本發(fā)明涉及生物檢測的，尤其涉及一種貓冠狀病毒s蛋白線性抗原表位、篩選方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、貓冠狀病毒(feline?coronavirus,fcov)是一種對貓類動物健康構(gòu)成重大威脅的病原體。fcov的s蛋白，即表面蛋白，是病毒與宿主細(xì)胞受體結(jié)合的關(guān)鍵因素，也是疫苗設(shè)計和藥物開發(fā)的主要靶標(biāo)。s蛋白在病毒的感染和傳播中起著至關(guān)重要的作用，它不僅介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞的融合，還能誘導(dǎo)宿主細(xì)胞融合，形成多核巨細(xì)胞，進(jìn)而影響宿主細(xì)胞的正常功能。

2、隨著分子生物學(xué)和免疫學(xué)的發(fā)展，抗原表位的研究逐漸成為疫苗設(shè)計和藥物開發(fā)的重要方向?？乖砦皇悄軌虮幻庖呦到y(tǒng)識別和應(yīng)答的特定分子結(jié)構(gòu)，可以是線性的氨基酸序列，也可以是蛋白質(zhì)折疊后形成的特定三維結(jié)構(gòu)。通過識別和利用關(guān)鍵的抗原表位，可以設(shè)計出更加精確和有效的疫苗和藥物。。

3、本發(fā)明人前期通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測分析fcov?s蛋白。根據(jù)親水性、表面極性、抗原性以及二級結(jié)構(gòu)特征等，對s蛋白可能存在的抗原表位區(qū)域進(jìn)行預(yù)測分析，本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)位于s2功能域的一蛋白片段具備良好的反應(yīng)原性和免疫原性(參見專利號為zl20211.449837.4，專利名稱為：一種貓冠狀病毒s重組蛋白及其制備方法的發(fā)明專利)。為了進(jìn)一步篩選出更具有潛在應(yīng)用價值的抗原表位，本案由此產(chǎn)生。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供了一種貓冠狀病毒s蛋白線性抗原表位，可為后續(xù)研究fcov疫苗開發(fā)和藥物設(shè)計提供基礎(chǔ)，所述線性抗原表位的氨基酸序列如seq?id?no：1所示。

2、本發(fā)明還提供了一種貓冠狀病毒s蛋白線性抗原表位的篩選方法，包括以下步驟：

3、(a)將fcov?s蛋白拆分為具有重疊的三個蛋白片段，即fcov-sp1、fcov-sp2和fcov-sp3；利用原核表達(dá)系統(tǒng)對拆分的蛋白片段進(jìn)行體外表達(dá)；對表達(dá)成功的蛋白片段進(jìn)行純化并鑒定其活性；

4、(b)通過間接elisa及western?blot技術(shù)篩選蛋白片段；

5、(c)對篩選出的蛋白片段進(jìn)行氨基酸序列比對和生物信息學(xué)分析，確定其為fcov的線性抗原表位。

6、作為實(shí)施例的優(yōu)選方式，在所述步驟(a)中，所述fcov-sp1蛋白氨基酸位點(diǎn)為1127-1309aa，所述fcov-sp2蛋白氨基酸位點(diǎn)為1127-1218aa，所述fcov-sp3蛋白氨基酸位點(diǎn)為1306?-1400aa。

7、作為實(shí)施例的優(yōu)選方式，在所述步驟(a)中，還包括fcov?sp蛋白引物的設(shè)計及構(gòu)建fcov-sp1、fcov-sp2和fcov-sp3表達(dá)載體的步驟。

8、作為實(shí)施例的優(yōu)選方式，所述fcov?sp蛋白引物的設(shè)計：

9、所述fcov-sp1的上游引物堿基序列如seq?id?no：2所示；所述fcov-sp1的下游引物堿基序列如seq?id?no：3所示；

10、所述fcov-sp2的上游引物堿基序列如seq?id?no：4所示；所述fcov-sp2的下游引物堿基序列如seq?id?no：5所示；

11、所述fcov-sp3的上游引物堿基序列如seq?id?no：6所示；所述fcov-sp3的下游引物堿基序列如seq?id?no：7所示。

12、作為實(shí)施例的優(yōu)選方式，所述構(gòu)建fcov-sp1、fcov-sp2和fcov-sp3表達(dá)載體：包括pcr擴(kuò)增反應(yīng)及構(gòu)建fcov?sp蛋白重組質(zhì)粒的步驟。

13、所述pcr擴(kuò)增反應(yīng)的具體反應(yīng)體系：2×green?taq?mix?12.5μl，病毒rna模版1μl，上、下游引物0.5μl，雙蒸水補(bǔ)足10.5μl，使總體系達(dá)到25μl；

14、所述pcr擴(kuò)增反應(yīng)的擴(kuò)增條件：預(yù)變性溫度94℃3min，變性溫度94℃15s，引物退火溫度56℃15s，延伸溫度72℃1min，終延伸溫度72℃5min，30個循環(huán)。

15、作為實(shí)施例的優(yōu)選方式，所述構(gòu)建fcov?sp蛋白重組質(zhì)粒：將所述pcr擴(kuò)增反應(yīng)步驟獲得的fcov-sp1、fcov-sp2和fcov-sp3三個基因片段通過連接反應(yīng)連接至peasy-blunt-e1表達(dá)載體上，分別獲得peasy-sp1、peasy-sp2和peasy-sp3。

16、作為實(shí)施例的優(yōu)選方式，所述連接反應(yīng)的具體反應(yīng)條件：fcov-sp1、fcov-sp2和fcov-sp3基因各3.5μl，peasy-blunt-e1表達(dá)載體1μl，剩余部分使用ddh2o補(bǔ)足至總體系為5μl，在37℃培養(yǎng)條件下孵育10min。

17、作為實(shí)施例的優(yōu)選方式，還包括對所述peasy-sp1、peasy-sp2和peasy-sp3進(jìn)行pcr鑒定的方法，具體反應(yīng)體系：2×green?taq?mix12.5μl，質(zhì)粒模版2μl，上、下游引物0.5μl，雙蒸水補(bǔ)足9.5μl，使總體系達(dá)到25μl；

18、具體擴(kuò)增條件：預(yù)變性溫度94℃3min，變性溫度94℃15s，引物退火溫度56℃15s，延伸溫度72℃1min，終延伸溫度72℃5min，35個循環(huán)。

19、作為實(shí)施例的優(yōu)選方式，還包括對所述peasy-sp1、peasy-sp2和peasy-sp3進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)的方法，包括：誘導(dǎo)表達(dá)溫度為37℃，誘導(dǎo)表達(dá)時間為6h，iptg誘導(dǎo)濃度為1.0nmol；最終獲得三個貓冠狀病毒i型s蛋白的截短蛋白fcov-sp1、fcov-sp2和fcov-sp3蛋白。

20、本發(fā)明還提供了一種用于貓冠狀病毒fcov早期診斷的試劑盒，包括所述的貓冠狀病毒s蛋白線性抗原表位作為包被抗原。

21、作為實(shí)施例的優(yōu)選方式，所示試劑盒還包括單克隆抗體作為包被抗體。

22、采用上述技術(shù)方案之后，本發(fā)明具有以下有益效果：

23、1、本發(fā)明人通過分子生物學(xué)技術(shù)，對fcov?s蛋白進(jìn)行了分段表達(dá)與純化，篩選出的fcov-sp3蛋白為fcov線性抗原表位，具有較高的保守性，可為fcov疫苗設(shè)計提供新的靶點(diǎn)。

24、2、該抗原表位的二級結(jié)構(gòu)主要為α-螺旋結(jié)構(gòu)，有助于理解其在病毒s蛋白中的結(jié)構(gòu)作用。

25、3、通過三維結(jié)構(gòu)模型的建立，可以更直觀地展示抗原表位在s蛋白上的位置，為后續(xù)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)研究和藥物設(shè)計提供參考。

技術(shù)特征：

1.一種貓冠狀病毒s蛋白線性抗原表位，其特征在于，所述線性抗原表位的氨基酸序列如seq?id?no：1所示。

2.一種如權(quán)利要求1所述的貓冠狀病毒s蛋白線性抗原表位的篩選方法，其特征在于，包括以下步驟：

3.如權(quán)利要求2所述的篩選方法，其特征在于，在所述步驟(a)中，所述fcov-sp1蛋白氨基酸位點(diǎn)為1127-1309aa，所述fcov-sp2蛋白氨基酸位點(diǎn)為1127-1218aa，所述fcov-sp3蛋白氨基酸位點(diǎn)為1306-1400aa。

4.如權(quán)利要求2所述的篩選方法，其特征在于，在所述步驟(a)中，還包括fcov?sp蛋白引物的設(shè)計及構(gòu)建fcov-sp1、fcov-sp2和fcov-sp3表達(dá)載體的步驟。

5.如權(quán)利要求4所述的篩選方法，其特征在于，所述fcov?sp蛋白引物的設(shè)計：

6.如權(quán)利要求4所述的篩選方法，其特征在于，所述構(gòu)建fcov-sp1、fcov-sp2和fcov-sp3表達(dá)載體：包括pcr擴(kuò)增反應(yīng)及構(gòu)建fcov?sp蛋白重組質(zhì)粒的步驟。

7.如權(quán)利要求6所述的篩選方法，其特征在于，所述pcr擴(kuò)增反應(yīng)的具體反應(yīng)體系：2×green?taq?mix?12.5μl，病毒rna模版1μl，上、下游引物0.5μl，雙蒸水補(bǔ)足10.5μl，使總體系達(dá)到25μl；

8.如權(quán)利要求7所述的篩選方法，其特征在于，所述構(gòu)建fcov?sp蛋白重組質(zhì)粒：將所述pcr擴(kuò)增反應(yīng)步驟獲得的fcov-sp1、fcov-sp2和fcov-sp3三個基因片段通過連接反應(yīng)連接至peasy-blunt-e1表達(dá)載體上，分別獲得peasy-sp1、peasy-sp2和peasy-sp3。

9.如權(quán)利要求8所述的篩選方法，其特征在于，還包括對所述peasy-sp1、peasy-sp2和peasy-sp3進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)的方法，包括：誘導(dǎo)表達(dá)溫度為37℃，誘導(dǎo)表達(dá)時間為6h，iptg誘導(dǎo)濃度為1.0nmol；最終獲得三個貓冠狀病毒i型s蛋白的截短蛋白fcov-sp1、fcov-sp2和fcov-sp3蛋白。

10.一種用于貓冠狀病毒fcov早期診斷的試劑盒，其特征在于，包括如權(quán)利要求1所述的貓冠狀病毒s蛋白線性抗原表位作為包被抗原。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供了一種貓冠狀病毒S蛋白線性抗原表位，所述線性抗原表位的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。本發(fā)明還提供了一種貓冠狀病毒S蛋白線性抗原表位的篩選方法，包括以下步驟：a)將FCoV?S蛋白拆分為具有重疊的三個蛋白片段，即FCoV?SP1、FCoV?SP2和FCoV?SP3；利用原核表達(dá)系統(tǒng)對拆分的蛋白片段進(jìn)行體外表達(dá)；對表達(dá)成功的蛋白片段進(jìn)行純化并鑒定其活性；(b)通過間接ELISA及Western?Blot技術(shù)篩選蛋白片段；(c)對篩選出的蛋白片段進(jìn)行氨基酸序列比對和生物信息學(xué)分析，確定其為FCoV的線性抗原表位。本發(fā)明篩選出的FCoV?SP3蛋白為FCoV線性抗原表位，具有較高的保守性，可為FCoV疫苗設(shè)計提供新的靶點(diǎn)。

技術(shù)研發(fā)人員：林煒明,董波,鐘曉威,李煜民,章爍,戴幸妍,黃秋嵐
受保護(hù)的技術(shù)使用者：龍巖學(xué)院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/9/17