一種綠色木霉突變株的培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及微生物培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種綠色木霉突變株的培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 綠色木霉(Trichoderma viride)為半知菌，屬一類廣布型真菌口半知菌亞口、絲 抱菌綱、絲抱目、粘抱菌類、木霉屬。該菌類常腐生于木材、種子和植物殘體上，能產(chǎn)生多種 具有生活性物質(zhì)（如纖維素酶、幾下質(zhì)酶等物質(zhì)），通過產(chǎn)生并分泌于胞外，殺死±壤中的有 害菌物。
[0003] 由于綠色木霉可在多種營養(yǎng)基質(zhì)上快速生長，對多種植物病原菌又重寄生作用， 能有效地競爭營養(yǎng)和生存空間，還可W產(chǎn)生抗生素和攻擊多種病原所需要的酶，所W被認(rèn) 為是一種很有開發(fā)潛力的生防菌。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種綠色木霉突變株的培養(yǎng)方法，利用化學(xué)誘變對從腐爛 的木材殘體上混合菌物篩選的綠色木霉進(jìn)行化學(xué)誘變，誘導(dǎo)出的綠色木霉突變株具有高效 抗小麥赤霉病、草替和番茄灰霉病等±傳病的作用。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
[0006] -種綠色木霉突變株的培養(yǎng)方法，包括W下步驟：
[0007] (1)綠色木霉菌株的培養(yǎng)與純化:先從野外植物腐爛殘體的水溶液取樣，于26 °C接 種于PDA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)3~5天，篩選并鑒定出綠色木霉菌株，經(jīng)二代連續(xù)培養(yǎng)出純化綠 色木霉困株；
[000引（2)純化綠色木霉菌株的擴(kuò)大培養(yǎng):純化綠色木霉菌株再經(jīng)液態(tài)PDA培養(yǎng)基中擴(kuò)大 培養(yǎng)，離屯、去清液，測定活性，再用二級純水洗涂，W8000r/min離屯、15min，取沉淀并重復(fù)一 次擴(kuò)大培養(yǎng)，離屯、去清液，測定活性，再用二級純水洗涂，WSOOOr/min離屯、15min，取沉淀吹 干后保存于冰箱暗處；
[0009] (3)純化綠色木霉菌株的誘變:將步驟(2)中離屯、后的清液放入PDA培養(yǎng)基中，再 W幾下質(zhì)或者結(jié)晶簇酸纖維素鋼為反應(yīng)底物，W秋水仙堿或者硫酸二乙醋作為誘變劑，進(jìn) 行誘變，誘變終止后，經(jīng)離屯、取沉淀物，置于暗處穩(wěn)定4~化，即得綠色木霉突變株;其中誘 變劑的濃度為0.005~0.0 Swt % ;誘變時間為6~12化。
[0010] 作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案:所述步驟(2)中，按照重量百分比，液態(tài)PDA培養(yǎng)基由W 下物質(zhì)配置而成：馬鈴馨2~3%;魚蛋白粉0.5~3.3% ;FeS〇4〇.〇l~〇.〇3%;K也P040.02~ 0.20% ;MgS〇4〇.05~0.35% ;Na2B2〇7 ? 10出0 0.025~0.05% ;Na2Se〇3〇.025~0.05%， aiS〇4〇.〇l ~0.02%，余量為水。
[0011] 作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案:所述液態(tài)PDA培養(yǎng)基的pH值調(diào)至5.8~6.5，培養(yǎng)溫度為 27 ±1. (TC,培養(yǎng)時間為5天。
[0012] 作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案:所述步驟(3)中，按照反應(yīng)底物與發(fā)酵物的質(zhì)量體積比 為lOg/L，添加反應(yīng)底物。
[0013] 作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案:所述步驟(3)中，誘變劑的濃度為0.01~0.05wt %，誘 變時間為30~SOh。
[0014] 作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案:所述步驟(3)中，誘變劑的濃度為0.03wt %，誘變時間 為48~6化。
[0015] 作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案:所述步驟(3)中，誘變劑的濃度為0.03wt %，誘變時間 為4她。
[0016] 作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案:還包括(4)綠色木霉突變株的鑒定，加入濃度為0.5~ 1.5wt%的薦糖作引子，啟動抱子的萌發(fā)。
[0017] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：
[0018] 本發(fā)明利用化學(xué)誘變對從腐爛的木材殘體上混合菌物篩選的綠色木霉進(jìn)行化學(xué) 誘變，誘導(dǎo)出的綠色木霉突變株具有高效抗小麥赤霉病、草替和番茄灰霉病等±傳病的作 用，可代替化學(xué)農(nóng)藥運(yùn)用于農(nóng)作物的種植，防治由±壤所產(chǎn)生的病害，實(shí)現(xiàn)作物增產(chǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例，對本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述， 顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中 的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實(shí)施例， 都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0020] 實(shí)施例1
[0021] 本發(fā)明實(shí)施例中，一種綠色木霉突變株的培養(yǎng)方法，包括W下步驟：
[0022] (1)綠色木霉菌株的培養(yǎng)與純化:先從野外植物腐爛殘體的水溶液取樣，于26°C接 種于PDA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)3~5天，對照國家微生物菌庫所公布圖樣M1、M2進(jìn)行篩選鑒定 后，經(jīng)二代連續(xù)培養(yǎng)出純化綠色木霉菌株；
[0023] (2)純化綠色木霉菌株的擴(kuò)大培養(yǎng):步驟（1)制得的純化綠色木霉菌株再經(jīng)液態(tài) PDA培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，離屯、去清液(保留冰箱4°C)，測定活性（目的在于鑒別菌物特征功能 強(qiáng)弱，W供開發(fā)應(yīng)用參考），再用二級純水洗涂，W8000r/min離屯、15min，取沉淀并重復(fù)一次 擴(kuò)大培養(yǎng)，離屯、去清液(保留冰箱4°C)，測定活性，再用二級純水洗涂，W8000r/min離屯、 15min，取沉淀吹干后保存于冰箱暗處，W保障菌物優(yōu)良特征改變較??；
[0024] 其中，液態(tài)PDA培養(yǎng)基，按照重量百分比由W下物質(zhì)配置而成：馬鈴馨2~3% ;魚蛋 白粉0.5~3.3% ;FeS〇4〇.01 ~0.03% ;K出P040.02~0.20% ;MgS〇4〇.05~0.35% ;Na2B2〇7 ? 10此00.025~0.05 % ;Na2Se〇3〇. 025~0.05 %，ZnS〇4〇. 01 ~0.02 %，余量為水。所述液態(tài)PDA 培養(yǎng)基的pH值調(diào)至5.8~6.5，培養(yǎng)溫度為27 ± 1. (TC，培養(yǎng)時間為5天。
[0025] (3)純化綠色木霉菌株的誘變:將步驟(2)中離屯、后的清液放入PDA培養(yǎng)基中，W幾 下質(zhì)或者結(jié)晶簇酸纖維素鋼為反應(yīng)底物(其中幾下質(zhì)的添加量是單獨(dú)按照發(fā)酵物體積容量 配制（lOg/L)加入發(fā)酵容器內(nèi)，結(jié)晶簇酸纖維素鋼的加入也是單獨(dú)按照發(fā)酵物體積容量配 審iJ(l〇g/L)加入發(fā)酵容器內(nèi)），W化學(xué)誘變劑一一秋水仙堿或者硫酸二乙醋作為誘變劑，進(jìn) 行誘變，其中誘變劑的濃度為0.005~0.0 Swt % ;誘變時間為6~12化，誘變終止后，經(jīng)離屯、 取沉淀物，即為綠色木霉突變株，置于暗處穩(wěn)定4~化，避免遇光恢復(fù)突變而導(dǎo)致失??；
[0026] (4)綠色木霉突變株的鑒定:鑒定檢測菌物時加薦糖(濃度0.5~1.5wt%)作引子， 啟動抱子的萌發(fā)。
[0027] 本發(fā)明實(shí)施例中，按照誘變劑的濃度依設(shè)計六個水平（0.005wt %、0.0 Iwt %、 0.02wt %、0.04wt %、0.06wt %、0.0 Swt % )，分水平加入PDA培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)基因發(fā)生，密碼 缺陷，導(dǎo)致相關(guān)主要功能酶信息不能表達(dá);誘變時間長短按所設(shè)計的9個因素(6h、12h、24h、 3化、4化、6化、7化、9化、120h)控制，具體的設(shè)計如表1所示。
[00%]其中，PDA培養(yǎng)基的具體制備步驟為:去皮馬鈴馨600g，切碎加水200ml煮沸30分鐘 后趁熱用240目濾布過濾去濾渣留汁;碎米慷45g，加水150ml煮沸40分鐘，用前述濾布過濾 去渣留汁，與前濾液合并量體積，加薦糖60g，蜂蜜(最佳槐蜜或向日葵蜜)90g，酵母粉15g， 按照幾下質(zhì)與發(fā)酵物的質(zhì)量體積比為lOg/L的比例添加膠態(tài)幾下質(zhì)，注入粉針劑青霉素1 瓶，再加水至化，滅菌。
[0029] 表1誘變劑的濃度和誘變時間的設(shè)計
[0030]

[0031] 經(jīng)過化學(xué)誘變劑的誘變后，W綠色木霉細(xì)胞增加為特征進(jìn)行檢測。因微生物很小， 它生長過程計數(shù)是W細(xì)胞的分裂數(shù)"1個變2個，2個變4個，呈規(guī)律增加及細(xì)胞外表色澤 確定吸收波長，外表是綠色，選擇吸光度A645nm，然后根據(jù)下面公式計算：
[0032] A = QCL (1)
[0033] 式中，a為比例常數(shù);C為單位面積細(xì)胞數(shù)(或溶液中細(xì)胞存在產(chǎn)生透光率）；L為計 算后的面積(一般為1而忽略）。
[0034] 在口出％7.2、0.05111〇1幾的憐酸緩沖液中的吸收光系數(shù)為82.04，即可列出上述式 (1)。
[0035] A663 = 16.75XaC (2)
[0036] 根據(jù)式（1)列出的A，代入上式(2)求出表2中各水平的抱子數(shù)或產(chǎn)生的透光率如表 2,其中Wb5為最佳，結(jié)合表1，誘變時間為4她最佳。
[0037] 表2木霉抱子(即細(xì)胞每cm2)增加的方差分析結(jié)果
[00；3 引

[0039] 本發(fā)明利用化學(xué)誘變對從腐爛的木材殘體上混合菌物篩選的綠色木霉進(jìn)行化學(xué) 誘變，誘導(dǎo)出的綠色木霉突變株具有高效抗小麥赤霉病、草替和番茄灰霉病等±傳病的作 用，可代替化學(xué)農(nóng)藥運(yùn)用于農(nóng)作物的種植，防治由±壤所產(chǎn)生的病害，實(shí)現(xiàn)作物增產(chǎn)。
[0040] 對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實(shí)施例的細(xì)節(jié)，而且在 不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠W其他的具體形式實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。因此，無論 從哪一點(diǎn)來看，均應(yīng)將實(shí)施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權(quán) 利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權(quán)利要求的等同要件的含義和范圍內(nèi)的所有 變化囊括在本發(fā)明內(nèi)。
[0041] 此外，應(yīng)當(dāng)理解，雖然本說明書按照實(shí)施方式加 W描述，但并非每個實(shí)施方式僅包 含一個獨(dú)立的技術(shù)方案，說明書的運(yùn)種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng) 將說明書作為一個整體，各實(shí)施例中的技術(shù)方案也可W經(jīng)適當(dāng)組合，形成本領(lǐng)域技術(shù)人員 可W理解的其他實(shí)施方式。
【主權(quán)項】
1. 一種綠色木霉突變株的培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 綠色木霉菌株的培養(yǎng)與純化:先從野外植物腐爛殘體的水溶液取樣，于26 °C接種于 roA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)3~5天，篩選并鑒定出綠色木霉菌株，經(jīng)二代連續(xù)培養(yǎng)出純化綠色木 霉菌株； (2) 純化綠色木霉菌株的擴(kuò)大培養(yǎng):純化綠色木霉菌株再經(jīng)液態(tài)PDA培養(yǎng)基中擴(kuò)大培 養(yǎng)，離心去清液，測定活性，再用二級純水洗滌，以8000r/min離心15min，取沉淀并重復(fù)一次 擴(kuò)大培養(yǎng)，離心去清液，測定活性，再用二級純水洗滌，以8000r/min離心15min，取沉淀吹干 后保存于冰箱暗處； (3) 純化綠色木霉菌株的誘變:將步驟(2)中離心后的清液放入TOA培養(yǎng)基中，再以幾丁 質(zhì)或者結(jié)晶羧酸纖維素鈉為反應(yīng)底物，以秋水仙堿或者硫酸二乙酯作為誘變劑，進(jìn)行誘變， 誘變終止后，經(jīng)離心取沉淀物，置于暗處穩(wěn)定4~6h，即得綠色木霉突變株;其中誘變劑的濃 度為0 · 005~0 · 08wt % ;誘變時間為6~120h。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的綠色木霉突變株的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟(2)中，按 照重量百分比，液態(tài)PDA培養(yǎng)基由以下物質(zhì)配置而成：馬鈴薯2~3%;魚蛋白粉0.5~3.3%; FeS04 0.01~0.03%;KH2P04 0.02~0.20%;MgS04 0.05~0.35%;Na2B207 *10H20 0.025~ 0.05% ;Na2Se〇3 0.025~0.05%，ZnS〇4 0.01 ~0.02%，余量為水。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的綠色木霉突變株的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述液態(tài)PDA培養(yǎng) 基的pH值調(diào)至5.8~6.5，培養(yǎng)溫度為27 ± 1.0°C，培養(yǎng)時間為5天。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的綠色木霉突變株的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟(3)中，按 照反應(yīng)底物與發(fā)酵物的質(zhì)量體積比為1 〇g/L，添加反應(yīng)底物。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的綠色木霉突變株的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟(3)中，誘 變劑的濃度為〇. 01~〇. 〇5wt%，誘變時間為30~80h。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的綠色木霉突變株的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟(3)中，誘 變劑的濃度為〇.〇3wt%，誘變時間為48~60h。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的綠色木霉突變株的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟(3)中，誘 變劑的濃度為〇.〇3wt%，誘變時間為48h。8. 根據(jù)權(quán)利要求1~7任一所述的綠色木霉突變株的培養(yǎng)方法，其特征在于，還包括(4) 綠色木霉突變株的鑒定，加入濃度為0.5~1.5wt %的蔗糖作引子，啟動孢子的萌發(fā)。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種綠色木霉突變株的培養(yǎng)方法，包括：先從野外植物腐爛殘體的水溶液取樣，于26℃接種于PDA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)3～5天，篩選并鑒定出綠色木霉菌株，經(jīng)二代連續(xù)培養(yǎng)出純化綠色木霉菌株；再經(jīng)液態(tài)PDA培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，離心去清液，測定活性，再用二級純水洗滌，離心，取沉淀并重復(fù)一次，吹干后保存于冰箱暗處；將離心后的清液放入PDA培養(yǎng)基中，再以幾丁質(zhì)或者結(jié)晶羧酸纖維素鈉為反應(yīng)底物，以秋水仙堿或者硫酸二乙酯作為誘變劑，進(jìn)行誘變，誘變終止后，經(jīng)離心取沉淀物，置于暗處穩(wěn)定4～6h，即得綠色木霉突變株。該綠色木霉突變株可代替化學(xué)農(nóng)藥運(yùn)用于農(nóng)作物的種植，防治由土壤所產(chǎn)生的病害，實(shí)現(xiàn)作物增產(chǎn)。
【IPC分類】C12N15/01, C12N1/14, C12R1/885
【公開號】CN105713894
【申請?zhí)枴緾N201610049069
【發(fā)明人】李曉白, 蔣立科
【申請人】李曉白