本發(fā)明屬于家畜育種，尤其涉及一種環(huán)狀rnacirc_ltbp1在促進(jìn)綿羊卵泡發(fā)育及輔助育種中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、隨著畜牧業(yè)的發(fā)展，肉羊繁殖是畜牧業(yè)發(fā)展中不可或缺的一部分。繁殖力和繁殖效率是影響羊場(chǎng)經(jīng)濟(jì)的關(guān)鍵因素。在肉羊繁殖周期中，胎產(chǎn)羔數(shù)是評(píng)估肉用綿羊繁殖力和養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益的重要指標(biāo)。增加胎產(chǎn)羔數(shù)，可以顯著提高生產(chǎn)效率和經(jīng)濟(jì)效益，是集約化養(yǎng)羊系統(tǒng)的關(guān)鍵。因此，提高胎產(chǎn)羔數(shù)是綿羊育種研究的一個(gè)重點(diǎn)。

2、卵泡是哺乳動(dòng)物卵巢的基本功能單位，卵泡的發(fā)育是一個(gè)高度協(xié)調(diào)的過(guò)程，需要卵母細(xì)胞、顆粒細(xì)胞和膜細(xì)胞之間的交流。綿羊顆粒細(xì)胞作為卵泡內(nèi)數(shù)量最多、比重最大且功能最全細(xì)胞群，在卵泡發(fā)育和閉鎖中起主要作用，影響排卵率的高低。顆粒細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、凋亡和功能維持受到多種分子的調(diào)控，包括生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子等。

3、環(huán)狀rna(circrnas)是一種封閉的環(huán)形內(nèi)源性非編碼rna分子，不包含5'端帽子和3'端poly(a)尾巴，結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，不易被核酸外切酶降解。目前雖已有關(guān)于環(huán)狀rna可調(diào)節(jié)骨骼肌發(fā)生的報(bào)道，但并非所有的環(huán)狀rna都具有相同效果。不斷挖掘可促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖或分化的環(huán)狀rna，對(duì)我國(guó)肉繁兼用新品種培育具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種環(huán)狀rnacirc_ltbp1在促進(jìn)綿羊卵泡發(fā)育及輔助育種中的應(yīng)用，本發(fā)明以綿羊卵泡顆粒細(xì)胞為研究對(duì)象，根據(jù)環(huán)分子反向剪切位點(diǎn)序列特征設(shè)計(jì)引物，通過(guò)pcr和測(cè)序測(cè)定circ_ltbp1的環(huán)形結(jié)構(gòu)。通過(guò)rnaser和反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)探究circ_ltbp1的分子特性，通過(guò)構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體，結(jié)合rt-qpcr、edu、cck-8、免疫熒光、westernblot等試驗(yàn)，探究circ_ltbp1對(duì)綿羊卵泡顆粒細(xì)胞增殖、分化的影響。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明提供一種環(huán)狀rna在促進(jìn)綿羊卵泡發(fā)育中的應(yīng)用，所述環(huán)狀rna為circ_ltbp1，其核苷酸序列如seq?id?no:1所示。

4、作為優(yōu)選，所述促進(jìn)綿羊卵泡發(fā)育為促進(jìn)綿羊卵泡顆粒細(xì)胞增殖、分化。

5、本發(fā)明提供了一種含有環(huán)狀rna的載體，包括環(huán)狀rnacirc_ltbp1和初始載體。

6、作為優(yōu)選，所述初始載體為pcdna3.1質(zhì)粒。

7、作為優(yōu)選，所述的載體在促進(jìn)綿羊卵泡發(fā)育中的應(yīng)用。

8、作為優(yōu)選，所述的載體在促進(jìn)綿羊卵泡顆粒細(xì)胞增殖、分化中的應(yīng)用。

9、本發(fā)明還提供了檢測(cè)環(huán)狀rnacirc_ltbp1表達(dá)量的試劑，包括環(huán)狀rnacirc_ltbp1的擴(kuò)增引物。

10、作為優(yōu)選，所述擴(kuò)增引物的序列如seq?id?no:6～7所示。

11、本發(fā)明還提供了所述的載體與所述的試劑在綿羊輔助育種中的應(yīng)用。

12、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：本發(fā)明提供了一種環(huán)狀rna?circ_ltbp1在促進(jìn)綿羊卵泡發(fā)育及輔助育種中的應(yīng)用，本發(fā)明以綿羊卵泡顆粒細(xì)胞為研究對(duì)象，根據(jù)環(huán)分子反向剪切位點(diǎn)序列特征設(shè)計(jì)引物，對(duì)circrna進(jìn)行環(huán)狀驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，反向引物均擴(kuò)增出與預(yù)期大小一致的目的片段，而正向引物僅以cdna為模板時(shí)擴(kuò)增出了與預(yù)期大小一致的目的片段，進(jìn)一步采用sanger法對(duì)該目的片段進(jìn)行一代測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示，比對(duì)剪接位點(diǎn)前后10bp，共20bp的序列，測(cè)序結(jié)果與circ_ltbp1剪接位點(diǎn)序列一致，即剪接位點(diǎn)存在，證明circ_ltbp1成環(huán)。核糖核酸酶r處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：rnaser酶顯著降低了親本基因線性轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平，但未消減circ_ltbp1的表達(dá)，由此進(jìn)一步證明circ_ltbp1確為環(huán)形rna分子。此外，通過(guò)fish檢測(cè)了circ_ltbp1在顆粒細(xì)胞中的分布，結(jié)果表明：circ_ltbp1主要分布在細(xì)胞質(zhì)中。通過(guò)對(duì)circrna進(jìn)行核質(zhì)分布檢驗(yàn)，結(jié)果顯示：circ_ltbp1在細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)量高于細(xì)胞核內(nèi)的表達(dá)量，與fish試驗(yàn)結(jié)果一致。通過(guò)構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體，結(jié)合rt-qpcr、edu、cck-8、免疫熒光、westernblot等試驗(yàn)，探究circ_ltbp1對(duì)綿羊卵泡顆粒細(xì)胞增殖、分化的影響，結(jié)果表明在綿羊卵泡顆粒細(xì)胞中，circ_ltbp1可促進(jìn)卵泡顆粒細(xì)胞增殖和分化，進(jìn)而促進(jìn)綿羊卵泡發(fā)育。

技術(shù)特征：

1.一種環(huán)狀rna在促進(jìn)綿羊卵泡發(fā)育中的應(yīng)用，其特征在于，所述環(huán)狀rna為circ_ltbp1，其核苷酸序列如seq?id?no:1所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述促進(jìn)綿羊卵泡發(fā)育為促進(jìn)綿羊卵泡顆粒細(xì)胞增殖、分化。

3.一種含有環(huán)狀rna的載體，其特征在于，包括權(quán)利要求1所述應(yīng)用中的環(huán)狀rnacirc_ltbp1和初始載體。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的載體，其特征在于，所述初始載體為pcdna3.1質(zhì)粒。

5.權(quán)利要求3或4所述的載體在促進(jìn)綿羊卵泡發(fā)育中的應(yīng)用。

6.權(quán)利要求3或4所述的載體在促進(jìn)綿羊卵泡顆粒細(xì)胞增殖、分化中的應(yīng)用。

7.檢測(cè)環(huán)狀rnacirc_ltbp1表達(dá)量的試劑，其特征在于，包括環(huán)狀rnacirc_ltbp1的擴(kuò)增引物。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑，其特征在于，所述擴(kuò)增引物的序列如seq?id?no:6～7所示。

9.權(quán)利要求3或4所述的載體、權(quán)利要求7或8所述的試劑在綿羊輔助育種中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供一種環(huán)狀RNAcirc_LTBP1在促進(jìn)綿羊卵泡發(fā)育及輔助育種中的應(yīng)用，屬于家畜育種技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明以綿羊卵泡顆粒細(xì)胞為研究對(duì)象，根據(jù)環(huán)分子反向剪切位點(diǎn)序列特征設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR和測(cè)序測(cè)定circ_LTBP1的環(huán)形結(jié)構(gòu)，通過(guò)RNase?R和反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)探究circ_LTBP1的分子特性，通過(guò)構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體，結(jié)合RT?qPCR、EdU、CCK?8、免疫熒光、WesternBlot，探究circ_LTBP1對(duì)綿羊卵泡顆粒細(xì)胞增殖、分化的影響。發(fā)現(xiàn)在綿羊顆粒細(xì)胞細(xì)胞中，circ_LTBP1可促進(jìn)卵泡顆粒細(xì)胞增殖和分化。

技術(shù)研發(fā)人員：劉愛菊,宋臣鋒,張連瑞,王春明,何笑,翟冬,丁兆忠
受保護(hù)的技術(shù)使用者：滄州職業(yè)技術(shù)學(xué)院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/11/14