本發(fā)明屬于基因工程，涉及一種轉(zhuǎn)運蛋白yaaj在提高菌株d-泛酸產(chǎn)量中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、d-泛酸(dpa)常稱為d-泛酸鈣，是一種水溶性b族維生素，又稱維生素b5、3-吡啶羧酸酰胺，廣泛的存在于動植物中，在人體內(nèi)參與脂肪的降解、檸檬酸循環(huán)、抗體的合成和脂肪酸的降解等代謝，發(fā)揮著重要的生理功能，因而在醫(yī)藥、保健品、化妝品、食品、飼料等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用。

2、目前工業(yè)上d-泛酸鈣的生產(chǎn)工藝有兩種，分別為全化學(xué)合成法和化學(xué)合成與酶催化組合法。

3、這兩種工藝都會用到中間體dl-泛酸內(nèi)酯，dl-泛酸內(nèi)酯大多使用化學(xué)法進行拆分，手性拆分費用昂貴，且會用到有毒的氰化物，對環(huán)境有污染和毒性問題，中國化工行業(yè)對環(huán)保的要求日益嚴格，對氰化物的環(huán)保要求更多，不利于產(chǎn)業(yè)的擴大。

4、近年來國內(nèi)外許多科研人員都在研究利用基因工程菌通過發(fā)酵法生產(chǎn)泛酸鈣，我們在公布號為cn118165902a的專利文件中公開了一種大腸桿菌發(fā)酵菌株cgmcc?no.29714(編號ecoli?w21)，其d-泛酸鈣發(fā)酵產(chǎn)量能達到49.95g/l。但與化學(xué)法相比，利用葡萄糖和β-丙氨酸通過發(fā)酵生產(chǎn)d-泛酸的成本依然很高，需要更多地提高d-泛酸鈣發(fā)酵水平。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、我們在對大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)d-泛酸鈣的持續(xù)研究中，基于d-泛酸鈣的生物合成途徑，對于可能正向調(diào)控d-泛酸合成基因的調(diào)控因子/轉(zhuǎn)運蛋白進行了系統(tǒng)考察，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)運蛋白yaaj(genebank編號944745)能夠促進文獻cn118165902a中公開的包括ecoli?w21(cgmccno.29714)等在內(nèi)的大腸桿菌工程菌的d-泛酸鈣發(fā)酵水平提高，暗示轉(zhuǎn)運蛋白yaaj可能廣泛用于d-泛酸生產(chǎn)菌的改良。具體而言，本發(fā)明包括如下技術(shù)方案。

2、本發(fā)明的第一方面提供了轉(zhuǎn)運蛋白yaaj在提高菌株d-泛酸產(chǎn)量中的應(yīng)用。

3、上述的應(yīng)用可以為一種提高菌株d-泛酸產(chǎn)量的方法，包括下述步驟：使d-泛酸生產(chǎn)菌過表達轉(zhuǎn)運蛋白yaaj(genebank編號944745)，該轉(zhuǎn)運蛋白yaaj的氨基酸序列為seq?idno:2。

4、mpdffsfinsvlwgsvmiyllfgagcwftfrtgfvqfryirqfgkslknsihpqpggltsfqslctslaarvgsgnlagvalaitaggpgavfwmwvaafigmatsfaecslaqlykerdvngqfrggpawymarglgmrwmgvlfavflliaygiifsgvqanavaralsfsfdfpplvtgiilavftllaitrglhgvarlmqgfvplmaiiwvltslvicvmnigqlphviwsifesafgwqeaaggaagytlsqaitngfqrsmfsneagmgstpnaaaaaaswpphpaaqgivqmigifidtlvictasamlillagngttymplegiqliqkamrvlmgswgaefvtlvvilfafssivanyiyaennlfflrlnnpkaiwclrictfatviggtllslplmwqladiimacmaitnltailllspvvhtiasdylrqrklgvrpvfdplrypdigrqlspdawddvsqe(seq?id?no:2)。

5、優(yōu)選地，上述d-泛酸生產(chǎn)菌是大腸桿菌工程菌。

6、可選地，上述大腸桿菌工程菌的宿主菌是公布號為cn118165902a的專利文件中報道的菌株ecoli?w21即cgmcc?no.29714。

7、在一種實施方式中，上述轉(zhuǎn)運蛋白yaaj(genebank編號944745)的編碼基因的核苷酸序列為seq?id?no:1。

8、上述方法中，大腸桿菌工程菌過表達所述轉(zhuǎn)運蛋白yaaj(genebank編號944745)可以通過下述方式實施：

9、a.在d-泛酸生產(chǎn)菌宿主菌基因組中所述轉(zhuǎn)運蛋白yaaj的上游插入強啟動子；

10、b.在d-泛酸生產(chǎn)菌宿主菌基因組中整合一個以上、優(yōu)選兩個以上、三個以上、四個以上、六個以上、八個以上拷貝的拷貝所述轉(zhuǎn)運蛋白yaaj的編碼基因；并且/或者

11、c.在d-泛酸生產(chǎn)菌宿主菌基因組中以質(zhì)粒形式表達轉(zhuǎn)運蛋白yaaj的編碼基因。

12、可選地，上述步驟a或b是通過將包含所述轉(zhuǎn)運蛋白yaaj編碼基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入宿主菌中而實現(xiàn)，優(yōu)選質(zhì)粒載體是ptrc99a。所述重組質(zhì)粒例如是本文中的ptrc99a-yaaj。

13、在一種實施方式中，上述步驟a中所述強啟動子的插入方式、步驟b中所述基因組中的轉(zhuǎn)運蛋白yaaj編碼基因整合方式選自質(zhì)粒轉(zhuǎn)化和基因編輯技術(shù)。

14、在該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入宿主菌細胞后，該轉(zhuǎn)運蛋白yaaj編碼基因可以整合在染色體上的多拷貝序列位點或者多個位點。

15、上述基因編輯技術(shù)可以選自下組：同源雙交換，talen系統(tǒng)，crispr-cas9系統(tǒng)，crispr-cpf1系統(tǒng)，crispr-cas12系統(tǒng)，crispr-best系統(tǒng)，mugent(multiplex?genomeediting?by?natural?transformation，通過自然轉(zhuǎn)化進行多重基因組編輯)等。

16、本發(fā)明的第二個方面提供了一種用于構(gòu)建上述過表達所述轉(zhuǎn)運蛋白yaaj的大腸桿菌工程菌的重組質(zhì)粒(或稱重組載體)，該質(zhì)粒載體是適合于在細菌例如大腸桿菌中表達外源基因的質(zhì)粒，并且包含所述轉(zhuǎn)運蛋白yaaj編碼基因。

17、該重組質(zhì)粒的質(zhì)粒載體/骨架是ptrc99a或者選自pet系列，比如載體是pet22b、pet24a、pet28a等，但并不受限于此。

18、優(yōu)選地，重組質(zhì)粒是本文中的ptrc99a-yaaj，其核苷酸序列如seq?id?no:3所示。

19、本發(fā)明的第三個方面提供了一種過表達上述轉(zhuǎn)運蛋白yaaj的大腸桿菌工程菌，其基因組中整合了如上所述的轉(zhuǎn)運蛋白yaaj編碼基因；或者是在宿主菌中轉(zhuǎn)化了如上所述重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子，并且該宿主菌本身是d-泛酸生產(chǎn)菌例如是保藏編號為cgmccno.29714的大腸桿菌。

20、本發(fā)明的第四個方面提供了上述大腸桿菌工程菌在發(fā)酵法生產(chǎn)d-泛酸中的用途。

21、本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了來源于大腸桿菌例如escherichia?coli?mg1655的轉(zhuǎn)運蛋白yaaj(genebank編號944745)對于菌株合成d-泛酸具有正調(diào)控作用，實驗表明其在d-泛酸生產(chǎn)菌中過表達能夠有效提高d-泛酸產(chǎn)量，發(fā)酵水平相較可以提高20％，具有良好的工業(yè)應(yīng)用前景。

技術(shù)特征：

1.轉(zhuǎn)運蛋白yaaj在提高菌株d-泛酸產(chǎn)量中的應(yīng)用。

2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其為一種提高菌株d-泛酸產(chǎn)量的方法，其特征在于，包括下述步驟：使d-泛酸生產(chǎn)菌過表達轉(zhuǎn)運蛋白yaaj(genebank編號944745)，該轉(zhuǎn)運蛋白yaaj的氨基酸序列為seq?id?no:2。

3.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述d-泛酸生產(chǎn)菌是大腸桿菌工程菌。

4.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述轉(zhuǎn)運蛋白yaaj的編碼基因的核苷酸序列為seq?id?no:1。

5.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，過表達所述轉(zhuǎn)運蛋白yaaj通過下述方式實施：

6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟b是通過將包含所述轉(zhuǎn)運蛋白yaaj編碼基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入宿主菌中而實現(xiàn)。

7.一種如權(quán)利要求6中所述的重組質(zhì)粒，其特征在于，該質(zhì)粒載體是適合于在細菌例如大腸桿菌中表達外源基因的質(zhì)粒，并且包含所述轉(zhuǎn)運蛋白yaaj的編碼基因。

8.如權(quán)利要求7所述的重組質(zhì)粒，其特征在于，其核苷酸序列如seq?id?no:3所示。

9.一種過表達如權(quán)利要求1中所述轉(zhuǎn)運蛋白yaaj的大腸桿菌工程菌，其特征在于，在基因組中整合了轉(zhuǎn)運蛋白yaaj的編碼基因；或者是在宿主菌中轉(zhuǎn)化了如權(quán)利要求7或8所述重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子，并且該宿主菌是d-泛酸生產(chǎn)菌。

10.如權(quán)利要求9所述大腸桿菌工程菌在發(fā)酵法生產(chǎn)d-泛酸中的用途。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了轉(zhuǎn)運蛋白yaaJ在提高菌株D?泛酸產(chǎn)量中的應(yīng)用，所述轉(zhuǎn)運蛋白yaaJ的氨基酸序列如SEQ?ID?NO:2所示。所述轉(zhuǎn)運蛋白yaaJ可顯著提高重組菌株的D?泛酸發(fā)酵產(chǎn)量，具有良好的工業(yè)應(yīng)用前景。

技術(shù)研發(fā)人員：王金剛,任亮,步緒亮,梁巖,韋炎龍
受保護的技術(shù)使用者：上海邦林生物科技有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/19