本發(fā)明涉及臨床檢測，尤其涉及一種布魯氏菌dna熒光pcr檢測試劑盒。

背景技術(shù)：

1、布魯氏菌?。╞rucellosis）是由布魯氏菌屬（brucella）細菌感染引起的一種人獸共患的傳染性疾病，在全世界有廣泛的分布。布魯氏菌病在國外也被稱為地中海熱、馬爾他熱和山羊熱等。早在?1886?年，在大英帝國駐扎于地中海沿岸的軍隊中流行，1位英國的軍醫(yī)布魯氏?(bruce)?在馬爾他島死于“馬爾他熱”。目前公認布魯氏菌屬的細菌有6種19型，感染人的主要有牛、羊、豬3種16型。人感染布魯氏菌可引起發(fā)燒、多汗、全身乏力、關(guān)節(jié)疼痛等癥狀、病程長且反復發(fā)作，如得不到及時有效治療，轉(zhuǎn)變?yōu)槁云?，導致骨關(guān)節(jié)、神經(jīng)、泌尿、生殖等多系統(tǒng)損害、疾患。家畜患病可導致流產(chǎn)、不孕、睪丸炎和附睪炎等癥狀。世界動物衛(wèi)生組織（office?international?des?epizooties，oie）將其列為b類重要傳染病。感染動物是其它動物和人類罹患布魯氏菌病的主要傳染源。對布魯氏菌病的早期特異診斷為防控的關(guān)鍵技術(shù)之一。因此，快捷準確鑒定的檢測并鑒定病患是否感染布魯氏菌，對臨床診治和疫情有效防控具有重大意義。

2、布魯氏菌病的實驗室診斷方法主要有：病原體分離，但因布魯氏菌生長較慢，即使是快速的bactec9240血培養(yǎng)系統(tǒng)，也需2～7天檢出，經(jīng)孵育2～4周后仍無細菌生長，才能判為陰性，難以早期快速診斷。免疫學檢查，包括血清凝集試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗、補體結(jié)合試驗、被動血凝試驗、間接免疫熒光試驗、斑點免疫法和皮內(nèi)試驗等多種方法，由于受到宿主免疫反應機制的限制，也是在布魯氏菌感染發(fā)病后2～3周開始出現(xiàn)陽性，靈敏度和特異度都不高，而且陽性時不能鑒別是現(xiàn)癥患者還是既往感染，只能作為臨床輔助診斷參考。

3、分子檢測是目前公認的靈敏度和特異度都明顯高于其他技術(shù)方法的病原學檢測技術(shù)，在其他傳染病檢測中已得到廣泛的應用。在分子檢測技術(shù)中，pcr法由于其快速簡便的特點逐漸呈現(xiàn)出要替代以細菌培養(yǎng)和血清學檢測為主的傳統(tǒng)檢測方法的趨勢。而對于pcr方法來說，引物探針的特異性是檢測方法特異性和敏感性的基礎。然而，在布魯氏菌病方面，目前，我國臨床診斷領(lǐng)域尚未見有相應的分子檢測試劑。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供本一種布魯氏菌dna熒光pcr檢測試劑盒，解決如何快速準確地檢測樣品中是否存在布魯氏菌的問題。

2、本發(fā)明的方案是：

3、一種布魯氏菌dna熒光pcr檢測試劑盒，包括酶反應液，引物探針混合液、陰性質(zhì)控品與陽性質(zhì)控品，所述引物探針混合液中用于布魯氏菌特異dna擴增反應的上游引物bru-f與下游引物bru-r；所述引物探針混合液中用于指控內(nèi)參擴增反應的上游引物β2m-f與下游引物β2m-r；所述引物探針混合液中用于熒光信號監(jiān)測的布魯氏菌目的基因寡核苷酸探針bru-p1；所述引物探針混合液中于熒光信號監(jiān)測的β2m內(nèi)參基因寡核苷酸探針β2m-p2；

4、所述上游引物bru-f的核苷酸序列如seq?no.1所示，所述下游引物bru-r如seqno.2所示；

5、所述上游引物β2m-f的核苷酸序列如seq?no.3所示，所述下游引物β2m-r的核苷酸序列如seq?no.4所示；

6、所述探針bru-p1的核苷酸序列如seq?no.5所示，所述探針β2m-p2的核苷酸序列如seq?no.6所示。

7、作為優(yōu)選的技術(shù)方案，qpcr反應體系為20μl的如下體系：

8、酶反應液10.0μl、引物探針混合液3.6μl、樣品dna?3μl，加無核酸酶滅菌水至終體系?20?μl。

9、作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述酶反應液包括pcr緩沖液、taq酶與dntps。

10、作為優(yōu)選的技術(shù)方案，qpcr反應循環(huán)參數(shù)為95℃，30min；進入循環(huán)階段：95℃變性10s，60℃退火延伸50s，共反應45個循環(huán)。

11、作為優(yōu)選的技術(shù)方案，qpcr反應的目的基因（fam）陽性判斷?ct值為≤39，內(nèi)參基因（hex通道）陽性判斷ct?值為≤38。

12、本發(fā)明還公開了一種布魯氏菌dna熒光pcr檢測試劑盒的用途，為布魯氏菌的感染診斷與鑒別診斷提供了快速、敏感、特異的臨床檢測方法，在所述臨床檢測方法中使用。

13、本發(fā)明的優(yōu)點：

14、本發(fā)明分別針對布魯氏菌基因序列的保守區(qū)域特異的靶序列（見圖1）設計引物和taqman探針，陽性參照β2m基因序列（見圖2）設計引物和taqman探針，利用熒光定量pcr（fluorescent?quantitative?pcr，qpcr）方法，用來快速檢測樣品中是否存在布魯氏菌的核酸dna。

15、本發(fā)明提供的試劑具有很好的特異性，可以檢出布魯氏菌特異dna。本發(fā)明提供的試劑與副溶血弧菌、小腸結(jié)腸耶爾森菌致病株、小腸結(jié)腸耶爾森菌非致病株、大腸桿菌o157、沙門菌和結(jié)核桿菌無交叉反應。本發(fā)明提供的試劑，針對血紅蛋白（2.0g/l）、甘油三酯（37mmol/l）、結(jié)合膽紅素（342μmol/l）、游離膽紅素（342μmol/l）進行驗證，對檢測結(jié)果無顯著性影響。本發(fā)明提供的試劑，針對布魯氏菌病治療常用抗生素多西環(huán)素（10mg/l）、利福平（27mg/l）、鏈霉素（120mg/l）、環(huán)丙沙星（15mg/l）和左氧氟沙星（10mg/l）進行驗證，藥物本身對檢測結(jié)果無顯著性影響。臨床樣本檢測的特異度，以普通pcr?dna測序做參照，特異度達到91.7%。

16、本發(fā)明提供的試劑具有很好的靈敏性，對布魯氏菌dna的檢測下限為3拷貝每反應體系；臨床樣本檢測的靈敏度，以普通pcr?dna測序做參照，靈敏度達到97.5%。

17、本發(fā)明提供的試劑盒，檢測時效快速，只需要2小時即可完成檢測。

18、本發(fā)明提供的試劑盒，可對由布魯氏菌引起的感染進行病原學監(jiān)測并為臨床診斷提供實驗依據(jù)。

技術(shù)特征：

1.一種布魯氏菌dna熒光pcr檢測試劑盒，其特征在于：包括酶反應液，引物探針混合液、陰性質(zhì)控品與陽性質(zhì)控品，所述引物探針混合液中用于布魯氏菌特異dna擴增反應的上游引物bru-f與下游引物bru-r；所述引物探針混合液中用于指控內(nèi)參擴增反應的上游引物β2m-f與下游引物β2m-r；所述引物探針混合液中用于熒光信號監(jiān)測的布魯氏菌目的基因寡核苷酸探針bru-p1；所述引物探針混合液中于熒光信號監(jiān)測的β2m內(nèi)參基因寡核苷酸探針β2m-p2；

2.如權(quán)利要求1所述一種布魯氏菌dna熒光pcr檢測試劑盒，其特征在于，qpcr反應體系為20μl的如下體系：

3.如權(quán)利要求1或2所述一種布魯氏菌dna熒光pcr檢測試劑盒，其特征在于：所述酶反應液包括pcr緩沖液、taq酶與dntps。

4.如權(quán)利要求2所述一種布魯氏菌dna熒光pcr檢測試劑盒，其特征在于：qpcr反應循環(huán)參數(shù)為95℃，30min；進入循環(huán)階段：95℃變性10s，60℃退火延伸50s，共反應45個循環(huán)。

5.如權(quán)利要求2所述一種布魯氏菌dna熒光pcr檢測試劑盒，其特征在于：qpcr反應的目的基因陽性判斷?ct值為≤39，內(nèi)參基因陽性判斷ct?值為≤38。

6.一種如權(quán)利要求1至5任意一項所述布魯氏菌dna熒光pcr檢測試劑盒的用途。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種布魯氏菌DNA熒光PCR檢測試劑盒，本發(fā)明提供用于布魯氏菌DNA檢測的特異性引物和探針，并建立了應用熒光定量聚合酶鏈反應（fluorescent?quantitative?polymerase?chain?reaction，qPCR）對待檢樣本中布魯氏菌特異性DNA進行檢測的布魯氏菌DNA熒光qPCR檢測方法。本發(fā)明的特異性引物探針和檢測方法特異性強、靈敏度高、具有良好重復性和穩(wěn)定性，為布魯氏菌的感染診斷和鑒別診斷提供了快速、敏感、特異的臨床檢測方法。

技術(shù)研發(fā)人員：季紹有,萬康林,馬立東,朱留偉,王丹青
受保護的技術(shù)使用者：浙江元勤生物醫(yī)藥科技有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/9/9