本發(fā)明涉及生物檢測領(lǐng)域，尤其涉及唐菖蒲伯克霍爾德氏菌椰毒假單胞菌酵米面亞種微滴數(shù)字pcr引物組、探針及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、唐菖蒲伯克霍爾德氏菌(椰毒假單胞菌酵米面亞種)是酵米面中毒事件中發(fā)現(xiàn)的食物中毒菌。該菌主要存在于谷類發(fā)酵制品(發(fā)酵玉米面、糯玉米湯圓粉、玉米淀粉、發(fā)酵糯小米、醋涼粉等)，變質(zhì)銀耳，薯類制品(馬鈴薯粉條、甘薯淀粉、山芋淀粉等)以及周圍環(huán)境中。唐菖蒲伯克霍爾德氏菌(椰毒假單胞菌酵米面亞種)可產(chǎn)生米酵菌酸和毒黃素，能引起高致病性的食物中毒。

2、目前，食品中唐菖蒲伯克霍爾德氏菌(椰毒假單胞菌酵米面亞種)檢測的食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)為gb?4789.29-2020，采用傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法，檢測過程包括增菌、分離純化、生化鑒定、血清鑒定、毒理試驗等，檢測操作步驟繁瑣、周期長、效率低，常規(guī)pcr、實時熒光pcr及環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增(lamp)等技術(shù)不能實現(xiàn)對細(xì)菌的絕對定量，現(xiàn)有方法不能滿足對食品中椰毒假單胞菌酵米面亞種微生物快速準(zhǔn)確定量判斷的要求。數(shù)字pcr檢測技術(shù)(digitalpcr，dpcr)，是一種核酸分子絕對定量技術(shù)，通過將一個樣本核酸分成幾十到幾萬份，在數(shù)萬個不同的反應(yīng)單元中，分別對目標(biāo)分子進(jìn)行pcr擴(kuò)增和檢測，減少背景干擾及抑制物對pcr反應(yīng)的干擾。該技術(shù)與傳統(tǒng)pcr技術(shù)相比，具有高靈敏度、高精準(zhǔn)度、絕對定量的優(yōu)點，更適合食品及食物中毒樣本痕量dna的快速定量檢測。

3、綜上，針對椰毒假單胞菌酵米面亞種微生物定量分析，非常有必要建立一套特異性強(qiáng)、靈敏度高、準(zhǔn)確性好的新技術(shù)，應(yīng)用于食品安全監(jiān)督檢驗、保障性檢驗及突發(fā)食品安全事件應(yīng)急檢驗等領(lǐng)域。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明提供了唐菖蒲伯克霍爾德氏菌椰毒假單胞菌酵米面亞種微滴數(shù)字pcr引物組、探針及其應(yīng)用。本發(fā)明提出了一種唐菖蒲伯克霍爾德氏菌(椰毒假單胞菌酵米面亞種)微滴數(shù)字pcr定量檢測方法，具有檢測特異性強(qiáng)、靈敏度高的特點，應(yīng)用于食品安全監(jiān)督檢驗、保障性檢驗及突發(fā)食品安全事件應(yīng)急檢驗等領(lǐng)域。

2、為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明提供了引物組，其具有：

4、(1)、如seq?id?no:1和seq?id?no:2所示的核苷酸序列；

5、(2)、具有(1)所示的核苷酸序列經(jīng)修飾、取代、缺失和/或添加一個或多個堿基獲得的核苷酸序列；

6、(3)、與(1)所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；

7、(4)、如(1)、(2)或(3)所示序列的互補(bǔ)序列。

8、本發(fā)明還提供了探針，其具有：

9、(5)、如seq?id?no:3所示的核苷酸序列；

10、(6)、具有(5)所示的核苷酸序列經(jīng)修飾、取代、缺失和/或添加一個或多個堿基獲得的核苷酸序列；

11、(7)、與(5)所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；

12、(8)、如(5)、(6)或(7)所示序列的互補(bǔ)序列。

13、本發(fā)明還提供了引物探針組，包括：上述引物組和上述探針。

14、本發(fā)明還提供了上述引物組、上述探針和/或上述引物探針組在如下任意中的應(yīng)用；

15、(i)、檢測唐菖蒲伯克霍爾德氏菌；和/或

16、(ii)、制備檢測唐菖蒲伯克霍爾德氏菌的產(chǎn)品；和/或

17、(iii)、檢測唐菖蒲伯克霍爾德氏菌的含量；和/或

18、(iv)、制備檢測唐菖蒲伯克霍爾德氏菌含量的產(chǎn)品；和/或

19、(v)、檢測食品中唐菖蒲伯克霍爾德氏菌的含量；和/或

20、(vi)、檢測食品中是否存在唐菖蒲伯克霍爾德氏菌。

21、本發(fā)明還提供了檢測試劑，包括：上述引物組、上述探針和/或上述引物探針組以及可接受的助劑和/或輔料。

22、本發(fā)明還提供了檢測試劑盒，包括：上述引物組、上述探針、上述引物探針組和/或如上述檢測試劑以及可接受的助劑、輔料和/或裝置。

23、在本發(fā)明的一些實施方案中，上述檢測試劑盒中，所述引物組和所述探針的濃度各自分別為10μmol/l。

24、本發(fā)明還提供了裝置，包括可接受的部件，以及包被有：

25、(1)、上述引物組；或

26、(2)、上述探針；或

27、(3)、上述引物探針組；或

28、(4)、上述檢測試劑。

29、本發(fā)明還提供了唐菖蒲伯克霍爾德氏菌的檢測方法，采用上述引物探針組對待測樣品擴(kuò)增，檢測，獲得檢測結(jié)果；

30、所述檢測采用微滴數(shù)字pcr。

31、在本發(fā)明的一些實施方案中，上述檢測方法中，所述待測樣品中dna的濃度為1.6～1000pg/μl。

32、本發(fā)明提供了引物組，其具有：

33、(1)、如seq?id?no:1和seq?id?no:2所示的核苷酸序列；

34、(2)、具有(1)所示的核苷酸序列經(jīng)修飾、取代、缺失和/或添加一個或多個堿基獲得的核苷酸序列；

35、(3)、與(1)所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；

36、(4)、如(1)、(2)或(3)所示序列的互補(bǔ)序列。

37、本發(fā)明的有益效果包括：

38、(1)、本發(fā)明提供一種可特異性鑒定唐菖蒲伯克霍爾德氏菌(椰毒假單胞菌酵米面亞種)的微滴數(shù)字pcr特異性引物，其特異性好，其他非目標(biāo)菌則不能特異性擴(kuò)增，對椰毒假單胞菌酵米面亞種可實現(xiàn)高通量定量檢測，具有商業(yè)化開發(fā)價值。此外，本發(fā)明中用于唐菖蒲伯克霍爾德氏菌(椰毒假單胞菌酵米面亞種)的微滴數(shù)字pcr反應(yīng)體系，能在增菌完成后2個小時內(nèi)實現(xiàn)唐菖蒲伯克霍爾德氏菌(椰毒假單胞菌酵米面亞種)的快速檢測。

39、(2)、本發(fā)明利用所述的微滴數(shù)字pcr特異性引物可快速檢測食品中是否存在唐菖蒲伯克霍爾德氏菌(椰毒假單胞菌酵米面亞種)，檢測效率高，靈敏度高，定量限低，可定量檢測dna濃度為1.6pg/μl的樣品，適用于唐菖蒲伯克霍爾德氏菌(椰毒假單胞菌酵米面亞種)快速定量檢測。

40、(3)、本發(fā)明提供的唐菖蒲伯克霍爾德氏菌(椰毒假單胞菌酵米面亞種)微滴數(shù)字pcr快速檢測方法及試劑盒，適用各類食品中唐菖蒲伯克霍爾德氏菌(椰毒假單胞菌酵米面亞種)的檢測，該技術(shù)可以應(yīng)用食物中毒快速診斷、風(fēng)險監(jiān)測快速預(yù)警及食品安全保障領(lǐng)域中發(fā)揮重要作用。

技術(shù)特征：

1.引物組，其特征在于，其具有：

2.探針，其特征在于，其具有：

3.引物探針組，其特征在于，包括：如權(quán)利要求1所述的引物組和如權(quán)利要求2所述的探針。

4.如權(quán)利要求1所述的引物組、如權(quán)利要求2所述的探針和/或如權(quán)利要求3所述的引物探針組在如下任意中的應(yīng)用；

5.檢測試劑，其特征在于，包括：如權(quán)利要求1所述的引物組、如權(quán)利要求2所述的探針和/或如權(quán)利要求3所述的引物探針組以及可接受的助劑和/或輔料。

6.檢測試劑盒，其特征在于，包括：如權(quán)利要求1所述的引物組、如權(quán)利要求2所述的探針、如權(quán)利要求3所述的引物探針組和/或如權(quán)利要求5所述的檢測試劑以及可接受的助劑、輔料和/或裝置。

7.如權(quán)利要求6所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述引物組和所述探針的濃度各自分別為10μmol/l。

8.裝置，其特征在于，包括可接受的部件，以及包被有：

9.唐菖蒲伯克霍爾德氏菌的檢測方法，其特征在于，采用如權(quán)利要求3所述的引物探針組對待測樣品擴(kuò)增，檢測，獲得檢測結(jié)果；

10.如權(quán)利要求9所述的檢測方法，其特征在于，所述待測樣品中dna的濃度為1.6～1000pg/μl。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及生物檢測領(lǐng)域，尤其涉及唐菖蒲伯克霍爾德氏菌椰毒假單胞菌酵米面亞種微滴數(shù)字PCR引物組、探針及其應(yīng)用。本發(fā)明提供了引物組和探針，其具有：如SEQ?ID?NO:1、SEQ?ID?NO:2和SEQ?ID:3所示的核苷酸序列。本發(fā)明提出了一種唐菖蒲伯克霍爾德氏菌(椰毒假單胞菌酵米面亞種)微滴數(shù)字PCR定量檢測方法，具有檢測特異性強(qiáng)、靈敏度高的特點，應(yīng)用于食品安全監(jiān)督檢驗、保障性檢驗及突發(fā)食品安全事件應(yīng)急檢驗等領(lǐng)域。

技術(shù)研發(fā)人員：肖劍,梁美丹,毛新武,白衛(wèi)濱,林秀敏,周偉杰,曹霞飛,胡凌,彭程,尹瑋璐,孫雪奇,梁智安,陳韻
受保護(hù)的技術(shù)使用者：暨南大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/9/17