本發(fā)明涉及一種鐮孢菌及其在人參皂苷rd生物轉(zhuǎn)化中的應用，具體涉及一種鐮孢菌（fusarium?foetens）xg-1以及其將人參皂苷rb1轉(zhuǎn)化為rd的應用。

背景技術：

0、技術背景

1、人參皂苷是人參屬植物（人參、三七、西洋參等）主要的活性成分之一，具有很高的藥理活性和藥用價值。人參皂苷根據(jù)皂苷元結(jié)構(gòu)可分為三類：原人參二醇、原人參三醇和齊墩果酸。人參皂苷rd是一種原人參二醇皂苷，與其它原人參皂苷（rb1，rb2，rc）相比，其糖鏈較短，更容易被人體腸道吸收。廣泛研究表明人參皂苷rd對神經(jīng)系統(tǒng)具有保護功能，如修復細胞損傷引起的神經(jīng)毒氣或缺血性中風、促進神經(jīng)干細胞分化為星形膠質(zhì)細胞、通過調(diào)節(jié)內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)增加神經(jīng)細胞的存活率等；還可作為心血管系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)的保護劑。同時，人參皂苷rd還具有較高的抗腫瘤、抗炎藥理活性。

2、人參皂苷rd在人參屬植物中含量較少，難以直接從植物中分離，人體口服后可由其他藥理活性較低的二醇型皂苷（rb1、rb2、rc）經(jīng)腸道微生物轉(zhuǎn)化生成，但利用率仍然很低。由于微生物轉(zhuǎn)化具有反應條件溫和，成本低廉，反應條件易于控制等優(yōu)點，許多學者利用微生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化含量較高的人參皂苷rb1來制備更多皂苷rd，但是在轉(zhuǎn)化過程中往往有副產(chǎn)物產(chǎn)生，經(jīng)rd進一步轉(zhuǎn)化為rg3、f2、ck等皂苷，導致轉(zhuǎn)化率低，使得rd單體的制備受到很大的限制。

技術實現(xiàn)思路

1、針對人參皂苷rd單體制備受限的問題，本發(fā)明提供了一種鐮孢菌（fusariumfoetens）xg-1菌株，該菌株是從西洋參中分離得到，經(jīng)驗證，其能將人參皂苷rb1快速轉(zhuǎn)化成人參皂苷rd，轉(zhuǎn)化率高且無副產(chǎn)物的產(chǎn)生，為獲得人參皂苷rd提供了理想的途徑，可滿足臨床上人參皂苷rd的需要，提高了人參皂苷rd的利用率。

2、本發(fā)明提供了一株高效轉(zhuǎn)化人參皂苷rb1為rd的內(nèi)生真菌菌株鐮孢菌（fusariumfoetens）xg-1。該菌株xg-1分離自西洋參須根中，通過固體培養(yǎng)、分離純化得到。本發(fā)明的xg-1菌株能夠高效、專一地轉(zhuǎn)化人參皂苷rb1為人參皂苷rd，所需的時間短、轉(zhuǎn)化率高、綠色無污染，易于實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，應用前景廣闊。

3、本發(fā)明鐮孢菌（fusarium?foetens）xg-1已于2023年4月6日保藏于中國普通微生物菌種保藏與管理中心，保藏編號為?cgmcc?no.40556，該菌株在保藏時的菌株名稱為sqd2110_0535.xg-1,分類命名為fusarium?foetens。

4、本發(fā)明還提供了一種菌劑，該菌劑包含上述鐮孢菌（fusarium?foetens）xg-1。

5、本發(fā)明還提供了上述鐮孢菌（fusarium?foetens）xg-1或上述菌劑在制備人參皂苷rd中的應用。該應用具體指的是：將人參皂苷rb1轉(zhuǎn)化為人參皂苷rd。

6、本發(fā)明還提供了一種將人參皂苷rb1轉(zhuǎn)化為人參皂苷rd的方法，該方法包括：采用上述鐮孢菌（fusarium?foetens）xg-1將人參皂苷rb1轉(zhuǎn)化為人參皂苷rd。

7、進一步的，所述鐮孢菌（fusarium?foetens）xg-1以固體菌劑、液體的菌液或其代謝產(chǎn)物的形式存在。

8、進一步的，上述方法中，包括以下步驟：將無菌pda液體培養(yǎng)基和人參皂苷rb1混合，然后接種鐮孢菌（fusarium?foetens）xg-1，然后控制溫度進行反應，將人參皂苷rb1轉(zhuǎn)化為人參皂苷rd。

9、人參皂苷rb1轉(zhuǎn)化為人參皂苷rd的反應式如下：

10、

11、進一步的，人參皂苷rb1以溶液形式加入，溶劑為甲醇。

12、進一步的，人參皂苷rb1溶液的濃度為8-12mg/ml，人參皂苷rb1溶液與無菌pda液體培養(yǎng)基的體積比為1:18-20。

13、進一步的，所述無菌pda液體培養(yǎng)基可以直接從市場上購買得到。

14、進一步的，鐮孢菌（fusarium?foetens）xg-1通過種子液的形式加入，種子液的培養(yǎng)方式為：將鐮孢菌（fusarium?foetens）xg-1菌株按照2-5wt%的接種量接入pda液體培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)，按照26-28℃、150-180r/min的條件在搖床上培養(yǎng)6-9天，得到種子液。種子液按照與無菌pda液體培養(yǎng)基的體積比為20:15-20的接種量接入，對人參皂苷rb1進行轉(zhuǎn)化。

15、進一步的，上述體系中還含有幾丁質(zhì)酶，幾丁質(zhì)酶可以去掉鐮孢菌的細胞壁，使其活性物質(zhì)更快發(fā)揮作用。幾丁質(zhì)酶按照與無菌pda培養(yǎng)液的體積比為10:15-20的用量加入。

16、進一步的，幾丁質(zhì)酶的加入順序無特別要求，可以在菌種加入前加入，也可以在菌種加入后加入。例如，可以為：將無菌pda液體培養(yǎng)基和人參皂苷rb1混合，然后接種鐮孢菌（fusarium?foetens）xg-1，再加入幾丁質(zhì)酶，然后控制溫度進行反應，將人參皂苷rb1轉(zhuǎn)化為人參皂苷rd。

17、進一步的，加入鐮孢菌（fusarium?foetens）xg-1后，可以直接在26-28℃下?lián)u床培養(yǎng)7-10d，進行轉(zhuǎn)化反應；也可以先升溫至40-42℃反應20-60min，再在26-28℃下?lián)u床培養(yǎng)7-10d，進行轉(zhuǎn)化反應，優(yōu)選采用第二種方式。本發(fā)明在轉(zhuǎn)化時，先經(jīng)短時高溫處理，可以使得鐮孢菌應激脅迫反應，并提高了幾丁質(zhì)酶的活性，使得鐮孢菌的活性物質(zhì)能夠高效轉(zhuǎn)化人參皂苷。

18、進一步的，搖床培養(yǎng)時，搖床的振動速度一般為150-200?r/min，例如150?r/min、160?r/min、170?r/min、180?r/min、190?r/min、200?r/min。

19、進一步的，轉(zhuǎn)化完成后，加入與總反應溶液等體積的水飽和正丁醇溶液停止反應。

20、與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)勢：

21、1、本發(fā)明從西洋參中分離得來fusarium?foetens?xg-1菌株，該xg-1菌株轉(zhuǎn)化效率高，轉(zhuǎn)化特異性高，可選擇性高效快速轉(zhuǎn)化人參皂苷rb1為人參皂苷rd，轉(zhuǎn)化率最高可達91.73％。

22、2、本發(fā)明人參皂苷rb1轉(zhuǎn)化成人參皂苷rd的方法反應條件溫和，成本低廉，反應條件易于控制，人參皂苷rd轉(zhuǎn)化率高且無副產(chǎn)物產(chǎn)生，方便實現(xiàn)人參皂苷rd的工業(yè)化生產(chǎn)，滿足了臨床需要，同時期望解決人參屬（人參、三七、西洋參等）常用中藥材資源緊缺的問題。

23、3、本發(fā)明的菌株易培養(yǎng)純化，轉(zhuǎn)化操作簡單易于執(zhí)行，取材方便，且無副產(chǎn)物的產(chǎn)生，轉(zhuǎn)化后人參皂苷rd可用于臨床藥物等，提高了人參皂苷rd的制備率。

24、保藏信息

25、本發(fā)明所述鐮孢菌（fusarium?foetens）xg-1已保藏于中國普通微生物菌種保藏與管理中心，保藏編號為cgmcc?no.40556，保藏日期為2023年4月6日，保藏地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，郵編：100101。

技術特征：

1.一種鐮孢菌（fusarium?foetens）xg-1，其特征是：保藏編號為cgmcc?no.40556。

2.一種菌劑，其特征是：包含權利要求1所述的鐮孢菌（fusarium?foetens）xg-1。

3.權利要求1所述的鐮孢菌（fusarium?foetens）xg-1或權利要求2所述的菌劑在制備人參皂苷rd中的應用。

4.根據(jù)權利要求3所述的應用，其特征是：鐮孢菌（fusarium?foetens）xg-1或菌劑將人參皂苷rb1轉(zhuǎn)化為人參皂苷rd。

5.一種將人參皂苷rb1轉(zhuǎn)化為人參皂苷rd的方法，其特征是：采用權利要求1所述的鐮孢菌（fusarium?foetens）xg-1將人參皂苷rb1轉(zhuǎn)化為人參皂苷rd。

6.根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征是：將無菌pda液體培養(yǎng)基和人參皂苷rb1混合，然后接種鐮孢菌（fusarium?foetens）xg-1，將人參皂苷rb1轉(zhuǎn)化為人參皂苷rd。

7.根據(jù)權利要求5或6所述的方法，其特征是：鐮孢菌（fusarium?foetens）xg-1通過種子液的形式加入，種子液的培養(yǎng)方式為：將鐮孢菌（fusarium?foetens）xg-1菌株按照2-5wt%的接種量接入pda液體培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)，按照26-28℃、150-180r/min的條件在搖床上培養(yǎng)6-9天，得到種子液；優(yōu)選的，種子液按照與無菌pda液體培養(yǎng)基的體積比為20:15-20的接種量接入，對人參皂苷rb1進行轉(zhuǎn)化。

8.根據(jù)權利要求6所述的方法，其特征是：人參皂苷rb1以溶液形式加入，人參皂苷rb1溶液的濃度為8-12mg/ml，人參皂苷rb1溶液與無菌pda液體培養(yǎng)基的體積比為1:18-20。

9.根據(jù)權利要求6或8所述的方法，其特征是：體系中還含有幾丁質(zhì)酶，幾丁質(zhì)酶與無菌pda培養(yǎng)液的體積比為10:15-20。

10.根據(jù)權利要求6-9中任一項所述的方法，其特征是：加入鐮孢菌（fusariumfoetens）xg-1后，先升溫至40-42℃反應20-60min，再在26-28℃下?lián)u床培養(yǎng)7-10d，進行轉(zhuǎn)化反應；優(yōu)選的，搖床的振動速度為150-200?r/min。

技術總結(jié)
本發(fā)明公開了一種鐮孢菌及其在人參皂苷Rd生物轉(zhuǎn)化中的應用，本發(fā)明從西洋參須根中分離得到一種新的鐮孢菌，其可將人參皂苷Rb1快速轉(zhuǎn)化成人參皂苷Rd，轉(zhuǎn)化率高、綠色無污染，易于實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，應用前景廣闊。

技術研發(fā)人員：周潔,王悅,李瑞,方磊
受保護的技術使用者：濟南大學
技術研發(fā)日：
技術公布日：2024/12/2