本發(fā)明涉及生物發(fā)酵，具體涉及一株寄生曲霉及其生產(chǎn)蘋果酸的發(fā)酵方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、蘋果酸是人體內(nèi)部循環(huán)的重要中間產(chǎn)物，易被人體吸收，因此作為優(yōu)異的食品添加劑和功能性食品廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)療和保健等領(lǐng)域。

2、蘋果酸的生產(chǎn)方法有化學(xué)合成法、直接發(fā)酵法(一步發(fā)酵法)、兩步發(fā)酵法、酶轉(zhuǎn)化法和固定化細(xì)胞轉(zhuǎn)化法。目前，化學(xué)合成法已經(jīng)被淘汰。使用固定化細(xì)胞或酶法生產(chǎn)l-蘋果酸的成本比較高，相比之下，發(fā)酵法生產(chǎn)l-蘋果酸，生產(chǎn)成本與產(chǎn)量均比其他的方法占有優(yōu)勢，但是發(fā)酵周期長、能耗大是發(fā)酵法的缺點(diǎn)。

3、專利號為cn110684673a，名稱為l-蘋果酸高產(chǎn)菌株及其應(yīng)用中公開了一株采用物理誘變并自然篩選的黑曲霉菌株，直接采用淀粉質(zhì)原料進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵溫度為32-37℃，發(fā)酵周期為72h左右，雖然在發(fā)酵原料上的支出成本較低，但是由于發(fā)酵溫度在發(fā)酵工業(yè)上并不占優(yōu)勢，對發(fā)酵設(shè)備要求較高，且發(fā)酵周期較長，使得發(fā)酵耗能增大，成本提高；

4、專利號為cn101255405a，名稱為新構(gòu)建的高產(chǎn)蘋果酸基因工程菌及其生產(chǎn)蘋果酸的方法，公開了一株基因工程菌，采用兩階段發(fā)酵方式發(fā)酵生產(chǎn)蘋果酸，但是這種兩階段發(fā)酵方式還停留在實(shí)驗(yàn)室階段，操作方法較為繁瑣，使用的培養(yǎng)基成本較高，不利于工業(yè)化生產(chǎn)發(fā)酵；

5、專利號為cn101649300a，名稱為一種產(chǎn)l-蘋果酸的基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，公開了一種產(chǎn)蘋果酸的基因工程菌，發(fā)酵溫度為37℃，發(fā)酵周期為60h，雖然具備了在工業(yè)化生產(chǎn)的能力，但是在發(fā)酵產(chǎn)酸階段，采用二氧化碳維持厭氧環(huán)境，將會大大的提高生產(chǎn)成本；

6、綜上可知，現(xiàn)有的專利文獻(xiàn)中，公開的生產(chǎn)蘋果酸的菌株分為基因工程菌和曲霉菌屬，而在發(fā)酵生產(chǎn)過程中采用的發(fā)酵溫度為28℃-37℃，為了防止染菌事故的發(fā)生，對發(fā)酵生產(chǎn)設(shè)備要求較高，同時(shí)發(fā)酵周期較長，發(fā)酵能耗較大，成本提高，使得生物法發(fā)酵生產(chǎn)蘋果酸在工業(yè)化生產(chǎn)中的優(yōu)勢不復(fù)存在。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、鑒于現(xiàn)有技術(shù)中的上述缺陷或不足，期望提供一種工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)蘋果酸菌株及其發(fā)酵方法和應(yīng)用。

2、本發(fā)明的目的在于提供一種發(fā)酵生產(chǎn)蘋果酸菌株，該菌株為實(shí)驗(yàn)室保藏菌株-寄生曲霉jfjypgs006，并經(jīng)過co60誘變，篩選馴化后得到，該菌株已于2023年8月31送至中國典型培養(yǎng)物保藏中心進(jìn)行保藏，分類命名：寄生曲霉(aspergillus?parasiticus)jfly-07，保藏日期為2023年8月31日，保藏編號為cctcc?no：m?20231582。

3、本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供了一種發(fā)酵生產(chǎn)蘋果酸的方法，在12％的初糖濃度下，利用兩階段發(fā)酵方式，40℃-42℃發(fā)酵，接種發(fā)酵結(jié)束的復(fù)壯菌株，發(fā)酵周期為56h，糖酸轉(zhuǎn)化率達(dá)到113.86％；

4、本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種寄生曲霉菌株復(fù)壯的方法和培養(yǎng)基，實(shí)現(xiàn)菌體的循環(huán)利用。

5、本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供了寄生曲霉在發(fā)酵生產(chǎn)蘋果酸中的應(yīng)用。

6、為了實(shí)現(xiàn)以上技術(shù)，本發(fā)明采用如下技術(shù)措施，

7、寄生曲霉(aspergillus?parasiticus)jfly-07的獲得

8、取實(shí)驗(yàn)室保藏菌株jfjypgs006，經(jīng)過co60誘變，篩選馴化后得到寄生曲霉(aspergillus?parasiticus)jfly-07，分類命名：寄生曲霉(aspergillus?parasiticus)jfly-07，保藏編號為cctcc?no：m20231582。

9、該寄生曲霉(aspergillus?parasiticus)jfly-07發(fā)酵生產(chǎn)蘋果酸的方法，包括以下步驟：

10、(1)種子液培養(yǎng)：將寄生曲霉(aspergillus?parasiticus)jfly-07接種至種子培養(yǎng)基中有氧發(fā)酵，實(shí)現(xiàn)菌株高速生長，得到種子液備用；

11、(2)高濃度復(fù)壯菌液制備：將種子液接種至發(fā)酵罐內(nèi)采用兩階段發(fā)酵方式進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵結(jié)束后的發(fā)酵液經(jīng)過設(shè)備分離得到菌絲體和分離液，菌絲體轉(zhuǎn)接至復(fù)壯培養(yǎng)基中有氧發(fā)酵培養(yǎng)，得到復(fù)壯后的高濃度菌液，分離液進(jìn)入到后續(xù)處理階段，得到產(chǎn)品蘋果酸；

12、(3)發(fā)酵培養(yǎng)：將復(fù)壯后的高濃度菌液接種至發(fā)酵罐內(nèi)進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵結(jié)束后的發(fā)酵液經(jīng)設(shè)備分離得到菌絲體和分離液，重復(fù)步驟(2)得到復(fù)壯后的高濃度菌液和分離液，將得到的復(fù)壯后高濃度菌液進(jìn)行循環(huán)的發(fā)酵培養(yǎng)。

13、有氧發(fā)酵條件：發(fā)酵溫度為40℃-42℃，轉(zhuǎn)速150r/min，溶氧量為20％；

14、兩階段發(fā)酵方式包括第一有氧發(fā)酵和第二缺氧發(fā)酵兩個(gè)階段：

15、第一階段有氧發(fā)酵條件：發(fā)酵溫度為40℃-42℃，轉(zhuǎn)速150r/min，溶氧量為20％；

16、第二階段缺氧發(fā)酵條件：發(fā)酵溫度為40℃-42℃，轉(zhuǎn)速150r/min，溶氧量為6％±2％。

17、種子培養(yǎng)基：葡萄糖20.0g/l，硝酸鈉2.0g/l，硫酸銨1.5g/l，酵母粉0.1g/l，nah2po4·h2o?0.15g/l，k2hpo4?0.2g/l，生物素0.045g/l，甜菜堿0.15g/l，硫酸鐵0.1g/l；

18、發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖120.0g/l，硝酸鈉2.0g/l，硫酸銨1.5g/l，酵母粉0.1g/l，nah2po4·h2o?0.15g/l，k2hpo4?0.2g/l，生物素0.045g/l，甜菜堿0.15g/l，硫酸鐵0.1g/l；

19、復(fù)壯培養(yǎng)基：葡萄糖80.0g/l，硝酸鈉2.0g/l，硫酸銨1.5g/l，酵母粉0.1g/l，nah2po4·h2o?0.15g/l，k2hpo4?0.2g/l，生物素0.045g/l，甜菜堿0.15g/l，硫酸鐵0.1g/l，新霉素2g/l。

20、綜上所述，本申請的有益效果：本發(fā)明具有以下優(yōu)勢：

21、1.本發(fā)明篩選的寄生曲霉(aspergillus?parasiticus)jfly-07在高溫40℃-42℃下采用兩階段發(fā)酵方式，能夠大大降低染菌的概率；

22、2.本發(fā)明過濾得到初次發(fā)酵結(jié)束后的菌體，在對菌體進(jìn)行復(fù)壯培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)接至發(fā)酵罐內(nèi)進(jìn)行循環(huán)發(fā)酵，大大縮短發(fā)酵周期，縮短企業(yè)回收利益的時(shí)間；

23、3.本發(fā)明設(shè)置的復(fù)壯培養(yǎng)基內(nèi)添加新霉素，在復(fù)壯菌株的同時(shí)，能夠大大的降低染菌概率，保證發(fā)酵過程中的菌體循環(huán)利用；

24、4.本發(fā)明使用高濃度復(fù)壯菌液進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)蘋果酸，在初糖濃度為12％的條件下，發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度為40℃-42℃，轉(zhuǎn)速為150r/min時(shí)，采用兩階段發(fā)酵方式，發(fā)酵周期為56h，蘋果酸產(chǎn)量可達(dá)到85.65g/l，糖酸轉(zhuǎn)化率達(dá)到113.86％，，蘋果酸產(chǎn)生速率為1.53g/l·h。發(fā)酵周期短，轉(zhuǎn)化率高，蘋果酸生產(chǎn)速率高，這在降低工業(yè)成本的同時(shí)，還能大大的縮短企業(yè)回收利益的時(shí)間。

技術(shù)特征：

1.一種寄生曲霉，其特征在于：寄生曲霉(aspergillus?parasiticus)jfly-07，保藏編號為：cctcc?no：m?20231582。

2.一種發(fā)酵生產(chǎn)蘋果酸的方法，其特征在于：利用如權(quán)利要求1所述的寄生曲霉(aspergillus?parasiticus)jfly-07發(fā)酵生產(chǎn)蘋果酸的方法。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種發(fā)酵生產(chǎn)蘋果酸的方法，其特征在于：包括以下步驟：

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種發(fā)酵生產(chǎn)蘋果酸的方法，其特征在于：

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種發(fā)酵生產(chǎn)蘋果酸的方法，其特征在于：

6.權(quán)利要求1所述的菌株在發(fā)酵生產(chǎn)蘋果酸中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一株寄生曲霉及其生產(chǎn)蘋果酸的發(fā)酵方法和應(yīng)用，一株寄生曲霉(Aspergillus?parasiticus)JFLY?07，經(jīng)過誘變馴化，利用發(fā)酵結(jié)束后的菌體進(jìn)行復(fù)壯后轉(zhuǎn)接至發(fā)酵液內(nèi)，采用兩階段發(fā)酵方式，在初糖濃度為12％的情況下，發(fā)酵周期為56h，發(fā)酵結(jié)束后蘋果酸含量達(dá)到85.65g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率達(dá)到113.86％，蘋果酸產(chǎn)生速率為1.53g/L·h。發(fā)酵周期短，轉(zhuǎn)化率高，這在降低工業(yè)成本的同時(shí)，還能大大的縮短企業(yè)回收利益的時(shí)間。

技術(shù)研發(fā)人員：劉鋒,涂孝翠,劉思濤
受保護(hù)的技術(shù)使用者：吉峰久業(yè)生物科技（天津）有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/10/10