧化鉀水溶液中，加熱至85-95°C反應(yīng)2-6小時(shí)后冷卻至室溫，調(diào)pH至8-9，加入四正辛基溴化銨和1,4-二溴丁烷，在100-150°C下反應(yīng)2-6小時(shí)，經(jīng)洗滌、過濾、提純后得到化合物3 ； 步驟四:將步驟三得到的化合物3溶于四氫呋喃中，加入三甲胺水溶液，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，在40-50 V下反應(yīng)24-48小時(shí)，得到I，2，7，8-四-(4-三甲基胺丁基氧-羰基)_六苯并苯。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種六苯并苯衍生物探針的制備方法，其特征在于，所述的步驟一中茈和對(duì)甲氧基苯酚的摩爾比為2:1。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種六苯并苯衍生物探針的制備方法，其特征在于，所述的步驟二中化合物I與氫氧化鉀質(zhì)量比為1: (2-6)。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種六苯并苯衍生物探針的制備方法，其特征在于，所述的步驟三中化合物2、氫氧化鉀和四正辛基溴化銨質(zhì)量比為1:5:1。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種六苯并苯衍生物探針的制備方法，其特征在于，所述的步驟四中化合物3與三甲胺水溶液的摩爾比為1: (20-30)。
7.一種基于六苯并苯衍生物探針與核酸適配體的蛋白質(zhì)檢測(cè)方法，其特征在于，該方法包括: 將六苯并苯衍生物探針與被檢測(cè)蛋白質(zhì)的核酸適配體溶于Tris-HCl緩沖溶液中，然后再加入不同濃度被檢測(cè)蛋白質(zhì)，進(jìn)行熒光檢測(cè)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種基于六苯并苯衍生物探針與核酸適配體的蛋白質(zhì)檢測(cè)方法，其特征在于，所述的蛋白質(zhì)為HIV-1Tat蛋白、溶菌酶或凝血酶。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種基于六苯并苯衍生物探針與核酸適配體的蛋白質(zhì)檢測(cè)方法，其特征在于，所述的檢測(cè)體系為:500 μ L總體系，濃度為20-100ηΜ的六苯并苯衍生物探針，濃度為3-40ηΜ的核酸適配體，濃度為5mM pH7.4的Tris-HCl緩沖溶液，濃度為0-500nM蛋白質(zhì)，余量為無菌水。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種基于六苯并苯衍生物探針與核酸適配體的蛋白質(zhì)檢測(cè)方法，其特征在于，所述的檢測(cè)溫度為20-37°C，檢測(cè)時(shí)間為5-60分鐘。
【文檔編號(hào)】C07C213/02GK103992788SQ201410201064
【公開日】2014年8月20日 申請(qǐng)日期:2014年5月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月13日
【發(fā)明者】于聰, 李永新, 王燕, 張青峰, 王方遠(yuǎn), 陳健, 周會(huì)鵬 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所