專利名稱：ε-聚賴氨酸-DOHA原位凝膠粘合材料及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種ε -聚賴氨酸_3，4- 二羥苯基丙酸(DOHA)原位凝膠粘合材料及其制備方法，屬于生物醫(yī)用材料技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
醫(yī)用生物粘合劑近十幾年來得到了迅猛地發(fā)展。傳統(tǒng)的外科手術(shù)縫合治療操作費(fèi)時(shí)，極易發(fā)生組織的炎性反應(yīng)、感染、增生、破裂，甚至出現(xiàn)組織器官的損傷、壞死和不愈合等后果。相比于手術(shù)縫合，醫(yī)用生物粘合劑的優(yōu)勢(shì)在于可以減少傷口的發(fā)炎、感染、缺血壞死和黏連等問題，同時(shí)醫(yī)用生物粘合劑使用方便、簡(jiǎn)單，成本低廉。傳統(tǒng)醫(yī)用粘合劑如氰基丙烯酸酯粘合劑的組織有毒性及劑量致癌性以及纖維蛋白粘合劑的低粘合強(qiáng)度等缺陷迫切需要研究者們開發(fā)合成一種新型的具有生物相容性、生物可降解性、性能穩(wěn)定、粘附性強(qiáng)的組織粘合劑以解決目前的實(shí)際臨床需求。近年來，人們嘗試?yán)谜承栽荒z作為新型生物粘合劑，常見的制備方法有光交聯(lián)、酶催化交聯(lián)、Schiff堿反應(yīng)等。光交聯(lián)方法是在光引發(fā)劑的存在下，通過可見或紫外光照射含有不飽和雙鍵的預(yù)聚物溶液，使預(yù)聚物形成化學(xué)交聯(lián)的網(wǎng)絡(luò)(Rickett TA,Amoozgar Z, Tuchek CA, et al.Biomacromolecules 2011, 12:57-65)。雖然凝膠時(shí)間較短，但是光交聯(lián)反應(yīng)所必需的光引發(fā)劑常常具有細(xì)胞毒性，導(dǎo)致被照射部位的細(xì)胞死亡(Fedorovich NE, Oudshoorn MH, Hennink WE, et al.Biomaterials 2009,30:344-353)。酶催化交聯(lián)方法利用含有可交聯(lián)的酚羥基基團(tuán)的天然或合成蛋白質(zhì)/多肽，在辣根過氧化酶(HRP)和過氧化氫(H2O2)條件下形成化學(xué)交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)(Park KM, Ko KS,Joung YK, et al.Journal of Materials Chemistry 2011, 21:13180-13187)。這種方法不可避免地涉及有毒小分子交聯(lián)劑、H2O2等試劑的使用，水凝膠對(duì)基體的毒性不容忽視。Schiff堿反應(yīng)由于反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)迅速可控，不涉及有毒小分子的加入及其他刺激性反應(yīng)條件，適宜制備生物相容性較好的原位凝膠。現(xiàn)有的利用Schiff堿反應(yīng)制備原位凝膠體系采用巰基化殼聚糖作為交聯(lián)劑與葡聚糖醛反應(yīng)形成交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，該凝膠反應(yīng)迅速，具有一定的機(jī)械強(qiáng)度，但是凝膠粘性較差，且?guī)€基極不穩(wěn)定(Chen WL, Qadeer A, Zhang HW.Biomacromolecules 2011, 12:1428-1437)。另一方面，受到強(qiáng)粘附性海洋貽貝類生物足絲分泌的粘性足絲蛋白(MAP)結(jié)構(gòu)的啟發(fā)，出現(xiàn)了商品化的生物粘合劑Cell-TAK 。它是BD Bioscience公司直接從私edulis中提取生產(chǎn)的天然貽貝粘附蛋白，然而其提取過程復(fù)雜、昂貴，難以滿足實(shí)際需求。鑒于MAP中主要起粘附作用的特殊氨基酸(3，4-二羥基苯丙氨酸，D0PA)含有大量鄰苯二酚基團(tuán)，又出現(xiàn)了貽貝類仿生原位凝膠生物粘合劑。這些仿生凝膠的原材料常采用帶有酚羥基基團(tuán)修飾的聚乙二醇(PEG)分子(Lih E, Lee JS, Park KM, et al.Acta Biomaterialia2012，8:3261-3269)或是采用含有鄰苯二酚基團(tuán)的單體單元聚合物(Matos-P6rez CR,White JD, Wilker JJ, et al.Journal of the A merican Chemical Society 2012,134:9498-9505)。不僅原材料制備過程復(fù)雜，可能會(huì)引入有毒小分子交聯(lián)劑，且凝膠降解速率緩慢。葡聚糖廣泛分布于真菌、細(xì)菌以及植物體內(nèi)，是構(gòu)成細(xì)胞壁的主要結(jié)構(gòu)多糖。葡聚糖基凝膠具有良好的生物相容性和生物可降解性。ε-聚賴氨酸能夠作用于細(xì)菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜系統(tǒng)，抑制細(xì)菌代謝，且在人體內(nèi)分解為賴氨酸，可完全被人體消化吸收。ε -聚賴氨酸帶有的大量正電荷可參與到細(xì)胞活動(dòng)，使細(xì)胞具有吸附、繁殖，分化和促神經(jīng)軸突生長(zhǎng)的作用。采用含有鄰苯二酚基團(tuán)的3，4- 二羥苯基丙酸(DOHA)修飾ε -聚賴氨酸側(cè)鏈的方法模擬貽貝類生物足絲分泌的粘性足絲蛋白，通過Schiff堿反應(yīng)制備貽貝類仿生原位凝膠生物粘合劑，這方面的原位凝膠及制備方法尚未見報(bào)道。3，4-二羥苯基丙酸改性ε-聚賴氨酸制備的原位凝膠生物粘合劑不僅具有貽貝蛋白粘附特性，并且可仿生天然細(xì)胞外基質(zhì)的多糖/多肽的成份、結(jié)構(gòu)及功能特征，在組織粘合、神經(jīng)吻合修復(fù)等領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提出一種ε -聚賴氨酸-3，4- 二羥苯基丙酸(DOHA)原位凝膠粘合材料及其制備方法。所述的原位凝膠具有性能穩(wěn)定、交聯(lián)迅速，以及出色的生物粘合性的特點(diǎn)，其制備方法過程簡(jiǎn)單。本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案加以實(shí)現(xiàn)的，一種ε -聚賴氨酸_3，4-二羥苯基丙酸(DOHA)原位凝膠粘合材料，其特征在于:該原位凝膠粘合材料由下列組分組成，其中葡聚糖醛占凝膠總質(zhì)量的百分?jǐn)?shù)為7 20%，3，4- 二羥苯基丙酸改性聚賴氨酸占凝膠總質(zhì)量的百分?jǐn)?shù)為5 15%，其余組分為水，該原位凝膠粘合材料對(duì)豬皮的粘合強(qiáng)度達(dá)到10.6kPa。上述的ε -聚賴氨酸-3，4- 二羥苯基丙酸原位凝膠粘合材料制備方法，其特征在于包括以下步驟:
1)3,4- 二羥苯基丙酸(DOHA)改性ε -聚賴氨酸的溶液制備: (1)室溫下將1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)粉末和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)粉末溶解于pH=7.2 7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)中，配制成含1_(3_ 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺濃度為0.03、.20g/ml和含N-羥基琥珀酰亞濃度為3 25mg/ml的溶液，攪拌至形成澄清溶液；
(2)室溫下將3，4-二羥苯基丙酸(DOHA)粉末溶解于pH=7.2 .4的磷酸鹽緩沖液(PBS)中，配制成f20mg/ml的溶液，攪拌至形成澄清溶液；
(3)將步驟⑴制得的溶液與步驟(2)制得的溶液按照溶液體積比1:(廣5)混合，攪拌至形成澄清溶液；
(4)將數(shù)均分子量360(Γ4300的ε-聚賴氨酸粉末溶解于ρΗ=7.2 .4的磷酸鹽緩沖液(PBS)中，配制成濃度為f50mg/ml的溶液，攪拌至形成澄清溶液；
(5)將步驟(3)制得的溶液與步驟⑷制得的溶液按照溶液體積比(廣3):1混合，避光持續(xù)攪拌，在pH=5飛的去離子水中透析，凍干后制得取代度在4 20%的3，4- 二羥苯基丙酸改性ε-聚賴氨酸；
(6)將步驟(5)制得的3，4-二羥苯基丙酸改性ε-聚賴氨酸粉末溶于pH值為7.2 .4的磷酸鹽緩沖液(PBS)中，得到濃度為35(T650mg/ml的3，4- 二羥苯基丙酸改性ε -聚賴氨酸溶液；2)葡聚糖醛溶液的制備:
采用葡聚糖氧化度為20 60%的葡聚糖醛溶解于pH=7.2 7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)中，得到濃度為5(T200mg/ml的葡聚糖醛溶液；
3)ε-聚賴氨酸-3，4- 二羥苯基丙酸原位凝膠的制備:
在25 37°C下，將步驟I)制得的3，4- 二羥苯基丙酸改性ε _聚賴氨酸溶液和步驟2)制得的葡聚糖醛溶液按照溶液體積比1: (2 11)均勻混合，在5(T900s內(nèi)形成ε -聚賴氨酸-3，4- 二羥苯基丙酸原位凝膠粘合材料。本發(fā)明具有以下的優(yōu)點(diǎn):制備條件溫和，反應(yīng)可控，制備過程簡(jiǎn)單，原材料均采用天然生物材料，成本低廉，簡(jiǎn)單易得。本發(fā)明提出的化學(xué)交聯(lián)凝膠通過Schiff堿反應(yīng)形成凝膠，最快可在50s內(nèi)完成。通過改變組分(葡聚糖醛)的分子量和濃度，能夠?qū)υ荒z形成速度以及凝膠的機(jī)械強(qiáng)度進(jìn)行調(diào)節(jié)。通過改變組分(3，4- 二羥苯基丙酸)的濃度，能夠?qū)υ荒z的粘合強(qiáng)度進(jìn)行調(diào)節(jié)。本發(fā)明提供的ε -聚賴氨酸-3，4-二羥苯基丙酸原位凝膠，可仿生天然貽貝蛋白粘附特性，在水環(huán)境中展現(xiàn)出優(yōu)異的粘附性能，對(duì)豬皮的粘合強(qiáng)度可達(dá)到10.6kPa。且交聯(lián)過程中不添加任何小分子，具有良好的生物相容性和生物可降解性，可作為生物醫(yī)學(xué)組織粘合劑應(yīng)用于多種醫(yī)學(xué)狀況，如腦神經(jīng)系統(tǒng)手術(shù)、骨外科手術(shù)、軟骨和關(guān)節(jié)軟骨的愈合、皮膚的粘合、胃腸道器官以及周圍神經(jīng)的吻合等。


圖1為實(shí)施例1葡聚糖醛溶液和ε -聚賴氨酸-3，4- 二羥苯基丙酸溶液的混合液尚未形成凝膠狀態(tài)時(shí)的照片。圖2為實(shí)施例1葡聚糖醛溶液和ε -聚賴氨酸-3，4_ 二羥苯基丙酸溶液的混合液形成凝膠狀態(tài)時(shí)的照片。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:
稱取Ig數(shù)均分子量100000的葡聚糖粉末溶解在80ml去離子水中，室溫?cái)嚢柚镣耆芙猓环Q取790mg的NaIO4粉末溶解在25ml去離子水中，攪拌至完全溶解；將NaIO4溶液加入到葡聚糖溶液中，避光，以攪拌速率200rpm持續(xù)攪拌24h ;向NaIO4和葡聚糖混合溶液中加入395mg的二甘醇，室溫?cái)嚢鐸h ;反應(yīng)完畢后，以去離子水為介質(zhì)透析72h，凍干后制得氧化度為42%的葡聚糖醛。將葡聚糖醛樣品溶解于pH=7.2 .4的磷酸鹽緩沖液中，配制成濃度為200mg/ml的葡聚糖溶液；
稱取1.5g數(shù)均分子量4000的ε -聚賴氨酸粉末溶解于ρΗ=7.2 .4的磷酸鹽緩沖液50ml中，在40°C 50°C攪拌至形成澄清溶液；稱取1.2g的1_(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)粉末和140mg的N-羥基琥珀酰亞胺粉末溶解于20ml的pH=7.2 7.4的磷酸鹽緩沖液中，攪拌至澄清溶液；稱取220mg的3，4- 二羥苯基丙酸粉末溶解于pH=7.2 .4的磷酸鹽緩沖液50ml中，攪拌直至形成澄清溶液；將3，4-二羥苯基丙酸溶液與ε-聚賴氨酸溶液混合，用lmol/L的鹽酸溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)混合溶液至pH=5飛。將混合溶液置于避光環(huán)境，在室溫下以200rpm的速率攪拌12小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)物在pH=6的環(huán)境中避光透析72h，凍干。制備的3，4-二羥苯基丙酸改性的聚賴氨酸取代度6%。將該產(chǎn)物溶液ρΗ=7.1 1.4的磷酸鹽緩沖液中，配制成濃度為500mg/ml的ε -聚賴氨酸-DOHA溶液；
在37°C下，將9ml制得的葡聚糖醛溶液和3ml制得的ε -聚賴氨酸-DOHA溶液均勻混合,經(jīng)50s形成13.4g的ε -聚賴氨酸-DOHA原位凝膠,該原位凝膠粘合材料對(duì)豬皮的粘合強(qiáng)度達(dá)到10.6kPa。實(shí)施例2:
稱取2g數(shù)均分子量70000的葡聚糖粉末溶解在160ml去離子水中，室溫?cái)嚢柚镣耆芙?；稱取1.8g的NaIO4粉末溶解在54ml去離子水中，攪拌至完全溶解；將NaIO4溶液加入到葡聚糖溶液中，避光，以攪拌速率200rpm持續(xù)攪拌24h ;向NaIO4和葡聚糖混合溶液中加入790mg的二甘醇，室溫?cái)嚢鐸h ;反應(yīng)完畢后，以去離子水為介質(zhì)透析72h，凍干后制得氧化度為45%的葡聚糖醛。將葡聚糖醛樣品溶解于pH=7.2 .4的磷酸鹽緩沖液中，配制成濃度為150mg/ml的葡聚糖溶液；
取1.5g數(shù)均分子量4000的ε -聚賴氨酸粉末溶解于ρΗ=7.2^7.4的磷酸鹽緩沖液65ml中，在40°C 50°C攪拌至形成澄清溶液；稱取2.3g的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)粉末和280mg的N-羥基琥珀酰亞胺粉末溶解于26ml的pH=7.2^7.4的磷酸鹽緩沖液中，攪拌至澄清溶液；稱取437mg的3，4- 二羥苯基丙酸粉末溶解于pH=7.2 .4的磷酸鹽緩沖液45ml中，攪拌直至形成澄清溶液；將3，4-二羥苯基丙酸溶液與ε -聚賴氨酸溶液混合，用lmol/L的鹽酸溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)混合溶液至pH=5飛。將混合溶液置于避光環(huán)境，在室溫下以200rpm的速率攪拌12小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)物在pH=6的環(huán)境中避光透析72h，凍干。制備的3，4-二羥苯基丙酸改性的聚賴氨酸取代度11%。將該產(chǎn)物溶液pH=7.2 7.4的磷酸鹽緩沖液中，配制成濃度 為540mg/ml的ε -聚賴氨酸-DOHA溶液；
在37°C下，將0.4ml制得的葡聚糖醛溶液和0.1ml制得的ε -聚賴氨酸-DOHA溶液均勻混合，經(jīng)75s形成613mg的ε -聚賴氨酸-DOHA原位凝膠,該原位凝膠粘合材料對(duì)豬皮的粘合強(qiáng)度達(dá)到7.4kPa。實(shí)施例3:
稱取3g數(shù)均分子量40000的葡聚糖粉末溶解在240ml去離子水中，室溫?cái)嚢柚镣耆芙?；稱取2.4g的NaIO4粉末溶解在76ml去離子水中，攪拌至完全溶解；將NaIO4溶液加入到葡聚糖溶液中，避光，以攪拌速率200rpm持續(xù)攪拌24h ；向NaIO4和葡聚糖混合溶液中加入1.2g的二甘醇，室溫?cái)嚢鐸h ;反應(yīng)完畢后，以去離子水為介質(zhì)透析72h，凍干后制得氧化度為48%的葡聚糖醛。將葡聚糖醛樣品溶解于pH=7.2 .4的磷酸鹽緩沖液中，配制成濃度為180mg/ml的葡聚糖溶液；
取1.5g數(shù)均分子量4000的ε -聚賴氨酸粉末溶解于ρΗ=7.2 .4的磷酸鹽緩沖液60ml中，在40°C 50°C攪拌至形成澄清溶液；稱取3.5g的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)粉末和415mg的N-羥基琥珀酰亞胺粉末溶解于40ml的pH=7.2^7.4的磷酸鹽緩沖液中，攪拌至澄清溶液；稱取655mg的3，4- 二羥苯基丙酸粉末溶解于pH=7.2 .4的磷酸鹽緩沖液40ml中，攪拌直至形成澄清溶液；將3，4-二羥苯基丙酸溶液與ε -聚賴氨酸溶液混合，用lmol/L的鹽酸溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)混合溶液至pH=5飛。將混合溶液置于避光環(huán)境，在室溫下以200rpm的速率攪拌12小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)物在pH=6的環(huán)境中避光透析72h，凍干。制備的3，4-二羥苯基丙酸改性的聚賴氨酸取代度19%。將該產(chǎn)物溶液pH=7.2 7.4的磷酸鹽緩沖液中，配制成濃度為630mg/ml的ε -聚賴氨酸-DOHA溶液；在37°C下，將4ml制得的葡聚糖醛溶液和1.5ml制得的ε -聚賴氨酸-DOHA溶液均勻混合，經(jīng)367s形成7.1g的ε -聚賴氨酸-DOHA原位凝膠, 該原位凝膠粘合材料對(duì)豬皮的粘合強(qiáng)度達(dá)到6.9kPa。
權(quán)利要求
1.一種ε-聚賴氨酸-3，4-二羥苯基丙酸的原位凝膠粘合材料，其特征在于:該原位凝膠粘合材料由下列組分組成，其中葡聚糖醛占凝膠總質(zhì)量的百分?jǐn)?shù)為7 20%，3，4-二羥苯基丙酸改性聚賴氨酸占凝膠總質(zhì)量的百分?jǐn)?shù)為5 15%，其余組分為水，該原位凝膠粘合材料對(duì)豬皮的粘合強(qiáng)度達(dá)到10.6kPa。
2.一種按權(quán)利要求1所述的ε-聚賴氨酸-3，4-二羥苯基丙酸原位凝膠粘合材料制備方法，其特征在于包括以下步驟: 1)3,4-二羥苯基丙酸改性的ε -聚賴氨酸的溶液制備: (1)室溫下將1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺粉末和N-羥基琥珀酰亞胺粉末溶解于PH=7.2 .4的磷酸鹽緩沖液中，配制成含1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺濃度為0.03、.20g/ml和含N-羥基琥珀酰亞濃度為3 25mg/ml的溶液，攪拌至形成澄清溶液； (2)室溫下將3，4-二羥苯基丙酸粉末溶解于pH=7.2 .4的磷酸鹽緩沖液中，配制成r20mg/ml的溶液，攪拌至形成澄清溶液； (3)將步驟⑴制得的溶液與步驟(2)制得的溶液按照溶液體積比1:(廣5)混合，攪拌至形成澄清溶液； (4)將數(shù)均分子量360(Γ4300的ε-聚賴氨酸粉末溶解于ρΗ=7.2 .4的磷酸鹽緩沖液(PBS)中，配制成濃度為f50mg/ml的溶液，攪拌至形成澄清溶液； (5)將步驟(3)制得的溶液與步驟⑷制得的溶液按照溶液體積比(廣3):1混合，避光持續(xù)攪拌，在pH=5飛的去離子水中透析，凍干后制得取代度在4 20%的3，4- 二羥苯基丙酸改性的聚賴氨酸； (6)將步驟(5)制得的3，4-二羥苯基丙酸改性的聚賴氨酸粉末溶于pH值為7.2 .4的磷酸鹽緩沖液中，得到濃度為35(T650mg/ml的3，4- 二羥苯基丙酸改性ε -聚賴氨酸溶液； 2)葡聚糖醛溶液的制備: 采 用葡聚糖氧化度為20飛0%的葡聚糖醛溶解于ρΗ=7.2 .4的磷酸鹽緩沖液中，得到濃度為5(T200mg/ml的葡聚糖醛溶液； 3)ε-聚賴氨酸-3，4- 二羥苯基丙酸原位凝膠的制備: 在25 37°C下，將步驟I)制得的3，4- 二羥苯基丙酸改性的聚賴氨酸溶液和步驟2)配制的葡聚糖醛溶液按照溶液體積比1: (2 11)的比例均勻混合，在5(T900s內(nèi)形成ε -聚賴氨酸_3，4- 二羥苯基丙酸原位凝膠粘合材料。
全文摘要
本發(fā)明公開了ε-聚賴氨酸-3,4-二羥苯基丙酸原位凝膠粘合材料及其制備方法。該原位凝膠粘合材料由葡聚糖醛和3,4-二羥苯基丙酸改性聚賴氨酸及水組成。其制備過程包括合成3,4-二羥苯基丙酸改性的ε-聚賴氨酸，以PBS為溶劑配制ε-聚賴氨酸-3,4-二羥苯基丙酸溶液；以PBS為溶劑配制葡聚糖醛溶液；將兩種溶液于生理pH值條件下均勻混合形成原位凝膠。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于，采用天然生物材料，成本低廉，過程簡(jiǎn)單，反應(yīng)迅速可控，制得的材料具有良好的粘合性能、生物相容性和生物可降解性。作為生物醫(yī)學(xué)組織粘合劑在組織粘合、神經(jīng)吻合修復(fù)等領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C08J3/24GK103223190SQ20131014964
公開日2013年7月31日 申請(qǐng)日期2013年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月26日
發(fā)明者趙瑾, 蔣瑞, 袁曉燕 申請(qǐng)人:天津大學(xué)