一種氣相擴(kuò)散型結(jié)晶芯片及使用方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種氣相擴(kuò)散型結(jié)晶芯片及使用方法，其特征在于：①所述結(jié)晶芯片是由一個(gè)表面加工有微管道結(jié)構(gòu)且具有疏水特性的基片和一個(gè)表面平整且具有親水特性的基片鍵合構(gòu)成；②表面加工有微管道結(jié)構(gòu)的基片為圓盤狀微流控芯片，包含多組輻射狀對(duì)稱排列的微結(jié)構(gòu)單元，每個(gè)單元的結(jié)構(gòu)至少包含一個(gè)結(jié)晶微反應(yīng)腔、一個(gè)微隔離腔和一段結(jié)晶劑儲(chǔ)液微管道，其中微隔離腔兩側(cè)通過(guò)連接微管道分別與微反應(yīng)腔和結(jié)晶劑儲(chǔ)液微管道相連，使得結(jié)晶微反應(yīng)腔中的結(jié)晶液和結(jié)晶劑儲(chǔ)液微管道中的結(jié)晶劑處于一個(gè)共通的空間，彼此之間發(fā)生氣相物質(zhì)交換。所述的氣相擴(kuò)散型結(jié)晶芯片，克服了現(xiàn)有結(jié)晶微流控芯片無(wú)法實(shí)現(xiàn)氣相擴(kuò)散型結(jié)晶操作的不足，大大降低珍貴樣品和試劑的消耗。
【專利說(shuō)明】一種氣相擴(kuò)散型結(jié)晶芯片及使用方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種氣相擴(kuò)散型結(jié)晶芯片及使用方法，可應(yīng)用于生物大分子的結(jié)晶條件高通量篩選和優(yōu)化等領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002]生物大分子結(jié)構(gòu)與功能的研宄是生命科學(xué)的基本問(wèn)題之一，對(duì)分子生物學(xué)、蛋白質(zhì)工程以及新藥研制等都具有重要意義?；赬射線衍射的晶體學(xué)技術(shù)是研宄生物大分子三維結(jié)構(gòu)的主要手段，根據(jù)國(guó)際蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)(roB，WWW.pdb.0rg)中的數(shù)據(jù)可知，X射線衍射技術(shù)解析了 88%以上的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。X射線衍射技術(shù)應(yīng)用于生物大分子結(jié)構(gòu)解析的前提是要獲得合適的單晶，然而從純度很高的蛋白質(zhì)到生長(zhǎng)出具備衍射質(zhì)量蛋白質(zhì)晶體的成功率不足13%，因此目前生物大分子結(jié)構(gòu)研宄的最大瓶頸就在于生物大分子的結(jié)晶。生物大分子的結(jié)晶過(guò)程是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，目前主要通過(guò)經(jīng)驗(yàn)性地大量試驗(yàn)去篩選和優(yōu)化結(jié)晶條件。對(duì)于一個(gè)生物大分子來(lái)說(shuō)，要篩選出其合適的結(jié)晶條件，往往要經(jīng)過(guò)數(shù)百次甚至上千次組合試驗(yàn)。如果采用傳統(tǒng)的手工微孔板技術(shù)進(jìn)行結(jié)晶條件的篩選和優(yōu)化，這往往是一個(gè)非常艱巨的任務(wù)，需要耗費(fèi)大量的人力、時(shí)間和珍貴的樣品，效率低下，嚴(yán)重限制了生物大分子結(jié)構(gòu)與功能方面的研宄。雖然目前自動(dòng)化微量移液裝置的出現(xiàn)大大降低了生物大分子結(jié)晶操作的勞動(dòng)強(qiáng)度，并提高了結(jié)晶實(shí)驗(yàn)通量，但是該類裝置價(jià)格昂貴、靈活性較差，且整個(gè)結(jié)晶過(guò)程仍為自發(fā)、被動(dòng)形式，成功率較低，對(duì)生物大分子結(jié)構(gòu)與功能方面研宄的貢獻(xiàn)比重較小。近年來(lái)，快速發(fā)展的微流控技術(shù)為生物大分子結(jié)晶條件的高通量、快速篩選提供了一個(gè)新的平臺(tái)，最典型的兩個(gè)技術(shù):一個(gè)是加州理工大學(xué)Quake等人利用微腔體結(jié)合PDMS(polydimethysilane，PDMS)閥構(gòu)建的微陣列液_液擴(kuò)散型蛋白質(zhì)結(jié)晶芯片[Hansen CL, Skordalakes E, Berger JM, Quake SR:A robust andscalable microfluidic metering method that allows protein crystal growth byfree interface diffus1n.Proc Natl Acad Sci USA 2002, 99:16531-16536.],另一個(gè)是芝加哥大學(xué)的Ismagilov等人利用液滴型微流控芯片發(fā)展起來(lái)的微批量型蛋白質(zhì)結(jié)晶芯片[Zheng B, Roach LS, Ismagilov RF:Screening of Protein Crystallizat1nCondit1ns on a Microfluidic Chip Using Nanoliter-Size Droplets.J.AM.CHEM.S0C.2003, 125:11170-11171.]o相比于傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)結(jié)晶條件篩選技術(shù)，微流控技術(shù)具有許多明顯的優(yōu)勢(shì):(I)降低樣品和試劑消耗量；(2)增加篩選條件的總數(shù)；(3)加快試驗(yàn)速度。雖然微流控技術(shù)在蛋白質(zhì)結(jié)晶條件篩選方面受到廣泛關(guān)注和研宄，但是目前該技術(shù)在蛋白質(zhì)結(jié)晶方面并未得到充分應(yīng)用和挖掘。傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)結(jié)晶方法主要有氣相擴(kuò)散結(jié)晶法、批量結(jié)晶法、液-液擴(kuò)散結(jié)晶法和透析結(jié)晶法。雖然Quake研宄小組和Ismagilov研宄小組分別成功地實(shí)現(xiàn)了可進(jìn)行液-液擴(kuò)散結(jié)晶和批量結(jié)晶的微流控芯片，但是目前結(jié)構(gòu)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中應(yīng)用最廣泛的氣相擴(kuò)散結(jié)晶方法還未在微流控平臺(tái)上真正實(shí)現(xiàn)，由于每種結(jié)晶方法可篩選的結(jié)晶條件和范圍都有差異，且常規(guī)結(jié)構(gòu)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)人員更熟悉和偏愛(ài)氣相擴(kuò)散結(jié)晶方法，因此導(dǎo)致現(xiàn)有的微流控結(jié)晶芯片并未得到廣泛接納和應(yīng)用。而且，現(xiàn)有的微流控結(jié)晶芯片與傳統(tǒng)的微孔板結(jié)晶裝置一樣，仍然是只適用于自發(fā)、被動(dòng)式的結(jié)晶，結(jié)晶過(guò)程中無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)結(jié)晶體系主動(dòng)的調(diào)控和原位優(yōu)化。為了實(shí)現(xiàn)微流控技術(shù)在結(jié)構(gòu)生物學(xué)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，充分發(fā)揮微流控技術(shù)低耗樣、高通量、快速的優(yōu)勢(shì)，進(jìn)一步提高生物大分子結(jié)晶效率，促進(jìn)結(jié)構(gòu)生物學(xué)的快速發(fā)展，迫切需要發(fā)展新型、可實(shí)現(xiàn)氣相擴(kuò)散結(jié)晶模式以及具備主動(dòng)調(diào)控功能的微流控結(jié)晶芯片。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一種氣相擴(kuò)散型結(jié)晶芯片及使用方法，應(yīng)用于生物大分子高通量結(jié)晶條件篩選和優(yōu)化。
[0004]本發(fā)明提供的一種氣相擴(kuò)散型結(jié)晶芯片，其特征在于:
[0005]①所述結(jié)晶芯片是由一個(gè)表面加工有微管道結(jié)構(gòu)且具有疏水特性的基片和一個(gè)表面平整且具有親水特性的基片鍵合構(gòu)成，使得該芯片利用毛細(xì)作用力實(shí)現(xiàn)微量液相樣品在微管道中的自動(dòng)化進(jìn)樣；表面加工有微管道結(jié)構(gòu)的基片為圓盤狀微流控芯片，包含多組輻射狀對(duì)稱排列的微結(jié)構(gòu)單元，每個(gè)單元的結(jié)構(gòu)至少包含一個(gè)結(jié)晶微反應(yīng)腔、一個(gè)微隔離腔和一段結(jié)晶劑儲(chǔ)液微管道，其中微隔離腔兩側(cè)通過(guò)連接微管道分別與微反應(yīng)腔和結(jié)晶劑儲(chǔ)液微管道相連，使得結(jié)晶微反應(yīng)腔中的結(jié)晶液和結(jié)晶劑儲(chǔ)液微管道中的結(jié)晶劑處于一個(gè)共通的空間，彼此之間可以發(fā)生氣相物質(zhì)交換，從而可以實(shí)現(xiàn)基于氣相擴(kuò)散模式的結(jié)晶篩選和優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。
[0006]②所述圓盤狀微流控芯片呈輻射狀排列的每個(gè)結(jié)構(gòu)單元除了包含一段樣品定容管道外至少還包含一個(gè)結(jié)晶劑進(jìn)樣口、一段結(jié)晶劑進(jìn)樣微管道、一段樣品定容微管道、一個(gè)通氣管道、一個(gè)結(jié)晶微反應(yīng)腔、一個(gè)微隔離腔以及一個(gè)短結(jié)晶劑儲(chǔ)液微管道，其中樣品定容微管道和結(jié)晶劑定容管道的一端均與微反應(yīng)腔相連。
[0007]③所述圓盤狀微流控芯片中每個(gè)單元的定容微管道和微反應(yīng)腔連接處的定容微管道端的截面小于微反應(yīng)腔端的截面，從而使得兩者相連處因管道截面突變形成毛細(xì)微閥結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)流體控制。
[0008]④所述圓盤狀微流控芯片利用毛細(xì)疏水閥和離心力的協(xié)同作用實(shí)現(xiàn)微量樣品和結(jié)晶劑的并行定量分配和混合。
[0009]⑤所述的微隔離腔兩側(cè)通過(guò)一組連接管道分別與結(jié)晶微反應(yīng)腔和結(jié)晶劑儲(chǔ)液管道相連，且連接微管道與微隔離腔連接處的界面大大小于定容微管道與結(jié)晶反應(yīng)腔連接處的截面，使得連接微管道與微隔離腔的連接處形成具有更大阻力的毛細(xì)微閥，阻止樣品和結(jié)晶劑離心分配過(guò)程中從結(jié)晶微反應(yīng)腔進(jìn)入微隔離腔中。
[0010]⑥所述圓盤狀微流控芯片中每個(gè)單元的結(jié)晶劑儲(chǔ)液微管道中包含的結(jié)晶劑濃度和成分通過(guò)更換相應(yīng)結(jié)晶劑進(jìn)樣口的溶液進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而利用結(jié)晶微反應(yīng)腔中結(jié)晶液和結(jié)晶劑儲(chǔ)液微管道中結(jié)晶劑之間化學(xué)勢(shì)差的變化，主動(dòng)調(diào)控結(jié)晶微反應(yīng)腔中結(jié)晶液的過(guò)飽和度和過(guò)飽和速率。
[0011 ] ⑦圓盤狀微流控芯片中還包含油相進(jìn)樣口、油相進(jìn)樣微管道和油相廢液口，用以完成液樣分配后在管道中充入石蠟油，隔離各結(jié)晶微反應(yīng)腔。
[0012]本發(fā)明所述的氣相擴(kuò)散型結(jié)晶芯片的使用方法如下:首先，將待結(jié)晶的樣品和結(jié)晶劑分別滴加在結(jié)晶芯片對(duì)應(yīng)的進(jìn)樣口，使其在毛細(xì)作用的驅(qū)動(dòng)下自動(dòng)充滿相應(yīng)的進(jìn)樣微管道和定容微管道，并因毛細(xì)疏水閥的阻力作用而自動(dòng)停在定容微管道與微反應(yīng)腔相接處；然后，利用膠帶密封芯片所有進(jìn)樣口，并將芯片置于離心裝置上，通過(guò)離心力作用使得各定容微管道中的樣品和試劑克服毛細(xì)疏水閥的阻力進(jìn)入對(duì)應(yīng)的結(jié)晶微反應(yīng)腔中混合，從而實(shí)現(xiàn)的結(jié)晶樣品和結(jié)晶試劑的高通量并行定量分配和混合；完成結(jié)晶樣品和結(jié)晶劑分配后，剝離結(jié)晶樣品進(jìn)樣口膠帶，并滴加石蠟油，石蠟油將在毛細(xì)力作用下充滿樣品進(jìn)樣微管道和定容微管道，隔離各個(gè)結(jié)晶微反應(yīng)腔；最后，將一層低通透性薄膜貼附于芯片上表面，抑制結(jié)晶過(guò)程中樣品的水分和溶劑的揮發(fā)；最后將芯片置于設(shè)定的常溫環(huán)境下，進(jìn)行結(jié)晶實(shí)驗(yàn)。
[0013]本發(fā)明所述的氣相擴(kuò)散型結(jié)晶芯片也可應(yīng)用于結(jié)晶液飽和速率的梯度調(diào)控，其特征在于:完成結(jié)晶芯片的樣品和結(jié)晶劑進(jìn)樣和分配后，剝離密封各結(jié)晶試劑進(jìn)樣口的膠帶，并吸干各進(jìn)樣口的結(jié)晶試劑；然后，根據(jù)梯度設(shè)定在各進(jìn)樣口中滴加不同濃度和配比的結(jié)晶試劑，使芯片上各結(jié)晶微反應(yīng)腔中的結(jié)晶液與相應(yīng)結(jié)晶劑儲(chǔ)液微管道中的結(jié)晶試劑之間化學(xué)勢(shì)差呈梯度分布，從而使得各結(jié)晶微反應(yīng)腔中結(jié)晶液擴(kuò)散失溶劑和趨向飽和的速率也呈梯度分布。由于結(jié)晶的成功與否以及結(jié)晶形成的晶體質(zhì)量與結(jié)晶液的過(guò)飽和度和過(guò)飽和速率有很大關(guān)系，因此梯度式、系統(tǒng)地調(diào)節(jié)結(jié)晶體系的過(guò)飽和度和過(guò)飽和速率可以快速篩選較為優(yōu)化的結(jié)晶條件。
[0014]另外，本發(fā)明所述的氣相擴(kuò)散型結(jié)晶芯片還可應(yīng)用于原位優(yōu)化結(jié)晶結(jié)果，其特征在于:若觀測(cè)到結(jié)晶芯片的結(jié)晶微反應(yīng)腔中出現(xiàn)沉淀或眾多小晶體或微晶，可剝離相應(yīng)結(jié)晶試劑進(jìn)樣口的密封膠帶，并吸干該進(jìn)樣口的結(jié)晶劑，加入水溶液，再以膠帶重新密封結(jié)晶劑進(jìn)樣口。由于水溶液化學(xué)勢(shì)高于結(jié)晶液的化學(xué)勢(shì)，水分子將從結(jié)晶劑儲(chǔ)液微管道擴(kuò)散至結(jié)晶微反應(yīng)腔的結(jié)晶液中，從而降低結(jié)晶液的飽和度，使得其中的沉淀、小晶體或微晶重新溶解。待絕大多數(shù)沉淀、小晶體或微晶溶解后，再次剝離相應(yīng)結(jié)晶試劑進(jìn)樣口的密封膠帶，并吸干該進(jìn)樣口的水溶液，加入濃度低于初始篩選濃度的結(jié)晶劑，以膠帶重新密封結(jié)晶劑進(jìn)樣口后靜置結(jié)晶。相對(duì)于初篩的結(jié)晶過(guò)程，結(jié)晶劑進(jìn)樣口中加入低濃度結(jié)晶劑的情況，可以使得結(jié)晶過(guò)程在相對(duì)緩慢的過(guò)飽和速率和較低的過(guò)飽和度結(jié)晶體系中進(jìn)行。若一次調(diào)整未能獲得理想的晶體，可多次重復(fù)上述步驟，逐步調(diào)整結(jié)晶劑濃度，直至結(jié)晶微反應(yīng)腔中形成體積較大的、適于X射線衍射分析的單晶。
[0015]總之，本發(fā)明提供的氣相擴(kuò)散型結(jié)晶芯片，克服了現(xiàn)有結(jié)晶微流控芯片無(wú)法實(shí)現(xiàn)氣相擴(kuò)散型結(jié)晶操作的不足，與傳統(tǒng)的基于微孔板的懸滴式或座滴式氣相擴(kuò)散型結(jié)晶裝置相比，可大大降低珍貴樣品和試劑的消耗，且該芯片采用毛細(xì)微閥和離心力的協(xié)同作用的流體驅(qū)動(dòng)和控制方式，可簡(jiǎn)便快速地實(shí)現(xiàn)微量樣品和結(jié)晶劑的并行定量分配和混合，大大降低了實(shí)驗(yàn)人員的操作強(qiáng)度，具有明顯的操作和成本優(yōu)勢(shì)。另外，相對(duì)于傳統(tǒng)的結(jié)晶方法和現(xiàn)有微流控結(jié)晶技術(shù)，本發(fā)明提供的氣象擴(kuò)散型結(jié)晶芯片具有更高的靈活度，不僅可高通量篩選生物大分子結(jié)晶條件，而且還可梯度調(diào)控結(jié)晶液的過(guò)飽和速率以及原位優(yōu)化初篩的結(jié)晶條件，一方面可大大拓展結(jié)晶條件篩選范圍，另一方面也可提高結(jié)晶實(shí)驗(yàn)效率、降低結(jié)晶實(shí)驗(yàn)成本。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0016]圖1為本發(fā)明氣相擴(kuò)散型結(jié)晶芯片組合結(jié)構(gòu)示意圖。
[0017]圖2-⑴為本發(fā)明氣相擴(kuò)散型結(jié)晶芯片平面結(jié)構(gòu)示意圖；圖2-⑵為圖2-⑴中微結(jié)構(gòu)單元結(jié)構(gòu)放大示意圖。
[0018]圖3為本發(fā)明氣相擴(kuò)散型結(jié)晶芯片中結(jié)晶微反應(yīng)腔局部放大示意圖。
[0019]圖4-⑴為本發(fā)明氣相擴(kuò)散型結(jié)晶芯片實(shí)施毛細(xì)自動(dòng)充樣后平面示意圖；圖
4-(2)為圖4-(1)虛線部分的放大示意圖。
[0020]圖5為本發(fā)明氣相擴(kuò)散型結(jié)晶芯定量分配平面示意圖。
[0021]圖6-⑴為本發(fā)明氣相擴(kuò)散型結(jié)晶芯片實(shí)施離心分配后平面示意圖；圖6-⑵為圖6-(1)中虛線的放大示意圖。

【具體實(shí)施方式】
[0022]下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的進(jìn)步。
[0023]實(shí)施例1
[0024]如圖1所示，本發(fā)明氣相擴(kuò)散型結(jié)晶芯片為一種復(fù)合式圓盤形微流體芯片，該芯片由一表面加工有微管道且具有疏水特性的基片(I)和另一表面具有親水特性的平整基片⑵鍵合構(gòu)成(如圖1所示)；其中，基片⑴為圓盤狀微流控芯片，它包含多組輻射狀對(duì)稱排列的微結(jié)構(gòu)單元，所有的微結(jié)構(gòu)單元均通過(guò)樣品進(jìn)樣微結(jié)構(gòu)(包括樣品進(jìn)樣口(3)、樣品進(jìn)樣微管道(4)和樣品定容微管道(5))串連起來(lái)(如圖2-(1)所示)，其中每個(gè)結(jié)構(gòu)單元除了包含一段樣品定容微管道(5)外，還包含一個(gè)結(jié)晶劑進(jìn)樣口(6)、一段結(jié)晶劑進(jìn)樣微管道(7)、一段結(jié)晶劑定容微管道(8)、一個(gè)通氣管道(9)、一個(gè)結(jié)晶微反應(yīng)腔(10)、一個(gè)微隔離腔(11)和一段結(jié)晶劑儲(chǔ)液微管道(12)(如圖2-(2)所示)，其中樣品定容微管道(5)和結(jié)晶劑定容微管道(8)的一端均與結(jié)晶微反應(yīng)腔(10)相連，且連接處定容微管道的截面小于結(jié)晶微反應(yīng)腔的截面，使得此處因管道截面的突變形成毛細(xì)微閥結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)流體控制；另外，微隔離腔(11)兩側(cè)通過(guò)一組連接微管道(13)分別與結(jié)晶微反應(yīng)腔(10)和結(jié)晶劑儲(chǔ)液微管道(12)相連，且連接微管道與微隔離腔連接處的截面大大小于定容微管道與結(jié)晶微反應(yīng)腔(10)連接處的截面(如圖3所示)，使得此處形成阻截能力更強(qiáng)的毛細(xì)微閥，阻止離心分配過(guò)程中微反應(yīng)腔的液體因離心力作用進(jìn)入微隔離腔，而導(dǎo)致結(jié)晶液與結(jié)晶劑儲(chǔ)液直接接觸。為了隔離各結(jié)晶微反應(yīng)腔，保證結(jié)晶過(guò)程中各結(jié)晶微反應(yīng)腔中氣相擴(kuò)散過(guò)程的獨(dú)立性，圓盤狀微流控芯片中還包含油相進(jìn)樣口(14)、油相進(jìn)樣微管道(15)和油相廢液口
(16)，用以在完成液樣分配后在管道中充入石蠟油，隔離各結(jié)晶微反應(yīng)腔。
[0025]氣相擴(kuò)散型結(jié)晶芯片工作時(shí)，首先通過(guò)移液器在樣品進(jìn)樣口(3)和結(jié)晶劑進(jìn)樣口
(6)中分別加入待結(jié)晶的樣品和結(jié)晶劑，液樣在毛細(xì)力的作用下自動(dòng)填充進(jìn)樣管道，并因毛細(xì)微閥作用，停止于結(jié)晶微反應(yīng)腔(10)前(如圖4-1和4-2所示)。然后利用膠帶密封結(jié)晶芯片所有結(jié)晶劑進(jìn)樣口，并將芯片放置并固定于離心機(jī)上，通過(guò)旋轉(zhuǎn)芯片，利用離心力使待結(jié)晶的樣品溶液和結(jié)晶劑克服毛細(xì)微閥的阻力作用進(jìn)入結(jié)晶微反應(yīng)腔(10)中混合，由于微管道中液體所受離心的方向是從圓心輻射向外的，所以每個(gè)單元的微管道中僅有樣品定容微管道(5)和結(jié)晶劑定容微管道(8)中的液體被離心至結(jié)晶微反應(yīng)腔(10)中從而實(shí)現(xiàn)定量分配混合，形成結(jié)晶液(如圖5陰影部分所示)；另外，由于結(jié)晶劑進(jìn)樣口被密封，離心過(guò)程中結(jié)晶劑進(jìn)樣口中的結(jié)晶劑不會(huì)被“甩”出芯片，因此，在離心結(jié)束后，毛細(xì)作用將驅(qū)使結(jié)晶劑重新充滿結(jié)晶劑定容微管道和結(jié)晶劑儲(chǔ)液微管道完成樣品和結(jié)晶劑分配后，在油相進(jìn)樣口(14)加入石蠟油，在毛細(xì)作用下，石蠟油自動(dòng)充滿油相進(jìn)樣微管道(15)和樣品定容微管道(5)，然后再次離心，使得石蠟油進(jìn)入結(jié)晶微反應(yīng)腔，封閉結(jié)晶液內(nèi)側(cè)(即靠近圓心的一側(cè))，實(shí)現(xiàn)對(duì)各結(jié)晶微反應(yīng)腔的隔離(如圖6-⑴和6-⑵所示)。最后，用一層低通透性的聚偏二氯乙烯(PVDC)膜貼附在結(jié)晶芯片上表面，以防止芯片中溶劑的揮發(fā)，并將結(jié)晶芯片放置于4°C或25°C條件下進(jìn)行結(jié)晶，間隔一定時(shí)間后對(duì)結(jié)晶芯片中各結(jié)晶微反應(yīng)腔中結(jié)晶結(jié)果進(jìn)行觀察，以此確定合適的結(jié)晶條件。
[0026]實(shí)施例2
[0027]將實(shí)施例1制備的氣相擴(kuò)散型結(jié)晶芯片應(yīng)用于梯度調(diào)控蛋白質(zhì)結(jié)晶液飽和度，篩選優(yōu)化的結(jié)晶條件，其方式為:首先如實(shí)施例1所述，在結(jié)晶芯片中完成蛋白質(zhì)樣品和結(jié)晶劑的進(jìn)樣和分配，并剝離密封各結(jié)晶試劑進(jìn)樣口的膠帶，以吸水紙吸干各進(jìn)樣口的結(jié)晶劑；然后，根據(jù)梯度設(shè)計(jì)范圍，在各進(jìn)樣口中滴加不同濃度和配比的結(jié)晶試劑，使得芯片上各結(jié)晶微反應(yīng)腔中的結(jié)晶液與相應(yīng)結(jié)晶劑儲(chǔ)液微管道中的結(jié)晶試劑之間的化學(xué)勢(shì)差呈梯度分布，從而使得各結(jié)晶微反應(yīng)腔中蛋白質(zhì)結(jié)晶液的溶劑擴(kuò)散損失速率和趨向飽和的速率也呈梯度分布，由于蛋白質(zhì)結(jié)晶液的過(guò)飽和度和過(guò)飽和速率對(duì)其形成晶體的大小和質(zhì)量有直接影響，因此通過(guò)梯度式、系統(tǒng)地調(diào)控蛋白質(zhì)結(jié)晶液的飽和速率，可以快速、高效地篩選出較優(yōu)化的蛋白質(zhì)結(jié)晶條件。
[0028]實(shí)施例3
[0029]將實(shí)施例1制備的氣相擴(kuò)散型結(jié)晶芯片應(yīng)用于結(jié)晶初篩結(jié)果的原位優(yōu)化，其方式為:首先如實(shí)施例1所述，將蛋白質(zhì)樣品溶液與多組結(jié)晶試劑定量分配混合，進(jìn)行結(jié)晶條件的篩選；若觀測(cè)到結(jié)晶芯片的某些結(jié)晶微反應(yīng)腔中出現(xiàn)沉淀或者大量的小晶體或微晶，可剝離相應(yīng)結(jié)晶試劑進(jìn)樣口的密封膠帶，并吸干該進(jìn)樣口的結(jié)晶劑，在其中加入水溶液，再以膠帶重新密封結(jié)晶劑進(jìn)樣口。由于水溶液的化學(xué)勢(shì)高于結(jié)晶微反應(yīng)腔中結(jié)晶液的化學(xué)勢(shì)，因此，水分子將從結(jié)晶劑儲(chǔ)液微管道經(jīng)微隔離腔擴(kuò)散至結(jié)晶微反應(yīng)腔中，降低結(jié)晶液的飽和度，使得結(jié)晶微反應(yīng)腔中的沉淀、小晶體或微晶重新溶解；觀察到結(jié)晶微反應(yīng)腔中絕大多數(shù)沉淀、小晶體或微晶溶解后，再次剝離相應(yīng)結(jié)晶試劑進(jìn)樣口的密封膠帶，并吸干該進(jìn)樣口的水溶液，再加入濃度比初始篩選濃度低的結(jié)晶劑，以膠帶密封結(jié)晶劑進(jìn)樣口后重新靜置結(jié)晶。由于在低飽和度的結(jié)晶液中，晶體生長(zhǎng)速率與晶核生成速率的比值較大，結(jié)晶所形成的晶體也較大，晶形較完整，因此通過(guò)適當(dāng)降低結(jié)晶劑的濃度，可以調(diào)控結(jié)晶液的趨向飽和的速率和結(jié)晶過(guò)程，優(yōu)化結(jié)晶結(jié)果。若一次調(diào)控在結(jié)晶芯片中未獲得適于衍射分析的單晶，可多次重復(fù)上述步驟，逐步調(diào)整結(jié)晶劑濃度，直至結(jié)晶微反應(yīng)腔中形成體積較大的、適于X射線衍射分析的單晶。
【權(quán)利要求】
1.一種氣相擴(kuò)散型結(jié)晶芯片，其特征在于: ①所述結(jié)晶芯片是由一個(gè)表面加工有微管道結(jié)構(gòu)且具有疏水特性的基片和一個(gè)表面平整且具有親水特性的基片鍵合構(gòu)成，使得該芯片利用毛細(xì)作用力實(shí)現(xiàn)微量液相樣品在微管道中的自動(dòng)化進(jìn)樣； ②表面加工有微管道結(jié)構(gòu)的基片為圓盤狀微流控芯片，包含多組輻射狀對(duì)稱排列的微結(jié)構(gòu)單元，每個(gè)單元的結(jié)構(gòu)至少包含一個(gè)結(jié)晶微反應(yīng)腔、一個(gè)微隔離腔和一段結(jié)晶劑儲(chǔ)液微管道，其中微隔離腔兩側(cè)通過(guò)連接微管道分別與微反應(yīng)腔和結(jié)晶劑儲(chǔ)液微管道相連，使得結(jié)晶微反應(yīng)腔中的結(jié)晶液和結(jié)晶劑儲(chǔ)液微管道中的結(jié)晶劑處于一個(gè)共通的空間，彼此之間可以發(fā)生氣相物質(zhì)交換，從而可以實(shí)現(xiàn)基于氣相擴(kuò)散模式的結(jié)晶篩選和優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)晶芯片，其特征在于所述圓盤狀微流控芯片呈輻射狀排列的每個(gè)結(jié)構(gòu)單元除了包含一段樣品定容管道外至少還包含一個(gè)結(jié)晶劑進(jìn)樣口、一段結(jié)晶劑進(jìn)樣微管道、一段樣品定容微管道、一個(gè)通氣管道、一個(gè)結(jié)晶微反應(yīng)腔、一個(gè)微隔離腔以及一個(gè)短結(jié)晶劑儲(chǔ)液微管道，其中樣品定容微管道和結(jié)晶劑定容管道的一端均與微反應(yīng)腔相連。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)晶芯片，其特征在于所述圓盤狀微流控芯片中每個(gè)單元的定容微管道和微反應(yīng)腔連接處的定容微管道端的截面小于微反應(yīng)腔端的截面，從而使得兩者相連處因管道截面突變形成毛細(xì)微閥結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)流體控制。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)晶芯片，其特征在于所述圓盤狀微流控芯片利用毛細(xì)疏水閥和離心力的協(xié)同作用實(shí)現(xiàn)微量樣品和結(jié)晶劑的并行定量分配和混合。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的結(jié)晶芯片，其特征在于所述的微隔離腔兩側(cè)通過(guò)一組連接管道分別與結(jié)晶微反應(yīng)腔和結(jié)晶劑儲(chǔ)液管道相連，且連接微管道與微隔離腔連接處的界面小于定容微管道與結(jié)晶反應(yīng)腔連接處的截面，使得連接微管道與微隔離腔的連接處形成具有更大阻力的毛細(xì)微閥，阻止樣品和結(jié)晶劑離心分配過(guò)程中從結(jié)晶微反應(yīng)腔進(jìn)入微隔離腔中。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)晶芯片，其特征在于所述圓盤狀微流控芯片中每個(gè)單元的結(jié)晶劑儲(chǔ)液微管道中包含的結(jié)晶劑濃度和成分通過(guò)更換相應(yīng)結(jié)晶劑進(jìn)樣口的溶液進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而利用結(jié)晶微反應(yīng)腔中結(jié)晶液和結(jié)晶劑儲(chǔ)液微管道中結(jié)晶劑之間化學(xué)勢(shì)差的變化，主動(dòng)調(diào)控結(jié)晶微反應(yīng)腔中結(jié)晶液的過(guò)飽和度和過(guò)飽和速率。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)晶芯片，其特征在于圓盤狀微流控芯片中還包含油相進(jìn)樣口、油相進(jìn)樣微管道和油相廢液口，用以完成液樣分配后在管道中充入石蠟油，隔離各結(jié)晶微反應(yīng)腔。
8.使用按權(quán)利要求1所述的氣相擴(kuò)散型結(jié)晶芯片的方法，其特征在于包含以下步驟: 1)將待結(jié)晶的樣品和結(jié)晶劑分別滴加在對(duì)應(yīng)的進(jìn)樣口，使其在毛細(xì)作用的驅(qū)動(dòng)下自動(dòng)充滿進(jìn)樣微管道和定容微管道，并因毛細(xì)疏水閥的阻力作用而自動(dòng)停在定容微管道與微反應(yīng)腔相接處； 2)利用膠帶密封芯片所有結(jié)晶劑進(jìn)樣口，并將芯片置于離心裝置上，通過(guò)旋轉(zhuǎn)芯片，利用離心力使定容微管道中的樣品和試劑克服毛細(xì)疏水閥的阻力進(jìn)入微反應(yīng)腔混合，從而實(shí)現(xiàn)定量分配和混合； 3)完成樣品分配后，在芯片微管道中充入石蠟油，隔離各個(gè)結(jié)晶微反應(yīng)腔，然后在芯片上表面貼附一層低通透性薄膜，抑制結(jié)晶過(guò)程中樣品的水分和溶劑的揮發(fā)； 4)最后將芯片置于設(shè)定的常溫環(huán)境下，進(jìn)行結(jié)晶實(shí)驗(yàn)。
9.所述的氣相擴(kuò)散型結(jié)晶芯片用于結(jié)晶液飽和度的梯度調(diào)控，其特征在于:結(jié)晶芯片完成樣品和試劑進(jìn)樣和分配后，剝離密封各結(jié)晶試劑進(jìn)樣口的膠帶，并吸干各進(jìn)樣口的結(jié)晶劑；然后，根據(jù)梯度設(shè)計(jì)，在各進(jìn)樣口中滴加不同濃度和配比的結(jié)晶試劑，使得芯片上各結(jié)晶微反應(yīng)腔中的結(jié)晶液與相應(yīng)結(jié)晶劑儲(chǔ)液微管道中的結(jié)晶試劑之間的化學(xué)勢(shì)差呈梯度分布，從而使得各結(jié)晶微反應(yīng)腔中結(jié)晶液的溶劑擴(kuò)散損失速率和趨向飽和的速率也呈梯度分布，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)芯片上各結(jié)晶反應(yīng)腔中結(jié)晶液飽和度的梯度調(diào)控。
10.所述的氣相擴(kuò)散型結(jié)晶芯片用于原位優(yōu)化的結(jié)晶初篩，其特征在于:對(duì)于結(jié)晶芯片的結(jié)晶微反應(yīng)腔中出現(xiàn)沉淀或眾多小晶體或微晶的情況，可剝離相應(yīng)結(jié)晶試劑進(jìn)樣口的密封膠帶，并吸干該進(jìn)樣口的結(jié)晶劑，加入水溶液，再以膠帶重新密封結(jié)晶劑進(jìn)樣口，使得結(jié)晶微反應(yīng)腔中的沉淀、小晶體或微晶重新溶解；待絕大多數(shù)沉淀、小晶體或微晶溶解后，再次剝離相應(yīng)結(jié)晶試劑進(jìn)樣口的密封膠帶，并吸干該進(jìn)樣口的水溶液，加入濃度低于初始篩選濃度的結(jié)晶劑，以膠帶重新密封結(jié)晶劑進(jìn)樣口后靜置結(jié)晶；可多次重復(fù)上述步驟，逐步調(diào)整結(jié)晶劑濃度，直至結(jié)晶微反應(yīng)腔中形成體積較大的、適于X射線衍射分析的單晶。
【文檔編號(hào)】C07K1/14GK104497099SQ201410723333
【公開(kāi)日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2014年12月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月2日
【發(fā)明者】李剛, 王麗, 高坤鵬, 趙建龍 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海微系統(tǒng)與信息技術(shù)研究所