本發(fā)明涉及生物工程，尤其是指一種多酶級聯(lián)轉(zhuǎn)化l-酪氨酸生產(chǎn)酪醇和紅景天苷的方法。

背景技術(shù)：

1、酪醇(tyrosol)是一種具有藥理活性的酚類化合物，是苯乙醇的一種衍生物，是一種單酚類抗氧化劑，有多種天然來源，如橄欖油和綠茶等。酪醇具有很多生理活性功能，如抗氧化、抗疲勞、抗缺氧、抗應(yīng)激、抗寒冷、鎮(zhèn)靜、心血管疾病、高血壓等。酪醇還可以作為酒類的調(diào)味劑，在提升酒類飲料的口感中起著重要的作用，尤其是在清酒、啤酒和葡萄酒中。

2、隨著酪醇生理活性的開發(fā)以及市場需求量的提高，開發(fā)高效的酪醇生產(chǎn)途徑已經(jīng)成為研究的熱點。目前酪醇的制備方法主要包括天然提取法、化學(xué)合成法、生物合成法。天然提取法獲取酪醇提取難度大、過程復(fù)雜，化學(xué)合成法在實際生產(chǎn)中也存在反應(yīng)條件嚴(yán)格、成本高昂和反應(yīng)過程會產(chǎn)生大量污染等問題，兩種方法都不利于酪醇的工業(yè)化生產(chǎn)。以大腸桿菌作為底盤細胞，從酪氨酸出發(fā)合成酪醇的生物合成途徑主要有三條(圖1)，分別是：(1)tdc-tyo途徑，酪氨酸首先在酪氨酸脫羧酶(tdc)的作用下轉(zhuǎn)化為酪胺，再由酪胺氧化酶(tyo)催化生成對羥基苯乙醛，最后被乙醇脫氫酶還原生成酪醇；(2)丙酮酸脫羧途徑，酪氨酸在芳香族氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶的作用下生成對羥基苯丙酮酸，對羥基苯丙酮酸進一步被丙酮酸脫羧酶催化生成對羥基苯乙醛，最后被乙醇脫氫酶還原生成酪醇；(3)aas途徑，該途徑中酪氨酸直接在芳香醛合酶(aas)催化下生成對羥基苯乙醛，再被乙醇脫氫酶還原生成酪醇。

3、紅景天是生長在高寒無污染地帶的珍稀野生植物，是我國藏族人民的習(xí)用藥物，至今已有1000多年的應(yīng)用歷史，具有刺激神經(jīng)系統(tǒng)、增加工作效率、消除疲勞和預(yù)防高山癥等作用。除此之外，紅景天還具有保護心腦血管，神經(jīng)細胞以及抗腫瘤抗輻射等功能。紅景天的主要藥用活性成分是紅景天苷及其苷元酪醇。目前紅景天苷的主要提取方式有天然提取法、化學(xué)合成法、生物合成法三種。天然提取法在現(xiàn)階段面臨原材料價格昂貴、提取效率低、能耗大、損害生產(chǎn)人員的健康是天然提取的主要問題，仍然無法很好適應(yīng)大規(guī)模的生產(chǎn)。盡管化學(xué)合成紅景天苷的純度較高，但有機試劑殘留與廢液的處理導(dǎo)致難以保障生產(chǎn)過程的安全性。因此利用生物合成法生產(chǎn)紅景天苷是目前的研究熱點。

4、糖基轉(zhuǎn)移酶(glycosyltransferase)類(ec2.4.x.y)是在糖基與受體生成特定的糖苷鍵進行連接的一類酶，在生物體中普遍存在。糖基轉(zhuǎn)移酶以核苷二磷酸活化的含糖基化合物作為糖基供體，其中利用尿苷二磷酸葡萄糖作為糖基供體的糖基轉(zhuǎn)移酶最為常見，全稱為udp葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(udp-glucosyltransferases，ugts)利用糖基轉(zhuǎn)移酶實現(xiàn)天然產(chǎn)物的糖基化，有利于提高物質(zhì)的生物活性，更有利于投入到醫(yī)療、保健、美容等領(lǐng)域的應(yīng)用，解決天然途徑獲取糖苷類產(chǎn)物無法滿足需求的問題。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種多酶級聯(lián)轉(zhuǎn)化l-酪氨酸生產(chǎn)酪醇和紅景天苷的方法。為了得到一種高效合成酪醇和紅景天苷的方法，本發(fā)明構(gòu)建了以大腸桿菌為宿主的共表達工程菌，實現(xiàn)了以l-酪氨酸為底物進行酪醇和紅景天苷的高效生產(chǎn)。

2、本發(fā)明通過在大腸桿菌細胞中表達合成酪醇和紅景天苷的路徑酶：酪氨酸脫羧酶、酪胺氧化酶、糖基轉(zhuǎn)移酶，實現(xiàn)了酪醇和紅景天苷的高效生產(chǎn)，為酪醇和紅景天苷的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

3、本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：

4、本發(fā)明第一個目的是提供一種生產(chǎn)酪醇和紅景天苷的重組大腸桿菌，所述重組大腸桿菌為雙質(zhì)粒表達系統(tǒng)表達糖基轉(zhuǎn)移酶、酪氨酸脫羧酶和酪胺氧化酶。

5、在本發(fā)明的一種實施方式中，所述雙質(zhì)粒包括petduet-1質(zhì)粒和pacycduet-1質(zhì)粒。

6、在本發(fā)明的一種實施例中，所述糖基轉(zhuǎn)移酶位于petduet-1質(zhì)粒上，用petduet-1質(zhì)粒表達三個拷貝的糖基轉(zhuǎn)移酶基因；所述酪氨酸脫羧酶和酪胺氧化酶位于pacycduet-1質(zhì)粒上。

7、在本發(fā)明的一種實施例中，所述糖基轉(zhuǎn)移酶來源于紅景天(rhodiola?rosea)，氨基酸序列如seq?id?no.3所示；所述酪氨酸脫羧酶來源于糞腸球菌(enterococcusfaecalis)，氨基酸序列如seq?id?no.5所示；所述酪胺氧化酶來源于藤黃微球菌(micrococcusluteus)，氨基酸序列如seq?id?no.7所示；所述糖基轉(zhuǎn)移酶是將氨基酸序列如seq?id?no.1所示野生糖基轉(zhuǎn)移酶的第158位蘇氨酸突變?yōu)楸彼?，并將?11位酪氨酸突變?yōu)楸彼岬玫健?/p>

8、在本發(fā)明的一種實施例中，所述大腸桿菌為escherichiacolibl21(de3)。

9、本發(fā)明第二個目的是提供一種全細胞催化劑，含有所述重組大腸桿菌。

10、本發(fā)明第三個目的是提供所述重組大腸桿菌或所述全細胞催化劑在制備酪醇和紅景天苷中的應(yīng)用。

11、本發(fā)明第四個目的是提供一種生產(chǎn)酪醇和紅景天苷的方法，包括以下步驟：以l-酪氨酸為底物，采用所述重組大腸桿菌或所述全細胞催化劑為催化劑，催化生產(chǎn)酪醇和紅景天苷。

12、在本發(fā)明的一種實施例中，所述催化生產(chǎn)的溫度為20℃～30℃；時間為48h～50h；菌體od600為30；ph值為7.0～8.0。

13、在本發(fā)明的一種實施例中，所述l-酪氨酸的濃度為20g·l-1～30g·l-1。

14、在本發(fā)明的一種實施例中，所述催化的反應(yīng)體系還包括30mmol·l-1～40mmol·l-1的udpg。

15、本發(fā)明中野生型ugt33的核苷酸序列如seq?id?no.1所示，氨基酸序列如seq?idno.2所示，為了提高糖基轉(zhuǎn)移酶的催化效率，將野生型ugt33的氨基酸序列的第158位蘇氨酸及第311位酪氨酸均突變?yōu)楸彼幔玫酵蛔兒蟮奶腔D(zhuǎn)移酶，氨基酸序列為seq?idno.3所述。

16、本發(fā)明的有益效果：

17、本發(fā)明提供了一種多酶級聯(lián)轉(zhuǎn)化l-酪氨酸生產(chǎn)酪醇和紅景天苷的方法(轉(zhuǎn)化途徑如圖1所示)。本發(fā)明構(gòu)建了一種大腸桿菌重組菌，用于全細胞催化生產(chǎn)酪醇和紅景天苷。該大腸桿菌重組菌同時表達三種酶，分別為糖基轉(zhuǎn)移酶、酪氨酸脫羧酶、酪胺氧化酶，本發(fā)明所述的生產(chǎn)方法通過模塊化組裝和基因重復(fù)表達實現(xiàn)各酶的平衡表達，避免副產(chǎn)物的積累，實現(xiàn)了以l-酪氨酸為底物高效合成酪醇和紅景天苷。

技術(shù)特征：

1.一種生產(chǎn)酪醇和紅景天苷的重組大腸桿菌，其特征在于，所述重組大腸桿菌為雙質(zhì)粒表達系統(tǒng)表達糖基轉(zhuǎn)移酶、酪氨酸脫羧酶和酪胺氧化酶。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組大腸桿菌，其特征在于，所述糖基轉(zhuǎn)移酶位于petduet-1質(zhì)粒上，用petduet-1質(zhì)粒表達三個拷貝的糖基轉(zhuǎn)移酶基因；所述酪氨酸脫羧酶和酪胺氧化酶位于pacycduet-1質(zhì)粒上。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組大腸桿菌，其特征在于，所述糖基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列如seq?id?no.3所示；所述酪氨酸脫羧酶的氨基酸序列如seq?id?no.5所示；所述酪胺氧化酶的氨基酸序列如seq?id?no.7所示；

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組大腸桿菌，其特征在于，所述大腸桿菌為escherichiacolibl21(de3)。

5.一種全細胞催化劑，其特征在于，含有權(quán)利要求1-4任一項所述重組大腸桿菌。

6.權(quán)利要求1-4任一項所述重組大腸桿菌或權(quán)利要求5所述全細胞催化劑在制備酪醇和紅景天苷中的應(yīng)用。

7.一種生產(chǎn)酪醇和紅景天苷的方法，其特征在于，包括以下步驟：以l-酪氨酸為底物，采用權(quán)利要求1-4任一項所述重組大腸桿菌或權(quán)利要求5所述全細胞催化劑為催化劑，催化生產(chǎn)酪醇和紅景天苷。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述催化生產(chǎn)的溫度為20℃～30℃；時間為48h～50h；ph值為7.0～8.0。

9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述l-酪氨酸的濃度為20g·l-1～30g·l-1。

10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述催化的反應(yīng)體系還包括30mmol·l-1～40mmol·l-1的udpg。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及一種多酶級聯(lián)轉(zhuǎn)化L?酪氨酸生產(chǎn)酪醇和紅景天苷的方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明首先將野生糖基轉(zhuǎn)移酶的第158位蘇氨酸突變?yōu)楸彼?，并將?11位酪氨酸突變?yōu)楸彼?，得到氨基酸序列如SEQ?ID?NO.3所示的糖基轉(zhuǎn)移酶。然后構(gòu)建了以大腸桿菌為宿主的共表達工程菌，通過雙質(zhì)粒表達系統(tǒng)表達糖基轉(zhuǎn)移酶、酪氨酸脫羧酶和酪胺氧化酶，實現(xiàn)了以L?酪氨酸為底物進行酪醇和紅景天苷的高效生產(chǎn)。本發(fā)明的生產(chǎn)方法通過模塊化組裝和基因重復(fù)表達實現(xiàn)各酶的平衡表達，避免副產(chǎn)物的積累，實現(xiàn)了以L?酪氨酸為底物高效合成酪醇和紅景天苷，為酪醇和紅景天苷的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

技術(shù)研發(fā)人員：徐美娟,饒志明,熊藝哲,魏晨昱,張顯
受保護的技術(shù)使用者：江南大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/9/9