本發(fā)明屬于多表位疫苗，具體涉及一種非洲豬瘟串聯(lián)表位重組蛋白及其制備方法和應用。

背景技術：

1、非洲豬瘟(asf)是由非洲豬瘟病毒(asfv)引起的一種急性、傳染性和致病性傳染病。該病毒是阿斯法爾病毒科的唯一成員，也是唯一已知的dna蟲媒病毒。asf是一種高度傳染性的病毒性疾病。非洲豬瘟病毒(asfv)顆粒具有多層結構，整體二十面體形態(tài)，直徑為260-300nm。asfv的基因組長度約為170-193kb，編碼150-167種蛋白質(zhì)，具體取決于病毒株。迄今為止，一種安全有效的asf疫苗尚未開發(fā)和商業(yè)化，以保護豬并阻止asfv的傳播。

2、目前針對asfv的疫苗主要有一下幾種分別是：滅活疫苗，減毒疫苗，亞單位疫苗，dna疫苗以及病毒載體疫苗。滅活苗是研發(fā)最早的疫苗，但是起防控效果很不理性，雖然有抗原性，但是不能刺激機體產(chǎn)生完全的免疫反應；減毒疫苗是基于非洲豬瘟病毒天然低毒力的毒株研發(fā)的疫苗，雖然可以誘導動物產(chǎn)生免疫應答，但是效果不佳并且由于asfv突變性，極大可能使其變成強毒株，疫苗的安全性不能完全保證；非洲豬瘟亞單位疫苗有效抗原的篩選是制約亞單位疫苗研制的一個難題；dna疫苗夠誘導細胞介導的ctl免疫反應，對預防非洲豬瘟病毒感染發(fā)揮了重要作用，但在攻毒后未表現(xiàn)出免疫保護性；病毒載體疫苗即使可以誘發(fā)體液與細胞免疫，但實際保護效果并不明顯。這些疫苗的主要靶點是asfv結構蛋白。然而，所使用的這些抗原不能誘導完全和持久的保護。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供了一種非洲豬瘟串聯(lián)表位重組蛋白及其制備方法和應用，該重組蛋白及其制備的疫苗能夠激發(fā)機體產(chǎn)生有效的特異性免疫應答，起到多靶點效應，發(fā)揮高效的免疫保護力。

2、為解決上述技術問題，本發(fā)明提供了以下技術方案：

3、本發(fā)明提供一種非洲豬瘟串聯(lián)表位重組蛋白，所述非洲豬瘟串聯(lián)表位重組蛋白包括g1211r蛋白中2個表位肽、cp2475l蛋白中1個表位肽、cp204l蛋白中1個表位肽、cp530r蛋白中1個表位肽、np1450l蛋白中1個表位肽、d339l蛋白中1個表位肽、d1133l蛋白中1個表位肽、d345l蛋白中1個表位肽、p1192r蛋白中1個表位肽、h359l蛋白中1個表位肽、e423r蛋白中1個表位肽、q706l蛋白中1個表位肽、e248r蛋白中1個表位肽和i329l蛋白中1個表位肽；所述表位肽通過連接臂連接。

4、優(yōu)選的，所述g1211r蛋白中2個表位肽的氨基酸序列如seq?id?no.1～2所示，所述cp2475l蛋白中1個表位肽、cp204l蛋白中1個表位肽、cp530r蛋白中1個表位肽、np1450l蛋白中1個表位肽、d339l蛋白中1個表位肽、d1133l蛋白中1個表位肽、d345l蛋白中1個表位肽、p1192r蛋白中1個表位肽、h359l蛋白中1個表位肽、e423r蛋白中1個表位肽、q706l蛋白中1個表位肽、e248r蛋白中1個表位肽和i329l蛋白中1個表位肽的氨基酸序列分別如如seqid?no.3～15所示；所述連接臂的氨基酸序列如seq?id?no.16所示。

5、優(yōu)選的，所述非洲豬瘟串聯(lián)表位重組蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.17所示。

6、本發(fā)明提供所述的非洲豬瘟串聯(lián)表位重組蛋白的制備方法，包括如下步驟：篩選非洲豬瘟病毒蛋白的優(yōu)勢表位，連接篩選的優(yōu)勢表位獲得優(yōu)勢表位串聯(lián)基因，將優(yōu)勢表位串聯(lián)基因克隆到表達質(zhì)粒上，將重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，培養(yǎng)和純化，獲得非洲豬瘟串聯(lián)表位重組蛋白。

7、優(yōu)選的，所述表達質(zhì)粒為pet-28a。

8、優(yōu)選的，所述大腸桿菌為大腸桿菌bl21。

9、本發(fā)明提供一種非洲豬瘟病毒疫苗，含有所述的非洲豬瘟串聯(lián)表位重組蛋白。

10、優(yōu)選的，還包括免疫學上可接受的載體和/或輔料。

11、本發(fā)明提供所述的非洲豬瘟串聯(lián)表位重組蛋白或所述的制備方法制得的非洲豬瘟串聯(lián)表位重組蛋白或所述的非洲豬瘟病毒疫苗在制備預防非洲豬瘟病毒產(chǎn)品中的應用。

12、與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

13、本發(fā)明通過從ncbi(美國國家生物信息中心)網(wǎng)站下載12株非洲豬瘟毒株全部氨基酸，通過軟件分析比對其共有蛋白質(zhì)氨基酸序列以及蛋白質(zhì)抗原表位，獲得g1211r蛋白中2個表位肽、cp2475l蛋白中1個表位肽、cp204l蛋白中1個表位肽、cp530r蛋白中1個表位肽、np1450l蛋白中1個表位肽、d339l蛋白中1個表位肽、d1133l蛋白中1個表位肽、d345l蛋白中1個表位肽、p1192r蛋白中1個表位肽、h359l蛋白中1個表位肽、e423r蛋白中1個表位肽、q706l蛋白中1個表位肽、e248r蛋白中1個表位肽和i329l蛋白中1個表位肽，將上述表位肽通過連接臂連接，獲得非洲豬瘟串聯(lián)表位重組蛋白，進行小鼠免疫和細胞免疫驗證，發(fā)現(xiàn)該非洲豬瘟串聯(lián)表位重組蛋白能夠激發(fā)機體產(chǎn)生有效的特異性免疫應答，起到多靶點效果，發(fā)揮高效的免疫保護力，可有效預防非洲豬瘟病毒的感染。

14、本發(fā)明所述非洲豬瘟串聯(lián)表位重組蛋白可以將多個有良好抗原效果的抗原表位串聯(lián)，去除了冗雜蛋白，發(fā)揮多靶點效應，通過基因工程技術制備出了具有良好免疫效果的多抗原表位的疫苗。彌補了非洲豬瘟病毒的滅活疫苗無效或效果低，減毒活疫苗的安全性低，單個蛋白質(zhì)的亞單位疫苗的免疫性低的缺陷。同時，該疫苗與亞單位疫苗、減毒疫苗相比，它們更安全、更方便大規(guī)模生產(chǎn)

技術特征：

1.一種非洲豬瘟串聯(lián)表位重組蛋白，其特征在于，所述非洲豬瘟串聯(lián)表位重組蛋白包括g1211r蛋白中2個表位肽、cp2475l蛋白中1個表位肽、cp204l蛋白中1個表位肽、cp530r蛋白中1個表位肽、np1450l蛋白中1個表位肽、d339l蛋白中1個表位肽、d1133l蛋白中1個表位肽、d345l蛋白中1個表位肽、p1192r蛋白中1個表位肽、h359l蛋白中1個表位肽、e423r蛋白中1個表位肽、q706l蛋白中1個表位肽、e248r蛋白中1個表位肽和i329l蛋白中1個表位肽；所述表位肽通過連接臂連接。

2.如權利要求1所述的非洲豬瘟串聯(lián)表位重組蛋白，其特征在于，所述g1211r蛋白中2個表位肽的氨基酸序列如seq?id?no.1～2所示，所述cp2475l蛋白中1個表位肽、cp204l蛋白中1個表位肽、cp530r蛋白中1個表位肽、np1450l蛋白中1個表位肽、d339l蛋白中1個表位肽、d1133l蛋白中1個表位肽、d345l蛋白中1個表位肽、p1192r蛋白中1個表位肽、h359l蛋白中1個表位肽、e423r蛋白中1個表位肽、q706l蛋白中1個表位肽、e248r蛋白中1個表位肽和i329l蛋白中1個表位肽的氨基酸序列分別如如seq?id?no.3～15所示；所述連接臂的氨基酸序列如seq?id?no.16所示。

3.如權利要求1所述的非洲豬瘟串聯(lián)表位重組蛋白，其特征在于，所述非洲豬瘟串聯(lián)表位重組蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.17所示。

4.如權利要求1所述的非洲豬瘟串聯(lián)表位重組蛋白的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：篩選非洲豬瘟病毒蛋白的優(yōu)勢表位，連接篩選的優(yōu)勢表位獲得優(yōu)勢表位串聯(lián)基因，將優(yōu)勢表位串聯(lián)基因克隆到表達質(zhì)粒上，將重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，培養(yǎng)和純化，獲得非洲豬瘟串聯(lián)表位重組蛋白。

5.如權利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述表達質(zhì)粒為pet-28a。

6.如權利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述大腸桿菌為大腸桿菌bl21。

7.一種非洲豬瘟病毒疫苗，其特征在于，含有如權利要求1～3任意一項所述的非洲豬瘟串聯(lián)表位重組蛋白。

8.如權利要求7所述的非洲豬瘟病毒疫苗，其特征在于，還包括免疫學上可接受的載體和/或輔料。

9.權利要求1～3任意一項所述的非洲豬瘟串聯(lián)表位重組蛋白或權利要求4～6任意一項所述的制備方法制得的非洲豬瘟串聯(lián)表位重組蛋白或權利要求7或8所述的非洲豬瘟病毒疫苗在制備預防非洲豬瘟病毒產(chǎn)品中的應用。

技術總結
本發(fā)明提供了一種非洲豬瘟串聯(lián)表位重組蛋白及其制備方法和應用，屬于多表位疫苗技術領域。本發(fā)明將多種優(yōu)勢抗原的表位進行預測，取其最優(yōu)的抗原表位，并進行串聯(lián)形成非洲豬瘟串聯(lián)表位重組蛋白，對其進行了小鼠免疫和細胞免疫，證明該重組抗原具有較強的免疫原性。本發(fā)明制備的非洲豬瘟串聯(lián)表位重組蛋白疫苗比傳統(tǒng)疫苗更具有安全性，有良好的免疫原性且具有多個抗原的靶點，比單一靶點的亞單位疫苗更具有免疫原性。

技術研發(fā)人員：陳澤良,牛敬淇,祁安東,劉穎,焦洋,張燚,韓小虎
受保護的技術使用者：東沃同泰（鳳城）生物工程有限公司
技術研發(fā)日：
技術公布日：2024/10/10