本發(fā)明涉及一種水產(chǎn)動物疫苗安全評價方法。

背景技術(shù)：

1、疫苗是抵抗疫病的有效手段，作為新型疫苗——基因工程疫苗具有安全、高效、成本低、易于創(chuàng)制多聯(lián)多價疫苗的優(yōu)點(diǎn)，近年來逐漸成為主要研發(fā)疫苗類型。與傳統(tǒng)滅活疫苗不同的是基因工程疫苗需要開展轉(zhuǎn)基因生物安全評價。水產(chǎn)動物生活在水中，與陸生動物相比較，轉(zhuǎn)基因安全評價研究場地及技術(shù)均有特殊性。水產(chǎn)轉(zhuǎn)基因生物在獲得轉(zhuǎn)基因安全證書之前嚴(yán)禁流入環(huán)境，因此轉(zhuǎn)基因安全評價場地及養(yǎng)殖設(shè)施要求較高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供了一種水產(chǎn)動物疫苗轉(zhuǎn)基因生物安全評價方法。

2、本發(fā)明水產(chǎn)動物疫苗轉(zhuǎn)基因生物安全評價方法按照以下步驟進(jìn)行：

3、一、免疫冷水模式魚：將冷水模式魚隨機(jī)分為兩組：空白組和免疫組，其中空白對照組注射0.05ml/尾的pbs緩沖溶液，免疫組背鰭基部肌肉注射待測試核酸疫苗；然后將2組冷水模式魚置于水箱中飼養(yǎng)；其中待測試核酸疫苗的劑量為0.05ml/尾；

4、二、核酸疫苗環(huán)境存留與轉(zhuǎn)移檢測：向步驟一中的免疫組和對照組的養(yǎng)殖水體加入200ml菌體濃度為1×107cfu/ml的大腸肝菌dh5α懸液，在不同成長日時間點(diǎn)取水樣和水底糞便，提取dna，再利用pcr方法檢測虹鱒養(yǎng)殖水環(huán)境及糞便中核酸疫苗質(zhì)粒dna的存在情況，監(jiān)測免疫虹鱒糞便及水體環(huán)境的是否含有核酸疫苗的重組質(zhì)粒；

5、如果未監(jiān)測到含有核酸疫苗質(zhì)粒，則未發(fā)生核酸疫苗隨糞便途徑向免疫動物個體外環(huán)境轉(zhuǎn)移；如果監(jiān)測到含有核酸疫苗質(zhì)粒，則發(fā)生核酸疫苗隨糞便途徑向免疫動物個體外環(huán)境轉(zhuǎn)移；從而確定待測試水產(chǎn)動物疫苗轉(zhuǎn)基因生物的安全性。

6、進(jìn)一步檢測：取冷水模式魚養(yǎng)殖水環(huán)境及糞便用抗性平板進(jìn)行篩選，選能在抗性平板上生長的菌落取樣進(jìn)行16s的pcr測序鑒定，并對鑒定為大腸桿菌的抗性菌進(jìn)行質(zhì)粒提取，再對質(zhì)粒進(jìn)行序列測定，測定質(zhì)粒是否包含核酸疫苗基因序列；從而進(jìn)一步確定待測試水產(chǎn)動物疫苗轉(zhuǎn)基因生物的安全性；所述抗性平板含有與核酸疫苗對應(yīng)的抗生素。

7、本發(fā)明安全評價方法通過分析免疫核酸疫苗質(zhì)粒后的虹鱒糞便及水體環(huán)境的重組質(zhì)粒含量，探究質(zhì)粒向免疫動物個體外的環(huán)境轉(zhuǎn)移情況。檢驗(yàn)免疫后虹鱒所處環(huán)境中細(xì)菌能否從質(zhì)粒pihnch-g處獲取抗生素抗性，以大腸桿菌為指示菌進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)了水產(chǎn)動物疫苗轉(zhuǎn)基因生物安全評價。本發(fā)明的方法操作簡單，安全性高，便有推廣和使用。

技術(shù)特征：

1.一種水產(chǎn)動物疫苗轉(zhuǎn)基因生物安全評價方法，其特征在于水產(chǎn)動物疫苗轉(zhuǎn)基因生物安全評價方法按照以下步驟進(jìn)行：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種水產(chǎn)動物疫苗轉(zhuǎn)基因生物安全評價方法，其特征在于，進(jìn)一步檢測：取冷水模式魚養(yǎng)殖水環(huán)境及糞便用抗性平板進(jìn)行篩選，選能在抗性平板上生長的菌落取樣進(jìn)行16s的pcr測序鑒定，并對鑒定為大腸桿菌的抗性菌進(jìn)行質(zhì)粒提取，再對質(zhì)粒進(jìn)行序列測定，測定質(zhì)粒是否包含核酸疫苗基因序列；從而進(jìn)一步確定待測試水產(chǎn)動物疫苗轉(zhuǎn)基因生物的安全性；所述抗性平板含有與核酸疫苗對應(yīng)的抗生素。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種水產(chǎn)動物疫苗轉(zhuǎn)基因生物安全評價方法，其特征在于步驟一中冷水模式魚為虹鱒。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種水產(chǎn)動物疫苗轉(zhuǎn)基因生物安全評價方法，其特征在于步驟一中冷水模式魚養(yǎng)育環(huán)境：選擇單獨(dú)池塘或排水池塘，相鄰池塘內(nèi)不飼養(yǎng)任何魚類，且周圍有柵欄和防護(hù)網(wǎng)，有效防止鳥類隨意出入；制定進(jìn)出入管理制度，設(shè)置門鎖，專人管理；配置監(jiān)控設(shè)備，全天無死角24小時實(shí)時監(jiān)測池塘狀態(tài)。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種水產(chǎn)動物疫苗轉(zhuǎn)基因生物安全評價方法，其特征在于步驟一中所述2組冷水模式魚置于水箱中飼養(yǎng)，即在不銹鋼制循環(huán)水箱里，水箱外有流水降溫，水箱與流水隔離，無水體交換；水箱的循環(huán)水經(jīng)循環(huán)后，排出的廢水經(jīng)二級處理池進(jìn)行消毒處理，檢測合格后排放；且二級處理池共兩組，能應(yīng)對排出水體的消毒處理需求。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種水產(chǎn)動物疫苗轉(zhuǎn)基因生物安全評價方法，其特征在于步驟二中pcr方法中采用引物對抗原蛋白g基因ihnv-g/f和ihnv-g/r，卡那霉素抗性基因neor?f/neo?r?r，氨芐青霉素抗性基因ampr?1-f/ampr?1-r；

技術(shù)總結(jié)
一種水產(chǎn)動物疫苗轉(zhuǎn)基因生物安全評價方法，本發(fā)明涉及一種水產(chǎn)動物疫苗安全評價方法。本發(fā)明方法：一、免疫冷水模式魚；二、核酸疫苗環(huán)境存留與轉(zhuǎn)移檢測。本發(fā)明安全評價方法通過分析免疫核酸疫苗質(zhì)粒后的虹鱒糞便及水體環(huán)境的重組質(zhì)粒含量，探究質(zhì)粒向免疫動物個體外的環(huán)境轉(zhuǎn)移情況。檢驗(yàn)免疫后虹鱒所處環(huán)境中細(xì)菌能否從質(zhì)粒pIHNch?G處獲取抗生素抗性，以大腸桿菌為指示菌進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)了水產(chǎn)動物疫苗轉(zhuǎn)基因生物安全評價。本發(fā)明的方法操作簡單，安全性高，便有推廣和使用。

技術(shù)研發(fā)人員：徐黎明,趙景壯,盧彤巖,邵軼智
受保護(hù)的技術(shù)使用者：中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/17