專利名稱：一種魚腥草水提液及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種魚腥草水提液及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
魚腥草(Houttuynia cordata Thunb)是三白草科蕺菜屬多年生的草本植物。廣泛分布于我國(guó)中部、東南及西南各省區(qū)。魚腥草營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高，是常用的野生蔬菜之一。同時(shí)具有清熱解毒、消癰排膿、利尿通淋的功效，屬于衛(wèi)生部確定的既是藥品又是食品的植物資源。魚腥草化學(xué)成分主要包括揮發(fā)油、生物堿、黃酮類、有機(jī)酸、多糖等成分。其中揮發(fā)油主要成分為癸酰乙醛(魚腥草素)，月桂醛等。生物堿的成分主要有吡啶類生物堿等。黃酮類物質(zhì)包括槲皮素、槲皮苷、異槲皮苷、金絲桃苷、蘆丁等成分。另外，水溶性多糖由葡萄糖、果糖、阿拉伯糖等組成。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)魚腥草的活性研究主要集中在揮發(fā)油和黃酮類化合物上，而對(duì)于魚腥草水溶性成分特別是水溶性多糖成分的生物活性研究較少，對(duì)于魚腥草中多糖類成分抗手足口病病毒 活性的研究國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道。手足口病(Hand, foot and mouth disease, HFMD)是亞太地區(qū)近幾年來(lái)爆發(fā)的嚴(yán)重威脅兒童健康的一種傳染病，主要感染0-5歲嬰幼兒。臨床上主要癥狀包括，手、腳、口唇等黏膜出現(xiàn)水泡性疹子并潰瘍；重癥患者伴有腦膜炎、腦炎、肺水腫、肺出血等甚至死亡。手足口病自2008年在中國(guó)阜陽(yáng)爆發(fā)被衛(wèi)生部列入丙類傳染病以來(lái)，手足口病發(fā)病率和死亡率一直占丙類傳染病首位。另外，臨床上還沒(méi)有針對(duì)手足口病病毒的有效疫苗和藥物，手足口疾病形勢(shì)極其嚴(yán)峻，開發(fā)研究防治手足口病病毒的疫苗和藥物迫在眉睫。腸道病毒71型(Enterovirus71, EV71)和柯薩奇 A16 (Coxsackievirus A16, CVA16)是導(dǎo)致手足口病的兩個(gè)主要病原體，屬于無(wú)包膜的，小RNA腸道病毒。植物特別是可食用的傳統(tǒng)中草藥，具有來(lái)源豐富，價(jià)格低廉、安全低毒等特點(diǎn)，因此，開發(fā)利用植物資源，分離鑒定抗病毒活性成分，開發(fā)抗病毒藥物研究具有巨大的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的問(wèn)題是提供一種魚腥草水提液及其制備方法和在防治手足口病病毒藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明對(duì)魚腥草水提液及水提液中的總多糖進(jìn)行提取、分離以及抗手足口病病毒活性分別進(jìn)行了鑒定，確定抗病毒多糖主要為分子量大于IOOkDa的多糖。因此，可開發(fā)制備成一種防治手足口病病毒藥物。本發(fā)明所述的魚腥草水提液和總多糖的制備方法具體為，魚腥草干葉用去離子水洗凈，烘干，按照植物質(zhì)量和液體體積比為1:10(g/ml)加入去離子水，60° C到90° C水浴保溫2-5小時(shí)，1000g/min離心IOmin獲得濾液，濾渣按同樣方法浸提2次,合并濾液。濾液經(jīng)過(guò)5000g/min離心IOmin, 0.45 μ m濾膜過(guò)濾,去除雜質(zhì),冷凍干燥。水提液中總多糖的提取采用醇沉的方法進(jìn)行沉淀。具體為，水提液中加入4倍體積的無(wú)水乙醇沉淀多糖，于4° C冰箱沉淀過(guò)夜，絮狀沉淀用5000g/min離心20min，保留沉淀，沉淀依次用無(wú)水乙醇、丙酮洗滌3次后，真空干燥得到干燥的魚腥草總多糖。采用硫酸苯酚法對(duì)多糖含量進(jìn)行檢測(cè)。將所得到的水提液和多糖進(jìn)行體外抗病毒活性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)，水提液和總多糖具有顯著地抑制手足口病病毒EV71和CVA16感染的活性，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，活性多糖可以直接滅活EV71病毒顆粒，導(dǎo)致病毒失活無(wú)法進(jìn)一步感染；而活性多糖可以抑制CVA16病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制從而抑制其進(jìn)一步的感染。通過(guò)超濾膜超濾離心，分子量大于IOOkDa的多糖組分被濃縮且抗病毒活性顯著提高。相反，分子量小于IOOkDa的多糖組分抗病毒活性顯著下降。說(shuō)明魚腥草多糖中抗病毒活性成分為分子量大于IOOkDa的多糖。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:1.魚腥草水提液和其中的水溶性多糖具有直接滅活EV71和抑制CVA16復(fù)制的特點(diǎn)，可以通過(guò)外用手段直接阻斷傳染源，滅活病毒感染，保護(hù)易感人群。2.魚腥草水提液及多糖提取工藝簡(jiǎn)單、方便。魚腥草中抗病毒多糖組分進(jìn)一步得到鑒定，為分子量大于IOOkDa的活性多糖。3.魚腥草水提液或總多糖可以單獨(dú)或與其他藥物組分配伍，制備為水劑、顆粒劑、膠囊等作為防治手足口病的藥物。4.魚腥草來(lái)源廣泛，為可食用的傳統(tǒng)中草藥，安全低毒。


圖1.魚腥草多糖抑制病毒感染時(shí)間曲線
■ 一代表終濃度為30 μ g/ml的多糖抑制腸道病毒71型(EV71)的時(shí)間曲線；■■■■■代表終濃度為30 μ g/ml的多糖抑制柯薩奇A16 (CVA16)病毒的時(shí)間曲線；~ 代表感染病毒的時(shí)間點(diǎn)；一代表加入多糖的時(shí)間點(diǎn)。圖2.魚腥草多糖直接孵育病毒對(duì)病毒感染性顆粒釋放的影響 ■代表未處理的病毒組
[3代表去離子水直接孵育的病毒組 H代表終濃度為30 μ g/ml的魚腥草多糖直接孵育的病毒組圖3.超濾離心所得各部分多糖的回收率
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的試驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所使用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑獲得。非洲綠猴腎細(xì)胞VeiO細(xì)胞購(gòu)于上海中科院細(xì)胞庫(kù)?？滤_奇A16 (CVA16)和腸道病毒71型(EV71)標(biāo)準(zhǔn)株BrCr株購(gòu)于武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，腸道病毒71型阜陽(yáng)株從江蘇省疾控中心獲得標(biāo)準(zhǔn)株。實(shí)施例一魚腥草水提液和多糖的提取和檢測(cè) (一)魚腥草水提液和多糖的提取 首先將魚腥草干植物洗凈，低溫烘干至恒重，等分為兩份，一份用于水提液的提取，另一份用于提取魚腥草多糖。按照植物質(zhì)量和液體體積比1:10 (g/ml)加入去離子水，于60° C到90° C水浴保溫2-5小時(shí)，1000g/min離心IOmin獲得上清水提液，沉淀濾渣按同樣的方法浸提2次之后，合并濾液,上清用5000g/min離心IOmin, 0.45 μ m的濾膜進(jìn)行過(guò)濾。上清液體直接冷凍凍干得到魚腥草的水提液凍干粉，或上清水提液加入4倍體積的無(wú)水乙醇用于沉淀多糖，于4° C冰箱中靜置過(guò)夜，有大量的絮狀沉淀物析出，用5000g/min離心20min，獲取沉淀物。沉淀依次用無(wú)水乙醇、丙酮洗滌3次之后，真空干燥得到干燥的魚腥草總多糖。(二)魚腥草多糖含量檢測(cè)
按上述方法提取所得的干燥的魚腥草多糖，稱重并計(jì)算沉淀物得率為2.48%-2.75%，計(jì)算方法為:得率％=(沉淀物質(zhì)量/原植物質(zhì)量)X 100%。沉淀用去離子水復(fù)溶之后，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，用硫酸苯酚法測(cè)定醇沉淀中魚腥草多糖的含量為75.3%-83.1%，多糖含量計(jì)算方法為:多糖含量％= (CXVXN/ff) X 100%，其中C為多糖濃度，V為液體體積，N為稀釋倍數(shù)，W為沉淀質(zhì)量。實(shí)施例二魚腥草水提液和多糖抗手足口病病毒活性檢測(cè)
(一)魚腥草水提液和魚腥草多糖對(duì)細(xì)胞的毒性測(cè)試
于96孔板中培養(yǎng)Vero細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，將上述所得水提液凍干粉和醇沉多糖用去離子水復(fù)溶后，用終濃度分別為I U g/ml、3 μ g/ml、10 μ g/ml>30 μ g/ml、100 μ g/ml、300 μ g/ml、1000 μ g/ml的樣品處理Vero細(xì)胞，設(shè)置三個(gè)復(fù)孔。同時(shí)設(shè)置無(wú)藥物處理的正常對(duì)照組。于37° C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察樣品對(duì)Vero細(xì)胞的毒性，培養(yǎng)72小時(shí)之后，采用經(jīng)典的檢測(cè)細(xì)胞活力的MTT方法測(cè)定樣品對(duì)VeiO細(xì)胞的毒性。具體來(lái)說(shuō)，加入終濃度為
0.5mg/ml的MTT培養(yǎng)細(xì)胞4小時(shí)之后，由于正常的活細(xì)胞能將MTT還原成水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚并沉積在細(xì)胞中，所以通過(guò)去除培養(yǎng)上清后，加入100 μ I的DMSO將甲瓚溶解，用酶標(biāo)儀在570nm處測(cè)定吸光值，將各組細(xì)胞的吸光值減去吸光本底值后，通過(guò)處理組細(xì)胞的吸光值與正常對(duì)照組細(xì)胞的吸光值相比，計(jì)算出魚腥草多糖對(duì)Vero細(xì)胞的半數(shù)毒性濃度CC5tl值，即加入的樣品對(duì)50%的細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞毒性的濃度。CC50值越大說(shuō)明樣品對(duì)VeiO細(xì)胞毒性越小。結(jié)果表明，魚腥草水提液的CC5tl大于1000 μ g/ml，而魚腥草多糖對(duì)Vero細(xì)胞的 CC5。為 548± 11 μ g/ml。(二)魚腥草水提液和多糖抗手足口病病毒活性測(cè)試
根據(jù)測(cè)得的魚腥草水提液和多糖對(duì)VeiO細(xì)胞的CC5tl值，我們接下來(lái)在VeiO細(xì)胞中用終濃度分別為 0.1 μ g/ml, 0.3 μ g/ml, I μ g/ml, 3 μ g/ml, 10 μ g/ml, 100 μ g/ml, 300 μ g/ml,500 μ g/ml的魚腥草水提液和多糖檢測(cè)其抑制手足口病病毒EV71(BrCr株和阜陽(yáng)株)和CVA16感染活性。Vero細(xì)胞于96孔板中長(zhǎng)成單層后，用以上不同濃度的樣品處理Vero細(xì)胞后2小時(shí)，分別用感染復(fù)數(shù)(MOI)為0.3的EV71 (BrCr株和阜陽(yáng)株)和CVA16感染Vero細(xì)胞。每個(gè)處理組設(shè)置三個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置無(wú)藥物處理不感染的正常對(duì)照組以及無(wú)藥物處理的感染組。用顯微鏡直接觀察病毒感染引起的宿主細(xì)胞形態(tài)改變，細(xì)胞變圓，脫落破碎等細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)，并結(jié)合以上所述的MTT方法，于感染72小時(shí)后檢測(cè)細(xì)胞活力，根據(jù)公式(處理組吸光值-未處理感染組吸光值)/ (正常對(duì)照組吸光值-未處理感染組吸光值)X 100%,計(jì)算藥物對(duì)病毒感染的抑制百分比和半數(shù)抑制濃度IC5tl值，IC50值越小，說(shuō)明藥物抑制病毒效果越顯著。結(jié)果如表I所示，魚腥草水提液對(duì)
權(quán)利要求
1.一種魚腥草水提液，其特征是由魚腥草干植物，用60 C到90 C水浴法浸提2-5小時(shí)而得到。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的魚腥草水提液的制備方法，其特征是由以下步驟獲得: (0.稱取魚腥草干植物，用去離子水洗凈，低溫烘干至恒重； (2)按照干植物質(zhì)量和液體體積比為1:10(g/ml)加入去離子水，用60 C-90 C水浴法浸提2-5小時(shí)； (3).通過(guò)1000g/min離心IOmin,獲得上清,濾洛按步驟(2)浸提2次,合并濾液；(4)濾液經(jīng)過(guò)5000g/min離心IOmin后,0.45 μ m濾膜過(guò)濾,去除雜質(zhì)，冷凍干燥。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的魚腥草水提液在制備抗病毒藥物中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所 述的魚腥草水提液在制備治療手足口病病毒藥物中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的魚腥草水提液?jiǎn)为?dú)或與其他藥物配伍制備為水劑或顆粒劑或膠囊。
6.權(quán)利要求1所述的水提液制備的多糖，其特征是由80%乙醇沉淀而得到，產(chǎn)率達(dá)2.4%以上，分子量大于lOOkDa。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述水提液制備的多糖的制備方法，其特征是由以下步驟獲得: (0.權(quán)利要求2所獲得的魚腥草水提液，加入4倍體積的無(wú)水乙醇，于4 C冰箱中靜置過(guò)夜； (2).絮狀物用5000g/min離心20min得到沉淀； (3).沉淀物用無(wú)水乙醇、丙酮洗滌3次后，真空干燥得到干燥的魚腥草總多糖。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的的水提液制備的多糖在制備抗病毒藥物中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的水提液制備的多糖在制備治療手足口病病毒藥物中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的水提液制備的多糖單獨(dú)或與其他藥物配伍制備成水劑或顆粒劑或膠囊。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物制藥技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種魚腥草水提液及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明從魚腥草水提液中獲得的總多糖具有直接滅活或抑制手足口病病毒即腸道病毒71型(EV71)和柯薩奇A16(CVA16)復(fù)制的活性;且進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)抗病毒活性的多糖主要為分子量大于100kDa的多糖。因此，該多糖可以在制備抗手足口病病毒藥物中得到應(yīng)用。作為一種可食用的水生草本植物魚腥草來(lái)源廣泛，毒副作用小，價(jià)格低廉，提取工藝簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，具有重大的開發(fā)和應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C08B37/00GK103070967SQ20131002825
公開日2013年5月1日 申請(qǐng)日期2013年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月25日
發(fā)明者李爾廣, 陳曉慶, 王偉, 金玉 申請(qǐng)人:南京大學(xué)