專利名稱：血栓溶解酶及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的領(lǐng)域本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的止血術(shù)、藥理學(xué)，在臨床和實(shí)驗(yàn)藥物上用于作為血栓溶解生物活性制劑。
已有文獻(xiàn)目前對(duì)醫(yī)用水蛭唾液腺分泌物的應(yīng)用停留在一系列作為用于制備具有血栓溶解、纖維蛋白溶解活性的生物活性物質(zhì)的各種源物質(zhì)上，這些源物質(zhì)仍在補(bǔ)充之中。對(duì)作為生物活性物質(zhì)源物質(zhì)的醫(yī)用水蛭的天然分泌物的實(shí)際興趣是由于在水蛭療法的水蛭吸血法中使用醫(yī)用水蛭的血栓溶解效應(yīng)時(shí)，確定了由不同病因引起的血栓性靜脈炎的治療效應(yīng)的依賴性(Zaitsev G.B.“血栓靜脈炎”，1947，Medgiz，莫斯科，p.78)。
醫(yī)用水蛭唾液腺分泌物的應(yīng)用是由于發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)變?yōu)樾滦再|(zhì)的新的機(jī)理。
當(dāng)用酪蛋白和非穩(wěn)定的纖維蛋白作為底物時(shí)，分析醫(yī)用水蛭唾液腺分泌物的性能表明它幾乎不具有蛋白水解活性。然而，當(dāng)醫(yī)用水蛭唾液腺分泌物在與交聯(lián)著因子XIIIa的不溶性穩(wěn)定纖維蛋白的溫育過程中，纖維蛋白能轉(zhuǎn)變成可溶性狀態(tài)，并且纖維蛋白的穩(wěn)定程度越高(即在穩(wěn)定的纖維蛋白制備物中存在較多的ε-(γ-Glu)-Lys-異肽鍵)，轉(zhuǎn)變的程度就越大。這個(gè)初看起來不合理的見解，我們解釋為是由于在水蛭分泌物的組成中存在一種酶，該酶特別地水解穩(wěn)定化纖維蛋白中的異肽鍵，而對(duì)不存在這些異肽鍵的非穩(wěn)定化纖維蛋白不起作用。這種酶稱為去穩(wěn)定酶(destabilase)(Biokhimiya，50，1985，Nauka，莫斯科，pp.424-431)。
已知的溶解血栓和溶解纖維蛋白的酶對(duì)纖維蛋白中肽鍵的水解有催化作用，與具有ε-(γ-Glu)-Lys-異肽鍵的“交聯(lián)”纖維蛋白的程度無關(guān)，所述的異肽鍵是由于轉(zhuǎn)肽酶、因子XIIIa的作用形成的。通常，與非穩(wěn)定的纖維蛋白相比，與異肽鍵“交聯(lián)”的或穩(wěn)定化的纖維蛋白更能耐受蛋白水解酶的影響。同時(shí)，非穩(wěn)定纖維蛋白能變成可溶狀態(tài)，這不僅是由于纖維蛋白溶解酶刺激的蛋白水解作用的結(jié)果，也是非特異性試劑作用的結(jié)果，這些非特異性試劑會(huì)削弱纖維蛋白單體之間的離子性的、疏水性和H-O-的相互作用。
本發(fā)明的描述本發(fā)明揭示了一種物質(zhì)、它的性能以及制備能溶解血栓，并與按分子量和氨基酸序列從醫(yī)用水蛭獲得的已知制劑不同的，具有酰胺分解作用的外切異肽酶和內(nèi)切異肽酶活性的血栓溶解酶的方法。
所述制備去穩(wěn)定酶的方法按下述方式進(jìn)行。
將醫(yī)用水蛭的提取液進(jìn)行親合色譜處理，所述色譜是在含有固定在瓊脂糖凝膠(sepharose)4B上針對(duì)去穩(wěn)定酶的抗體柱上進(jìn)行的。柱由0.02M的tris-HCl緩沖液(pH＝7.4)平衡。未交聯(lián)的蛋白質(zhì)用緩沖液洗滌，而去穩(wěn)定酶用含0.3MNaCl的同樣緩沖液洗脫。所得的制劑再次在含CM-三丙烯酸類吸著劑、用0.02Mtris-HCl緩沖液(pH＝7.4)平衡的柱上進(jìn)行色譜處理。所需產(chǎn)物用溶解在同樣0.02Mtris-HCl緩沖液中的0.05M-0.20M NaCl洗脫。收集含最終產(chǎn)物的組分，在Superose-12上凝膠過濾進(jìn)行脫鹽，冷凍干燥。結(jié)果，所得的制劑含100％的活性物質(zhì)。純度用電泳法加以確定。
基本結(jié)構(gòu)。為了鑒定基本結(jié)構(gòu)，在含Aquapore RP-300(4.6×100)的反相柱上以0-60％的乙腈梯度，對(duì)酶進(jìn)行色譜處理60分鐘。確定了去穩(wěn)定酶的N-末端序列。確定了蘇氨酸為N-末端氨基酸。然后進(jìn)行去穩(wěn)定酶的溴化氰(CNBr)水解，所得的混合物再次在同樣的柱上在同樣的條件下進(jìn)行色譜處理。結(jié)果獲得了四個(gè)肽片斷。確定了第一片斷的氨基酸序列，它由25個(gè)氨基酸殘基組成，且在NH2-末端含有蘇氨酸殘基Thr Val Pro Ser Asp Cys Leu Arg Cye IleCys Gln Val Glu Gly Cys Asn Asn Glu Ile Gly Arg Cys Gly Met.
對(duì)第二片斷，確定了來自N-末端的，在NH2-末端為天冬氨酸的28個(gè)氨基酸序列Asp Ala Gly Ser Leu Ser Cys Gly Pro Tyr Gln Ile Lys Glu Pro Tyr X Ile AspX Gly Arg Pro Gly Gly X Tyr Gln。
對(duì)第三片斷，確定了來自N-末端的，在NH2-末端為天冬氨酸的24個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列Asp Arg Tyr Ala Pro Pro Cys Thr Gly Gly Arg Gln Pro ThrCys Gln Asp Tyr Ala Lys Ile His Asn Met。
對(duì)第四片斷，確定了來自N-末端的，10個(gè)氨基酸殘基的部分序列Gly ProAsn Gly Cys Gln Ser Leu Asn Asn。
甘氨酸是N-末端氨基酸。
使用標(biāo)準(zhǔn)方法將m-RNA從醫(yī)用水蛭中分離出來。使用逆轉(zhuǎn)錄在其基礎(chǔ)上合成第一條c-DNA鏈。利用前一步驟獲得的第一條c-DNA鏈和根據(jù)去穩(wěn)定酶氨基酸序列選擇的引物進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)進(jìn)行了擴(kuò)增編碼去穩(wěn)定酶的DNA片斷。結(jié)果獲得了預(yù)定長度為102核苷酸對(duì)的DNA片斷。按標(biāo)準(zhǔn)方法(Maniatia等人，982；Tabor，Richardson，1987)，對(duì)所得的DNA片斷進(jìn)行克隆和測序。測序了10個(gè)獨(dú)立的克隆，結(jié)果檢測到兩個(gè)不同的DNA序列-DS1和DS2。DS1和DS2的核苷酸序列不同可以得出這樣的結(jié)論，即在水蛭基因組中存在有對(duì)同類蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的基因族。
將DSl部分序列和DS2全長核苷酸序列顯示如下。DSl核苷酸序列引導(dǎo)序列ATG AAT TAC GTT ATC TTT GTG GTC TTA GTG GCA CTT TAC GTC 14Met Asn Tyr Val Ile Phe Val Val Leu Val Ala Leu Tyr ValATC GAC GTA GCG AAG TGC 20Ile Asp Val Ala Lys Cys結(jié)構(gòu)部分ACC GTT CCA TCC GAC TGC TTG AGT TGC ATT TGC GAG GTA GAG 34Thr Val Pro Ser Asp Cys Leu Ser Cys Ile Cys Glu Val GluGGA TGT GAC AAA GAG ATT GGA AGG TGC GGC GAT GAC GCA GGA 48Gly Cys Asp Lys Glu Ile Gly Arg Cys Gly Asp Asp Ala GlyAGT CTG AGC TGT GGT CCT... 62Ser Leu Ser Cys Gly Pro...DS2核苷酸序列引導(dǎo)序列ATG ATC ATT GCA ATT TAT GTT TCC CTA GCT CTT CTA ATC GCC 14Met Ile Ile Ala Ile Tyr Val Ser Leu Ala Leu Leu Ile AlaTCT GTC GAG GTG AAT AGC 20Ser Val Glu Val Asn Ser結(jié)構(gòu)部分CAA TTC ACT GAT TCT TGC CTT CGG TGT ATT TGC AAG GTG GAA 34Gln Phe Thr Asp Ser Cys Leu Arg Cys Ile Cys Lys Val GluGGA TGT GAC AGT CAA ATT GGA AAA TGT GGA ATG GAT GTT GGA 48Gly Cys Asp Ser Gln Ile Gly Lys Cys Gly Met Asp Val GlyAGC TTG AGT TGC GGA CCA TAC CAG ATT AAG AAA CCG TAG TGG62Set Leu Ser Cys Gly Pro Tyr Gln Ile Lys Lys Pro Tyr TrpATT GAT TGT GGA AAA CCA GGG GGA GGT TAC GAA TCA TGC ACA76Ile Asp Cys Gly Lys Pro Gly Gly Gly Tyr Glu Ser Cys ThrAAA AAT AAA GCC TGT TGA GAG ACT TGT GTG AGA GCT TAC ATG90Lys Asn Lys Ala Cys Ser Glu Thr Cys Val Arg Ala Tyr MetAAG AGG TAT GGA ACC TTC TGC ACA GGT GGA CGA ACC CCA ACC 104Lys Arg Tyr Gly Thr Phe Cys Thr Gly Gly Arg Thr Pro ThrTGC CAG GAT TAT GCT AGG ATT CAT AAC GGT GGA CCA CGC GGT 118Cys Gln Asp Tyr Ala Arg Ile His Asn Gly Gly Pro Arg GlyTGC AAG AGT TCT GCT ACT GTT GGT TAC TGG AAC AAG GTA CAG 130Cys Lys Ser Ser Ala Thr Val Gly Tyr Trp Ash Lys Val GlnAAA TGT TTG AGA 136Lys Cys Leu Arg實(shí)施本發(fā)明的最佳方法用下述的具體實(shí)施例說明制備去穩(wěn)定酶的方法。實(shí)施例1將饑餓至少三個(gè)月的醫(yī)用水蛭通過絞肉機(jī)，用生理鹽水進(jìn)行提取。將提取液施加到含有固定在瓊脂糖凝膠(sepharose)4B上的針對(duì)去穩(wěn)定酶抗體的柱上，所述的柱用0.02M tris-HCl緩沖液(pH＝7.4)平衡。酶用溶于0.02M tris-HCl緩沖液(pH＝7.4)的0.3M NaCl洗脫。收集組分。將所得的溶液(8ml，蛋白質(zhì)濃度為0.5mg/ml)施加到含CM-三丙烯酸類吸著劑，用0.02M tris-HCl緩沖液(pH＝7.4)平衡的柱上。去穩(wěn)定酶在NaCl梯度為0.05-0.20M(

圖1)下進(jìn)行洗脫。用Superose-12進(jìn)行凝膠過濾脫鹽。由組分(底物L(fēng)-γ-Glu-pNA)的酰胺分解活性確定對(duì)應(yīng)于去穩(wěn)定酶的峰位置，它為3.10cat/mg(圖2)。
該方法可以使酶純度提高為最初提取液中的2400倍。蛋白質(zhì)的產(chǎn)量為最初蛋白質(zhì)混合物的0.1％。制劑的均一性由聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定。實(shí)施例2將饑餓不少于4個(gè)月的醫(yī)用水蛭搗碎，用生理鹽水提取。將提取液施加到含有固定在瓊脂糖6B上的針對(duì)去穩(wěn)定酶的抗體柱上，所述的柱用0.02M tris-HCl緩沖液(pH＝7.2)平衡。用溶于0.02M tris-HCl緩沖液(pH＝7.2)的0.2M NaCl洗脫去穩(wěn)定酶。合并具有酰胺分解活性的組分(底物ε-γ-Glu-pNa)，然后通過用0.02M tris-HCl緩沖液(pH＝7.2)平衡的含DEAE-交聯(lián)葡聚糖凝膠(Sephadex)A-L50的柱。將所得的組分施加到含CM-纖維素的柱上，用0.02M tris-HCl緩沖液(pH＝6.5)以0.1-0.3M的NaCl梯度進(jìn)行洗脫。
合并具有酰胺分解活性的組分，通過交聯(lián)葡聚糖凝膠(Sephadex)G-25進(jìn)行凝膠過濾脫鹽。
結(jié)果可達(dá)2500倍的純度。去穩(wěn)定酶(底物L(fēng)-γ-Glu-pNA)的最終酰胺分解活性為7.10-9cat/mg。
蛋白質(zhì)的產(chǎn)量為最初蛋白質(zhì)混合物含量的0.12％。酶的均一性用聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定。
通過對(duì)特征為高含量半胱氨酸殘基的基本結(jié)構(gòu)的研究，已獲得了新血栓溶解酶即去穩(wěn)定酶的物理化學(xué)、動(dòng)力學(xué)性能，下述的這些性能可以用來鑒定它的特征。
UV-光譜。在λ＝278nm處有最大吸收的特征。
分子質(zhì)量。單體去穩(wěn)定酶的分子質(zhì)量為12600±300道爾頓(Da)。它是用Superose-12(0.02M tris-HCl，pH＝7.0)柱上的高效凝膠過濾法和含1％SDS的4-16％PAAG的梯度電泳法測定的。
異肽酶活性。異肽酶活性是由酶水解天然底物即穩(wěn)定化纖維蛋白的有限蛋白水解產(chǎn)物(以它的D-片斷(D-D-二聚體)二聚體形式，其中纖維蛋白的γ-γ-鍵之間存在異肽鍵)中的異肽鍵的能力加以測定的(Thromb.Res.，71，1993，Elsevier Science Ltd.，US，pp.241-244)。為此，在10-70小時(shí)內(nèi)用在0.02M tri-HCl緩沖液(pH＝8.0)中的50μg D-D-二聚體與0.1-2.0μg的酶進(jìn)行溫育。溫育混合物的總體積為100μl。反應(yīng)結(jié)果，觀察到在D-D-二聚體中的異肽鍵的水解和D-單體的形成，并可使用PAAG電泳法監(jiān)視其累積過程。業(yè)已確定，新的蛋白質(zhì)引起了穩(wěn)定化纖維蛋白凝塊的溶解，使片斷D二聚體和二異肽γ-Glu-ε-Lys中的γ-Glu-ε-Lys-異肽鍵發(fā)生水解。
酰胺分解活性。酶的酰胺分解活性是根據(jù)Baskova I.P.等人的方法(Biokhimiya，55，1990，Nauka，莫斯科，pp.674-679)通過形成硝基苯胺而水解γ-Glu-pNA中酰胺鍵的能力加以測定的。為此，將10-100μl的酶溶液加入含0.02M tris-HCl緩沖液(pH＝8.0)和0.05mg/ml γ-Glu-pNA、總體積為0.5ml的樣品中，然后在25℃下溫育5-30分鐘。在405nm的波長下用分光光度法對(duì)反應(yīng)進(jìn)行監(jiān)測。
業(yè)已確定，新的酶對(duì)在γ-Glu-丹酰尸胺(dansylcadaverine)中的和在P1位置上含堿性或疏水性氨基酸的胰蛋白酶和糜蛋白酶的低分子量底物中的酰胺鍵有水解作用(Blood Coagulation and Fibrinolysis，2，1990，RapidCommunications of Oxford Ltd.，GB，pp.167-172)。
熱穩(wěn)定性。在22-37℃下80小時(shí)、在7℃下15天和在75℃下15分鐘，酶都能保持活性。
pH穩(wěn)定范圍。pH為1.5-8.5(在37℃下7天，底物γ-Glu-pNA)時(shí)，酶能保持活性。
基本結(jié)構(gòu)。為了鑒定基本結(jié)構(gòu)，在含Agmapoke RP-300(4.5×100)的反相柱上以0-60％的乙腈梯度，在1分鐘內(nèi)對(duì)酶進(jìn)行色譜處理。確定了去穩(wěn)定酶的N-末端序列。鑒定了41個(gè)氨基酸殘基。確定了蘇氨酸為N-末端氨基酸。然后去穩(wěn)定酶發(fā)生CNBr水解，所得的混合物再次在同樣的柱上在同樣的條件下進(jìn)行色譜處理。結(jié)果獲得了四個(gè)肽片斷。完整地確定了第一片斷的氨基酸序列，它由25個(gè)氨基酸殘基組成，在N-末端有一蘇氨酸殘基。
對(duì)于第二片斷，確定了來自N-末端的28個(gè)氨基酸的氨基酸序列，NH2-末端有天冬氨酸。
對(duì)于第三片斷，確定了來自N-末端的24個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列，NH2-末端有天冬氨酸。
對(duì)于第四片斷，確定了來自N-末端的10個(gè)氨基酸殘基和來自C-末端的5個(gè)氨基酸殘基。甘氨酸是N-末端氨基酸。
血栓溶解活性。去穩(wěn)定酶的血栓溶解活性是在動(dòng)物(體重為200g的鼠)實(shí)驗(yàn)中加以分析的。在動(dòng)物的頸靜脈中注射玻璃激活(glass-activated)的血清，隨后在頸靜脈的切面上進(jìn)行(靜脈)停滯處理，從而刺激血栓形成(Circulation，20，1959，American Heart Association，US，pp.864-867)。在靜脈的相應(yīng)切面上施加結(jié)扎線來固定形成的血栓。參照動(dòng)物接受0.2ml生理鹽水的靜脈內(nèi)注射，而實(shí)驗(yàn)動(dòng)物接受含0.72mg蛋白質(zhì)同樣體積的去穩(wěn)定酶溶液的注射。注射制劑67小時(shí)后觀察到血栓溶解達(dá)85％，注射137小時(shí)后達(dá)100％。在動(dòng)物參照組中，注射生理鹽水67小時(shí)后觀察到自發(fā)的血栓溶解達(dá)17％，注射137小時(shí)后達(dá)23％(Blood coagulation and Fibrinolysis，2，1990，Rapid Communications of Oxford Ltd.，GB，pp.167-172)。
工業(yè)應(yīng)用本發(fā)明可作為臨床和實(shí)驗(yàn)藥物的血栓溶解生物活性制劑。
權(quán)利要求
1.一種能水解在合成的底物中、穩(wěn)定的纖維蛋白中和其D-D-片斷中的外-和內(nèi)-ε-(γ-Glu)-Lys-異肽鍵的血栓溶解酶，其特征在于其部分氨基酸序列和與其相應(yīng)的基因及兩個(gè)來自同一家族的附加基因的結(jié)構(gòu)，并且可藉在蛋白質(zhì)基本結(jié)構(gòu)中的15、21、24、28、33、46、49、50位上存在甘氨酸殘基來辨認(rèn)。
2.一種從醫(yī)用水蛭唾液腺分泌物或含這種分泌物的制劑中制備權(quán)利要求1的血栓溶解酶的方法，其特征在于，對(duì)固定在固體載體上的針對(duì)天然酶的抗體進(jìn)行親合色譜處理，隨后用離子交換色譜法和凝膠過濾法對(duì)酶進(jìn)行提純。
全文摘要
一種能水解在合成的底物中、穩(wěn)定的纖維蛋白中和其D-D-片斷中的外-和內(nèi)-ε-(γ-Glu)-Lys-異肽鍵的血栓溶解酶，其部分氨基酸序列和與其相應(yīng)的基因及兩個(gè)來自同一家族的附加基因的結(jié)構(gòu)，并且可藉在蛋白質(zhì)基本結(jié)構(gòu)中的15、21、24、28、33、46、49、50位上存在甘氨酸殘基來辨認(rèn)。一種從醫(yī)用水蛭唾液腺分泌物或含這種分泌物的制劑中制備權(quán)利要求1的血栓溶解酶的方法，對(duì)固定在固體載體上的針對(duì)天然酶的抗體進(jìn)行親合色譜處理，隨后用離子交換色譜法和凝膠過濾法對(duì)酶進(jìn)行提純。
文檔編號(hào)C07K1/18GK1146723SQ95192684
公開日1997年4月2日 申請(qǐng)日期1995年5月25日 優(yōu)先權(quán)日1994年12月23日
發(fā)明者E·D·斯維爾德洛夫, I·P·巴斯科娃, L·L·薩瓦洛娃, S·A·盧基揚(yáng)諾夫, E·V·巴爾索娃, E·A·波格丹諾娃 申請(qǐng)人:M·M·謝苗雅基娜及J·A·奧伏契寧柯娃生物有機(jī)化學(xué)學(xué)院