本文描述了用于基于重組的長(zhǎng)dsdna分子組裝的組合物和方法。本文所述的一個(gè)實(shí)施方式是使用重組酶和核酸外切酶使用多個(gè)含有重疊片段的雙鏈dna片段在感受態(tài)宿主細(xì)胞中創(chuàng)建大重組質(zhì)粒的方法。

背景技術(shù)：

1、核酸重組是分子生物學(xué)和生物技術(shù)的核心。重組核酸技術(shù)的實(shí)現(xiàn)效率可以決定某些生物技術(shù)實(shí)施的結(jié)果。進(jìn)行dna組裝的能力或?qū)⒍鄠€(gè)雙鏈dna?(dsdna)片段物理連接在一起以產(chǎn)生較長(zhǎng)的dsdna片段的能力是合成生物學(xué)中的一項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)。

2、需要的是以下方法和組合物，即所述方法和組合物克服當(dāng)前核酸重組技術(shù)的現(xiàn)有挑戰(zhàn)，降低流程的復(fù)雜性，提高dna組裝效率和保真度，同時(shí)降低整體組裝成本。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本文所述的一個(gè)實(shí)施方式是一種將多個(gè)雙鏈dna?(dsdna)片段組裝成共價(jià)結(jié)合的環(huán)狀dsdna分子的方法，所述方法包括：(a)?將多個(gè)不同的dsdna片段與包含核酸外切酶和重組酶的反應(yīng)混合物組合以形成dna反應(yīng)混合物；其中每個(gè)單獨(dú)的dsdna片段包含與獨(dú)立的dsdna片段的末端單鏈核苷酸互補(bǔ)的一個(gè)或多個(gè)末端單鏈核苷酸；(b)?將所述dna反應(yīng)混合物進(jìn)行雜交孵育以形成雜交dna反應(yīng)混合物；(c)?將所述雜交dna反應(yīng)混合物進(jìn)行失活孵育以形成失活dna反應(yīng)混合物；(d)?將所述失活dna反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)宿主細(xì)胞中；以及(e)?在足以將包含所述多個(gè)不同的dsdna片段的一個(gè)或多個(gè)共價(jià)結(jié)合的環(huán)狀dsdna分子進(jìn)行組裝和復(fù)制的條件下孵育轉(zhuǎn)化的感受態(tài)宿主細(xì)胞。在一個(gè)方面，所述重組酶選自來(lái)自噬菌體的uvsx、來(lái)自真核生物的rad51或dmc1、來(lái)自古細(xì)菌的rada或來(lái)自大腸桿菌(e.coli)的reca。在另一方面，所述重組酶是來(lái)自大腸桿菌的reca。在另一方面，所述反應(yīng)混合物還包含atp。在另一方面，所述核酸外切酶是t5核酸外切酶。在另一方面，所述反應(yīng)混合物還包含dna聚合酶和連接酶。在另一方面，所述感受態(tài)宿主細(xì)胞是大腸桿菌細(xì)胞。在另一方面，所述互補(bǔ)的一個(gè)或多個(gè)末端單鏈核苷酸與所述獨(dú)立的dsdna片段的末端單鏈核苷酸重疊約10個(gè)核苷酸至約120個(gè)核苷酸。在另一方面，所述互補(bǔ)的一個(gè)或多個(gè)末端單鏈核苷酸與所述獨(dú)立的dsdna片段的末端單鏈核苷酸重疊約20個(gè)核苷酸至約60個(gè)核苷酸。在另一方面，所述互補(bǔ)的一個(gè)或多個(gè)末端單鏈核苷酸與所述獨(dú)立的dsdna片段的末端單鏈核苷酸重疊約20個(gè)核苷酸至約35個(gè)核苷酸。在另一方面，所述互補(bǔ)的一個(gè)或多個(gè)末端單鏈核苷酸與所述獨(dú)立的dsdna片段的末端單鏈核苷酸重疊約25個(gè)核苷酸至約30個(gè)核苷酸。在另一方面，所述雜交孵育包括約25℃至約50℃的雜交溫度持續(xù)約5分鐘至約120分鐘。在另一方面，所述雜交孵育包括約35℃至約45℃的雜交溫度持續(xù)約10分鐘至約20分鐘。在另一方面，所述雜交孵育包括約42℃的雜交溫度持續(xù)約20分鐘。在另一方面，所述失活孵育包括約60℃至約70℃的失活溫度持續(xù)約5分鐘至約120分鐘。在另一方面，所述失活孵育包括約65℃的失活溫度持續(xù)約20分鐘。在另一方面，所述失活孵育包括低于約5℃的失活溫度持續(xù)約20分鐘。在另一方面，所述反應(yīng)混合物還包含一種或多種擁擠試劑、一種或多種伴侶劑或其組合。在另一方面，所述一種或多種擁擠試劑包括聚乙二醇(peg)。在另一方面，所述一種或多種伴侶劑包括選自以下的二醇或多元醇：取代的直鏈或支鏈亞烷基二醇、季戊四醇、山梨醇、二甘醇、二丙二醇、新戊二醇、丙二醇和乙二醇醚、1,2-乙二醇、1,2-prd、1,3-prd、1,4-丁二醇、1,5-戊二醇、1,6-己二醇、2-甲基-1,3-丙二醇、2,2′-二甲基丙二醇、1,3-丁基乙基丙二醇、甲基丙二醇、甲基戊二醇、丙二醇甲醚、丙二醇乙醚、丙二醇丁醚、二甘醇苯醚、丙二醇苯酚醚、丙二醇甲醚、三丙二醇甲醚、丙二醇異丁基醚、乙二醇甲醚或其組合。在另一方面，所述方法還包括從一個(gè)或多個(gè)感受態(tài)宿主細(xì)胞中分離包含所述多個(gè)不同的dsdna片段的共價(jià)結(jié)合的環(huán)狀dsdna分子。在另一方面，所述方法還包括在從所述感受態(tài)宿主細(xì)胞中進(jìn)行分離后，對(duì)包含所述多個(gè)不同的dsdna片段的共價(jià)結(jié)合的環(huán)狀dna分子進(jìn)行測(cè)序。

2、本文所述的另一實(shí)施方式是一種用于將多個(gè)雙鏈dna?(dsdna)片段組裝成共價(jià)結(jié)合的環(huán)狀dna分子的體系，所述體系包含：(a)?多個(gè)不同的dsdna片段，其中每個(gè)單獨(dú)的dsdna片段包含與獨(dú)立于所述多個(gè)不同的dsdna片段的dsdna片段的末端單鏈核苷酸互補(bǔ)的一個(gè)或多個(gè)末端單鏈核苷酸；(b)?反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含核酸外切酶和重組酶；以及(c)?感受態(tài)宿主細(xì)胞。在另一方面，所述重組酶選自來(lái)自噬菌體的uvsx、來(lái)自真核生物的rad51或dmc1、來(lái)自古細(xì)菌的rada或來(lái)自大腸桿菌的reca。在另一方面，所述重組酶是來(lái)自大腸桿菌的reca。在另一方面，所述反應(yīng)混合物還包含atp。在另一方面，所述核酸外切酶是t5核酸外切酶。在另一方面，所述反應(yīng)混合物還包含dna聚合酶和連接酶。在另一方面，所述感受態(tài)宿主細(xì)胞是大腸桿菌細(xì)胞。在另一方面，所述反應(yīng)混合物還包含一種或多種擁擠試劑、一種或多種伴侶劑或其組合。

3、本文所述的另一實(shí)施方式是一種用于將多個(gè)雙鏈dna?(dsdna)片段組裝成共價(jià)結(jié)合的環(huán)狀dna分子的試劑盒，所述試劑盒包含：(a)?核酸外切酶；(b)?重組酶；(c)?一種或多種緩沖液、擁擠試劑、或伴侶劑、或atp；(d)?任選地，感受態(tài)宿主細(xì)胞；以及(e)?任選地，使用說明書或指示。

4、本文所述的另一實(shí)施方式是核酸外切酶和重組酶用于將多個(gè)雙鏈dna?(dsdna)片段組裝成共價(jià)結(jié)合的環(huán)狀dna分子的用途，包括：(a)?將多個(gè)不同的dsdna片段與包含核酸外切酶和重組酶的反應(yīng)混合物組合以形成dna反應(yīng)混合物，其中每個(gè)單獨(dú)的dsdna片段包含與獨(dú)立于所述多個(gè)不同的dsdna片段的dsdna片段的末端單鏈核苷酸互補(bǔ)的一個(gè)或多個(gè)末端單鏈核苷酸；(b)?將所述dna反應(yīng)混合物進(jìn)行雜交孵育以形成雜交dna反應(yīng)混合物；(c)將所述雜交dna反應(yīng)混合物進(jìn)行失活孵育以形成失活dna反應(yīng)混合物；(d)?將所述失活dna反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)宿主細(xì)胞中；以及(e)?在足以將包含所述多個(gè)不同的dsdna片段的共價(jià)結(jié)合的環(huán)狀dna分子進(jìn)行組裝的條件下孵育轉(zhuǎn)化的感受態(tài)宿主細(xì)胞。

技術(shù)特征：

1.一種將多個(gè)雙鏈dna?(dsdna)片段組裝成共價(jià)結(jié)合的環(huán)狀dsdna分子的方法，所述方法包括：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述重組酶選自來(lái)自噬菌體的uvsx、來(lái)自真核生物的rad51或dmc1、來(lái)自古細(xì)菌的rada或來(lái)自大腸桿菌(e.?coli)的reca。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述重組酶是來(lái)自大腸桿菌的reca。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述反應(yīng)混合物還包含atp。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述核酸外切酶是t5核酸外切酶。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述反應(yīng)混合物還包含dna聚合酶和連接酶。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述感受態(tài)宿主細(xì)胞是大腸桿菌細(xì)胞。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述互補(bǔ)的一個(gè)或多個(gè)末端單鏈核苷酸與所述獨(dú)立的dsdna片段的末端單鏈核苷酸重疊約10個(gè)核苷酸至約120個(gè)核苷酸。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述互補(bǔ)的一個(gè)或多個(gè)末端單鏈核苷酸與所述獨(dú)立的dsdna片段的末端單鏈核苷酸重疊約20個(gè)核苷酸至約60個(gè)核苷酸。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述互補(bǔ)的一個(gè)或多個(gè)末端單鏈核苷酸與所述獨(dú)立的dsdna片段的末端單鏈核苷酸重疊約20個(gè)核苷酸至約35個(gè)核苷酸。

11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述互補(bǔ)的一個(gè)或多個(gè)末端單鏈核苷酸與所述獨(dú)立的dsdna片段的末端單鏈核苷酸重疊約25個(gè)核苷酸至約30個(gè)核苷酸。

12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述雜交孵育包括約25℃至約50℃的雜交溫度持續(xù)約5分鐘至約120分鐘。

13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述雜交孵育包括約35℃至約45℃的雜交溫度持續(xù)約10分鐘至約20分鐘。

14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述雜交孵育包括約42℃的雜交溫度持續(xù)約20分鐘。

15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述失活孵育包括約60℃至約70℃的失活溫度持續(xù)約5分鐘至約120分鐘。

16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述失活孵育包括約65℃的失活溫度持續(xù)約20分鐘。

17.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述失活孵育包括低于約5℃的失活溫度持續(xù)約20分鐘。

18.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述反應(yīng)混合物還包含一種或多種擁擠試劑、一種或多種伴侶劑或其組合。

19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述一種或多種擁擠試劑包括聚乙二醇(peg)。

20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述一種或多種伴侶劑包括選自以下的二醇或多元醇：取代的直鏈或支鏈亞烷基二醇、季戊四醇、山梨醇、二甘醇、二丙二醇、新戊二醇、丙二醇和乙二醇醚、1,2-乙二醇、1,2-prd、1,3-prd、1,4-丁二醇、1,5-戊二醇、1,6-己二醇、2-甲基-1,3-丙二醇、2,2′-二甲基丙二醇、1,3-丁基乙基丙二醇、甲基丙二醇、甲基戊二醇、丙二醇甲醚、丙二醇乙醚、丙二醇丁醚、二甘醇苯醚、丙二醇苯酚醚、丙二醇甲醚、三丙二醇甲醚、丙二醇異丁基醚、乙二醇甲醚或其組合。

21.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，還包括從一個(gè)或多個(gè)感受態(tài)宿主細(xì)胞中分離包含所述多個(gè)不同的dsdna片段的共價(jià)結(jié)合的環(huán)狀dsdna分子。

22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，還包括在從所述感受態(tài)宿主細(xì)胞中進(jìn)行分離后，對(duì)包含所述多個(gè)不同的dsdna片段的共價(jià)結(jié)合的環(huán)狀dna分子進(jìn)行測(cè)序。

23.一種用于將多個(gè)雙鏈dna?(dsdna)片段組裝成共價(jià)結(jié)合的環(huán)狀dna分子的體系，所述體系包含：

24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的體系，其中所述重組酶選自來(lái)自噬菌體的uvsx、來(lái)自真核生物的rad51或dmc1、來(lái)自古細(xì)菌的rada或來(lái)自大腸桿菌的reca。

25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的體系，其中所述重組酶是來(lái)自大腸桿菌的reca。

26.根據(jù)權(quán)利要求23所述的體系，其中所述反應(yīng)混合物還包含atp。

27.根據(jù)權(quán)利要求23所述的體系，其中所述核酸外切酶是t5核酸外切酶。

28.根據(jù)權(quán)利要求23所述的體系，其中所述反應(yīng)混合物還包含dna聚合酶和連接酶。

29.根據(jù)權(quán)利要求23所述的體系，其中所述感受態(tài)宿主細(xì)胞是大腸桿菌細(xì)胞。

30.根據(jù)權(quán)利要求23所述的體系，其中所述反應(yīng)混合物還包含一種或多種擁擠試劑、一種或多種伴侶劑或其組合。

31.一種用于將多個(gè)雙鏈dna?(dsdna)片段組裝成共價(jià)結(jié)合的環(huán)狀dna分子的試劑盒，所述試劑盒包含：

32.核酸外切酶和重組酶用于將多個(gè)雙鏈dna?(dsdna)片段組裝成共價(jià)結(jié)合的環(huán)狀dna分子的用途，包括：

技術(shù)總結(jié)
本文描述了用于基于重組的長(zhǎng)dsDNA分子組裝的組合物和方法。本文所述的一個(gè)實(shí)施方式是使用重組酶和核酸外切酶使用多個(gè)含有重疊片段的雙鏈DNA片段在感受態(tài)宿主細(xì)胞中創(chuàng)建大重組質(zhì)粒的方法。

技術(shù)研發(fā)人員：蒂莫西·塔普斯科特,亞當(dāng)·范格羅斯特
受保護(hù)的技術(shù)使用者：合成DNA技術(shù)公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/11/28