本發(fā)明涉及疫苗中間體的制備方法，具體是指用于制作Y群或者W135群腦膜炎球菌結(jié)合疫苗的中間體的一種腦膜炎球菌莢膜多糖衍生物的制備方法。

背景技術(shù)：

名詞定義

腦膜炎球菌：腦膜炎球菌(meningococcus)的學(xué)名是腦膜炎奈瑟氏球菌(n.meninyitidis)，為流行性腦脊髓膜炎(流腦)的病原菌?，F(xiàn)引起人體病變的菌株分型主要有A群、B群、C群、Y群及W135群。

腦膜炎球菌多糖疫苗：提取特定菌株腦膜炎球菌的細(xì)菌外莢膜多糖，經(jīng)制劑成疫苗，用于預(yù)防該菌株腦膜炎球菌的侵襲感染。

腦膜炎球菌結(jié)合疫苗：提取特定菌株腦膜炎球菌的細(xì)菌外莢膜多糖，將莢膜多糖與特定的蛋白或多肽進(jìn)行偶聯(lián)，制備成結(jié)合物，再經(jīng)制劑成疫苗，用于預(yù)防該菌株腦膜炎球菌的侵襲感染。

莢膜多糖：細(xì)菌細(xì)胞壁外莢膜中的主要成分，可以是同多糖或異多糖。

衍生物：將莢膜多糖經(jīng)過化學(xué)手段修飾，形成易于蛋白或多肽進(jìn)行偶聯(lián)的一種中間體。

衍生率：評價衍生物制備工藝的關(guān)鍵性參數(shù)指標(biāo)，是影響到結(jié)合物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的重要環(huán)節(jié)參數(shù)。

氧乙酰基：許多細(xì)菌莢膜多糖中都存在氧乙?；?，氧乙?；揎棸l(fā)生在多糖合成后，其對細(xì)菌的免疫原性有重要的意義。

由于流腦多糖疫苗在2周歲以下的嬰幼兒體內(nèi)所誘生的抗體持續(xù)時間短，不能誘導(dǎo)免疫記憶，因此只對成人具有持久免疫作用，而對嬰幼兒則無持久免疫作用。因此，采取多次重復(fù)免疫接種，使嬰幼兒安渡腦膜炎流行季。研究表明，流腦多糖疫苗中的莢膜多糖CPS為胸腺非依賴性抗原TI-Ag，采用將多糖與蛋白載體偶聯(lián)，可使胸腺非依賴性抗原TI-Ag轉(zhuǎn)變?yōu)樾叵僖蕾囆钥乖璗D-Ag，從而改變莢膜多糖CPS的抗原性質(zhì)，可增強(qiáng)免疫原性，誘導(dǎo)出免疫記憶，由多糖/蛋白結(jié)合制備的腦膜炎球菌結(jié)合疫苗，簡稱流腦結(jié)合疫苗，能夠?yàn)?歲以下嬰幼兒提供長期抗流腦的免疫作用。

結(jié)合疫苗的制備方法主要分為直接結(jié)合和使用接頭兩類：

直接結(jié)合法，一般限于羧基和具有一級胺基的醛基之間的縮合反應(yīng)(酰胺鍵的形成或酰胺化)，其產(chǎn)物需進(jìn)一步還原才能穩(wěn)定，如還原胺化法(reductive amination)，還原胺化法已成功地用于制備Hib、腦膜炎雙球菌結(jié)合疫苗。

使用接頭法，采用適宜的探頭將蛋白同多糖進(jìn)行橋接偶聯(lián)，進(jìn)而形成穩(wěn)定的結(jié)合物。如碳化二亞胺法，可采用碳化二亞胺ADH作為探頭，在堿性條件下用CNBr活化多糖，然后將活化的多糖與ADH反應(yīng)形成PS-ADH衍生物，之后在EDC的介導(dǎo)下與蛋白載體形成穩(wěn)定的結(jié)合物。CNBr-ADH方法已成功地用于制備痢疾桿菌、傷寒桿菌、腦膜炎雙球菌結(jié)合疫苗、Hib結(jié)合疫苗的。

本文涉及使用接頭法中用于制備Y群或者W135群流腦結(jié)合疫苗的衍生物中間體的一種方法，該衍生物中間體的全稱分別為：Y群腦膜炎球菌莢膜多糖衍生物、W135群腦膜炎球菌莢膜多糖衍生物；

各生物制劑廠家制備腦膜炎球菌莢膜多糖衍生物的工藝及參數(shù)各異，所獲得的衍生物質(zhì)量不盡相同，致使所制備的結(jié)合物，即，流腦結(jié)合疫苗的品質(zhì)難以一致；制備衍生物的衍生工藝是決定結(jié)合物的免疫原性、安全性和收獲率的關(guān)鍵，其難點(diǎn)在于，衍生物的衍生率與氧乙酰基含量呈非線性、此消彼長、難以控制的關(guān)系；

現(xiàn)有技術(shù)在確保氧乙?；糠现袊幍?015版，Y群腦膜炎球多糖氧乙?；恳蟛坏陀?.3mmol/g標(biāo)準(zhǔn)的前提下，所制備的Y群腦膜炎球菌莢膜多糖衍生物的衍生率為0.50％～1.50％，偏低；若將衍生率提高至2.00％，則氧乙?；棵黠@下降至低于標(biāo)準(zhǔn)；

現(xiàn)有技術(shù)在確保氧乙酰基含量符合中國藥典2015版，W135群腦膜炎球多糖氧乙?；恳蟛坏陀?.3mmol/g標(biāo)準(zhǔn)的前提下，所制備的W135群腦膜炎球菌莢膜多糖衍生物的衍生率為0.50％～1.20％，偏低；若將衍生率提高至1.50％，則氧乙?；棵黠@下降至低于標(biāo)準(zhǔn)；因此，現(xiàn)有技術(shù)存在衍生率難以提高的問題與不足。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題與不足，本發(fā)明采用腦膜炎球菌粗制多糖、溴化氰、碳化二亞胺、蒸餾水、乙腈、鹽酸、氯化鈉和氫氧化鈉材料，通過溶液預(yù)備、溶糖、活化、衍生、超濾的制備工藝，在確保氧乙?；糠蠘?biāo)準(zhǔn)的前提下，使腦膜炎球菌莢膜多糖衍生物的衍生率得以提高的技術(shù)方案，提供一種腦膜炎球菌莢膜多糖衍生物的制備方法，旨在使腦膜炎球菌莢膜多糖衍生物的制備，達(dá)到提高衍生率的目的。

本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的：一種腦膜炎球菌莢膜多糖衍生物的制備方法，包括材料和制備工藝，其中：

所述的材料為：

腦膜炎球菌粗制多糖；

溴化氰，分析純；

碳化二亞胺，分析純；

A溶劑，蒸餾水，分析純；

B溶劑，乙腈，分析純；

鹽酸，分析純；

氯化鈉，分析純；

氫氧化鈉，分析純；

所述的制備工藝，包括溶液預(yù)備、溶糖、活化、衍生和超濾，其中：

步驟一、溶液預(yù)備

氯化鈉溶液，0.2mol/l，由氯化鈉與A溶劑配制而成；

C氫氧化鈉溶液，0.1mol/l，由氫氧化鈉與A溶劑配制而成；

D氫氧化鈉溶液，0.5mol/l，由氫氧化鈉與A溶劑配制而成；

鹽酸溶液，0.1mol/l，鹽酸與A溶劑配制而成；

溴化氰溶液，1g/ml，由溴化氰與B溶劑配制而成；

碳化二亞胺溶液，0.1mol/l，由碳化二亞胺與所述氯化鈉溶液配制而成；

步驟二、溶糖

取腦膜炎球菌粗制多糖0.102g，置于燒杯中，加入所述氯化鈉溶液20ml，用磁力攪拌器攪拌，攪拌轉(zhuǎn)速400轉(zhuǎn)/分鐘，攪拌時間30分鐘，獲得多糖溶液；之后，將盛有多糖溶液的燒杯放入水浴鍋中水浴加熱，水浴控溫為23±3℃，用所述C氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)所述多糖溶液的pH值至pH10.80±0.20，獲得J多糖溶液；

步驟三、活化

在水浴控溫23±3℃，攪拌轉(zhuǎn)速400轉(zhuǎn)/分鐘的狀態(tài)下，向燒杯中所述J多糖溶液加入所述溴化氰溶液150μl，進(jìn)行活化反應(yīng)，活化時間30分鐘，此間，用所述D氫氧化鈉溶液控制燒杯中反應(yīng)物的pH值保持pH10.80±0.20，獲得H多糖溶液；之后，用所述鹽酸溶液調(diào)節(jié)所述H多糖溶液的pH值至pH在9.0±0.20，獲得JH多糖溶液；

步驟四、衍生

在水浴控溫23±3℃，攪拌轉(zhuǎn)速400轉(zhuǎn)/分鐘的狀態(tài)下，向燒杯中所述JH多糖溶液加入所述碳化二亞胺溶液20ml，進(jìn)行衍生反應(yīng)，衍生時間15分鐘，此間，用所述D氫氧化鈉溶液控制燒杯中反應(yīng)物的pH值保持pH9.00±0.20，獲得Y多糖溶液；之后，將所述Y多糖溶液移至無菌冷庫內(nèi)，在攪拌轉(zhuǎn)速600轉(zhuǎn)/分鐘，無菌冷庫內(nèi)溫度2～8℃的狀態(tài)下，進(jìn)行低溫?cái)嚢?，低溫?cái)嚢栌脮r16小時，獲得YP多糖溶液；

步驟五、超濾

將YP多糖溶液，用超濾機(jī)及50kD的超濾膜包進(jìn)行6次換膜超濾，超濾后的濃縮液，即為腦膜炎球菌莢膜多糖衍生物。

有益效果

本發(fā)明可用于Y群腦膜炎球菌莢膜多糖衍生物的制備，亦可用于W135群腦膜炎球菌莢膜多糖衍生物的制備，具體為：制備Y群腦膜炎球菌莢膜多糖衍生物時，所述材料中的腦膜炎球菌粗制多糖為Y群腦膜炎球菌粗制多糖；制備W135群腦膜炎球菌莢膜多糖衍生物時，所述材料中的腦膜炎球菌粗制多糖為W135群腦膜炎球菌粗制多糖；

檢測結(jié)果：

用本發(fā)明制備的Y群腦膜炎球菌莢膜多糖衍生物的衍生率為2.12％～3.65％，氧乙?；繛?.32～0.38mmol/g；即，本發(fā)明的衍生率2.12％～3.65％高于現(xiàn)有技術(shù)的0.50％～1.50％，本發(fā)明的氧乙?；?.32～0.38mmol/g符合中國藥典2015版，氧乙?；坎坏陀?.3mmol/g的要求。

用本發(fā)明制備的W135群腦膜炎球菌莢膜多糖衍生物的衍生率為1.62％～2.93％，氧乙?；繛?.31～0.39mmol/g；即，本發(fā)明的衍生率1.62％～2.93％高于現(xiàn)有技術(shù)的0.50％～1.20％，本發(fā)明的氧乙?；?.31～0.39mmol/g符合中國藥典2015版，氧乙?；坎坏陀?.3mmol/g的要求。

上述，本發(fā)明采用腦膜炎球菌粗制多糖、溴化氰、碳化二亞胺、蒸餾水、乙腈、鹽酸、氯化鈉和氫氧化鈉材料，通過溶液預(yù)備、溶糖、活化、衍生、超濾的制備工藝，在確保氧乙?；糠蠘?biāo)準(zhǔn)的前提下，使腦膜炎球菌莢膜多糖衍生物的衍生率得以提高的技術(shù)方案，克服了現(xiàn)有技術(shù)存在衍生率難以提高的問題與不足，所提供的一種腦膜炎球菌莢膜多糖衍生物的制備方法，使腦膜炎球菌莢膜多糖衍生物的制備，達(dá)到了提高衍生率的目的。

實(shí)施例說明

以下通過具體實(shí)施例對本發(fā)明的一種腦膜炎球菌莢膜多糖衍生物的制備方法作進(jìn)一步詳細(xì)說明，所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員可以參照實(shí)施例制得在確保氧乙?；糠蠘?biāo)準(zhǔn)的前提下，腦膜炎球菌莢膜多糖衍生物的衍生率得以提高的Y群腦膜炎球菌莢膜多糖衍生物，或者W135群腦膜炎球菌莢膜多糖衍生物；但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的任何限制。

具體實(shí)施方式

制備條件、設(shè)備

環(huán)境氣壓：一個大氣壓；環(huán)境溫度：15℃；

制備設(shè)施、設(shè)備：無菌室(C+A級)、無菌冷庫、pH計(jì)(FE 20)、磁力攪拌器(RCT basic)、超濾機(jī)(50cm²-50kD)、燒杯、水浴鍋；

實(shí)施例1、

品名：Y群腦膜炎球菌莢膜多糖衍生物

材料：

Y群腦膜炎球菌粗制多糖；

溴化氰，分析純；

碳化二亞胺，分析純；

A溶劑，蒸餾水，分析純；

B溶劑，乙腈，分析純；

鹽酸，分析純；

氯化鈉，分析純；

氫氧化鈉，分析純；

制備工藝依次為：溶液預(yù)備、溶糖、活化、衍生和超濾：

步驟一、溶液預(yù)備

氯化鈉溶液，0.2mol/l，由氯化鈉與A溶劑配制而成；

C氫氧化鈉溶液，0.1mol/l，由氫氧化鈉與A溶劑配制而成；

D氫氧化鈉溶液，0.5mol/l，由氫氧化鈉與A溶劑配制而成；

鹽酸溶液，0.1mol/l，鹽酸與A溶劑配制而成；

溴化氰溶液，1g/ml，由溴化氰與B溶劑配制而成；

碳化二亞胺溶液，0.1mol/l，由碳化二亞胺與所述氯化鈉溶液配制而成；

步驟二、溶糖

取Y群腦膜炎球菌粗制多糖0.101g，置于燒杯中，加入所述氯化鈉溶液20ml，用磁力攪拌器攪拌，攪拌轉(zhuǎn)速400轉(zhuǎn)/分鐘，攪拌時間30分鐘，獲得多糖溶液；之后，將盛有多糖溶液的燒杯放入水浴鍋中水浴加熱，水浴控溫為23±3℃，用所述C氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)所述多糖溶液的pH值至Ph10.80±0.20，獲得J多糖溶液；

步驟三、活化

在水浴控溫23±3℃，攪拌轉(zhuǎn)速400轉(zhuǎn)/分鐘的狀態(tài)下，向燒杯中所述J多糖溶液加入所述溴化氰溶液150μl，進(jìn)行活化反應(yīng)，活化時間20分鐘，此間，用所述D氫氧化鈉溶液控制燒杯中反應(yīng)物的pH值保持pH10.80±0.20，獲得H多糖溶液；之后，用所述鹽酸溶液調(diào)節(jié)所述H多糖溶液的pH值至pH在9.0±0.20，獲得JH多糖溶液；

步驟四、衍生

在水浴控溫23±3℃，攪拌轉(zhuǎn)速400轉(zhuǎn)/分鐘的狀態(tài)下，向燒杯中所述JH多糖溶液加入所述碳化二亞胺溶液20ml，進(jìn)行衍生反應(yīng)，衍生時間15分鐘，此間，用所述D氫氧化鈉溶液控制燒杯中反應(yīng)物的pH值保持pH9.00±0.20，獲得Y多糖溶液；之后，將所述Y多糖溶液移至無菌冷庫內(nèi)，在攪拌轉(zhuǎn)速600轉(zhuǎn)/分鐘，無菌冷庫內(nèi)溫度2～8℃的狀態(tài)下，進(jìn)行低溫?cái)嚢瑁蜏財(cái)嚢栌脮r16小時，獲得YP多糖溶液；

步驟五、超濾

將YP多糖溶液，用超濾機(jī)及50kD的超濾膜包進(jìn)行6次換膜超濾，超濾后獲得的濃縮液，即為Y群腦膜炎球菌莢膜多糖衍生物。

經(jīng)三個批次的檢測，上述的Y群腦膜炎球菌莢膜多糖衍生物的衍生率為2.12％～3.65％，氧乙酰基含量為0.32～0.38mmol/g。

實(shí)施例2、

品名：W135群腦膜炎球菌莢膜多糖衍生物

材料：

W135群腦膜炎球菌粗制多糖；

溴化氰，分析純；

碳化二亞胺，分析純；

A溶劑，蒸餾水，分析純；

B溶劑，乙腈，分析純；

鹽酸，分析純；

氯化鈉，分析純；

氫氧化鈉，分析純；

制備工藝依次為：溶液預(yù)備、溶糖、活化、衍生和超濾：

步驟一、溶液預(yù)備

氯化鈉溶液，0.2mol/l，由氯化鈉與A溶劑配制而成；

C氫氧化鈉溶液，0.1mol/l，由氫氧化鈉與A溶劑配制而成；

D氫氧化鈉溶液，0.5mol/l，由氫氧化鈉與A溶劑配制而成；

鹽酸溶液，0.1mol/l，鹽酸與A溶劑配制而成；

溴化氰溶液，1g/ml，由溴化氰與B溶劑配制而成；

碳化二亞胺溶液，0.1mol/l，由碳化二亞胺與所述氯化鈉溶液配制而成；

步驟二、溶糖

取W135群腦膜炎球菌粗制多糖0.102g，置于燒杯中，加入所述氯化鈉溶液20ml，用磁力攪拌器攪拌，攪拌轉(zhuǎn)速400轉(zhuǎn)/分鐘，攪拌時間30分鐘，獲得多糖溶液；之后，將盛有多糖溶液的燒杯放入水浴鍋中水浴加熱，水浴控溫為23±3℃，用所述C氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)所述多糖溶液的pH值至Ph10.80±0.20，獲得J多糖溶液；

步驟三、活化

在水浴控溫23±3℃，攪拌轉(zhuǎn)速400轉(zhuǎn)/分鐘的狀態(tài)下，向燒杯中所述J多糖溶液加入所述溴化氰溶液150μl，進(jìn)行活化反應(yīng)，活化時間20分鐘，此間，用所述D氫氧化鈉溶液控制燒杯中反應(yīng)物的pH值保持pH10.80±0.20，獲得H多糖溶液；之后，用所述鹽酸溶液調(diào)節(jié)所述H多糖溶液的pH值至pH在9.0±0.20，獲得JH多糖溶液；

步驟四、衍生

在水浴控溫23±3℃，攪拌轉(zhuǎn)速400轉(zhuǎn)/分鐘的狀態(tài)下，向燒杯中所述JH多糖溶液加入所述碳化二亞胺溶液20ml，進(jìn)行衍生反應(yīng)，衍生時間15分鐘，此間，用所述D氫氧化鈉溶液控制燒杯中反應(yīng)物的pH值保持pH9.00±0.20，獲得Y多糖溶液；之后，將所述Y多糖溶液移至無菌冷庫內(nèi)，在攪拌轉(zhuǎn)速600轉(zhuǎn)/分鐘，無菌冷庫內(nèi)溫度2～8℃的狀態(tài)下，進(jìn)行低溫?cái)嚢?，低溫?cái)嚢栌脮r16小時，獲得YP多糖溶液；

步驟五、超濾

將YP多糖溶液，用超濾機(jī)及50kD的超濾膜包進(jìn)行6次換膜超濾，超濾后獲得的濃縮液，即為W135群腦膜炎球菌莢膜多糖衍生物。

經(jīng)三個批次的檢測，上述的W135群腦膜炎球菌莢膜多糖衍生物的衍生率為1.62％～2.93％，氧乙?；繛?.31～0.39mmol/g。