本發(fā)明屬于分子鑒定，具體涉及一種金針菇高賴氨酸位點(diǎn)的分子標(biāo)記鑒定方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、食用菌具有高蛋白的特點(diǎn)，可作為優(yōu)質(zhì)的替代蛋白以保證蛋白的可持續(xù)供應(yīng)和綠色低碳生產(chǎn)。金針菇含有豐富的氨基酸，是優(yōu)良蛋白的新型植物蛋白源之一，還能與動物蛋白結(jié)合達(dá)到互補(bǔ)作用，以滿足人們多元化食品需求。金針菇含有18種水解氨基酸，其中必需氨基酸含量接近who/fao模式，其中賴氨酸含量尤為豐富。高含量的賴氨酸能促進(jìn)兒童生長發(fā)育，增強(qiáng)記憶，提高智力，因此金針菇又稱“增智菇”。

2、此外，賴氨酸在蛋白質(zhì)合成中發(fā)揮著重要作用，缺少賴氨酸會使其他氨基酸的利用受阻，是人體的第一必需氨基酸。成年人賴氨酸攝取量建議為30mg/kg。由于谷物中的賴氨酸含量甚低，且在加工過程中易被破壞而缺乏，以谷物作為主要蛋白質(zhì)和氨基酸地區(qū)的人們存在營養(yǎng)平衡攝取問題。因此，提高金針菇中賴氨酸含量對提高其單位食物量的營養(yǎng)價(jià)值具有非常重要的意義，高賴氨酸金針菇新品種的選育工作成為食用菌的一個(gè)新方向。

3、混合分析法(bulked?segregate?analysis，bsa)是一種快速定位控制目標(biāo)性狀基因的方法，即對目標(biāo)性狀關(guān)聯(lián)基因進(jìn)行篩選和定位。針對研究的目標(biāo)性狀，選擇表型差異顯著的親本構(gòu)建出分離群體(或家系群體)，同時(shí)對兩親本及其目標(biāo)性狀表型極端的子代分別混合得到的兩個(gè)混池進(jìn)行全基因組重測序，檢測到的兩混池間dna差異片段即為候選區(qū)域，并注釋該區(qū)域基因，可進(jìn)一步定位到目標(biāo)性狀相關(guān)的基因或標(biāo)記。再利用篩選出的分子標(biāo)記對分離群體中的個(gè)體進(jìn)行驗(yàn)證，通過判斷與目標(biāo)性狀基因的連鎖程度以及在某個(gè)已知遺傳圖譜中的位置，完成對目標(biāo)性狀的基因定位，進(jìn)而達(dá)到定向選育的目的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本部分的目的在于概述本發(fā)明的實(shí)施例的一些方面以及簡要介紹一些較佳實(shí)施例。

2、作為本發(fā)明其中一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種金針菇高賴氨酸位點(diǎn)的分子標(biāo)記鑒定方法，其中：采用8對引物對金針菇進(jìn)行pcr擴(kuò)增；所述8對引物序列分別為：

3、上游引物：5’-tcccatcgacaaagccttcc-3’，下游引物：5’-ccaacgatgccgaattcgtc-3’；

4、上游引物：5’-tgctcaactcccaagcacaa-3’，下游引物：5’-ggcgagggaaacttgaagga-3’；

5、上游引物：5’-tccttctgacgccacacttc-3’，下游引物：5’-attcctcagaaagggccagc-3’；

6、上游引物：5’-aacgatcaccaacgacacga-3’，下游引物：5’-atgtttgctcgtaactgcgc-3’；

7、上游引物：5’-aacgatcaccaacgacacga-3’，下游引物：5’-accattattcgcgtcaccca-3’；

8、上游引物：5’-tcaactgacagaggttgggc-3’，下游引物：5’-accattattcgcgtcaccca-3’；

9、上游引物：5’-tcagacaggtttgagtgccc-3’，下游引物：5’-atctccaactggttgtgggc-3’；

10、上游引物：5’-acttgaaagccacaccccaa-3’，下游引物：5’-cactcaccaacgttgtgctg-3’。

11、作為本發(fā)明所述的金針菇高賴氨酸位點(diǎn)的分子標(biāo)記鑒定方法的優(yōu)選方案：當(dāng)金針菇基因組中含有以下突變位點(diǎn)的堿基時(shí)，鑒定為高產(chǎn)賴氨酸菌株：

12、scaffold10_2028634位點(diǎn)堿基為c，

13、scaffold10_737778位點(diǎn)堿基為c，

14、scaffold4_1392222位點(diǎn)堿基為t，

15、scaffold4_1464316位點(diǎn)堿基為a，

16、scaffold4_1464321位點(diǎn)堿基為a，

17、scaffold4_1464322位點(diǎn)堿基為a，

18、scaffold4_1792254位點(diǎn)堿基為c，

19、scaffold4_1793138位點(diǎn)堿基為c。

20、作為本發(fā)明所述的金針菇高賴氨酸位點(diǎn)的分子標(biāo)記鑒定方法的優(yōu)選方案：金針菇基因組的genbank序列號為jbdpie000000000。

21、作為本發(fā)明所述的金針菇高賴氨酸位點(diǎn)的分子標(biāo)記鑒定方法的優(yōu)選方案：所述pcr擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4min；94℃變性30s，60℃退火45s，72℃延伸2min，循環(huán)35次；72℃終延伸7min。

22、作為本發(fā)明所述的金針菇高賴氨酸位點(diǎn)的分子標(biāo)記鑒定方法的優(yōu)選方案：pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系為：2×r?premix?taqtm：10μl，正反向引物各1μl，dna?1μl，ddh2o?7μl。

23、作為本發(fā)明所述的金針菇高賴氨酸位點(diǎn)的分子標(biāo)記鑒定方法的優(yōu)選方案：所述采用8對引物對金針菇進(jìn)行pcr擴(kuò)增，包括對金針菇菌絲體或子實(shí)體進(jìn)行pcr擴(kuò)增。

24、本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明提供一種金針菇高賴氨酸位點(diǎn)的分子標(biāo)記鑒定方法，用于金針菇賴氨酸含量的定向篩選工作，可以在不需要栽培出菇即可進(jìn)行檢測的前提下，在實(shí)驗(yàn)室可篩選到高產(chǎn)賴氨酸的金針菇菌株，具有良好的應(yīng)用前景。

技術(shù)特征：

1.一種金針菇高賴氨酸位點(diǎn)的分子標(biāo)記鑒定方法，其特征在于：采用8對引物對金針菇進(jìn)行pcr擴(kuò)增；所述8對引物序列分別為：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的金針菇高賴氨酸位點(diǎn)的分子標(biāo)記鑒定方法，其特征在于：當(dāng)金針菇基因組中含有以下突變位點(diǎn)的堿基時(shí)，鑒定為高產(chǎn)賴氨酸菌株：

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的金針菇高賴氨酸位點(diǎn)的分子標(biāo)記鑒定方法，其特征在于：金針菇基因組的genbank序列號為jbdpie000000000。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的金針菇高賴氨酸位點(diǎn)的分子標(biāo)記鑒定方法，其特征在于：所述pcr擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4min；94℃變性30s，60℃退火45s，72℃延伸2min，循環(huán)35次；72℃終延伸7min。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的金針菇高賴氨酸位點(diǎn)的分子標(biāo)記鑒定方法，其特征在于：pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系為：2×r?premix?taqtm：1oμl，正反向引物各1μl，dna?1μl，ddh2o?7μl。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的金針菇高賴氨酸位點(diǎn)的分子標(biāo)記鑒定方法，其特征在于：所述采用8對引物對金針菇進(jìn)行pcr擴(kuò)增，包括對金針菇菌絲體或子實(shí)體進(jìn)行pcr擴(kuò)增。

7.權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記鑒定方法在篩選高賴氨酸含量金針菇中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種金針菇高賴氨酸位點(diǎn)的分子標(biāo)記鑒定方法及應(yīng)用，采用8對引物對金針菇進(jìn)行PCR擴(kuò)增；當(dāng)金針菇基因組中含有特定突變位點(diǎn)的堿基時(shí)，鑒定為高產(chǎn)賴氨酸菌株；本發(fā)明可以在不需要栽培出菇即可進(jìn)行檢測的前提下，在實(shí)驗(yàn)室可篩選到高產(chǎn)賴氨酸的金針菇菌株，具有良好的應(yīng)用前景。

技術(shù)研發(fā)人員：王瑞娟,陸歡,劉建雨,尚曉冬,徐珍,楊慧,宋春艷,譚琦
受保護(hù)的技術(shù)使用者：上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/9/9