本發(fā)明犬冠狀病毒和犬細小病毒的檢測領域，具體涉及一種檢測犬冠狀病毒和犬細小病毒的核酸組合物、試劑盒及應用。

背景技術：

1、犬冠狀病毒（ caninecoronavirus，ccv）為單股正鏈rna病毒，有6~7種多肽，其中4種是糖肽，不含rna聚合酶及神經氨酸酶。犬冠狀病毒是一種嚴重危害養(yǎng)犬業(yè)、經濟動物養(yǎng)殖業(yè)和野生動物保護的病毒性傳染病病源?？墒谷l(fā)生程度不同的胃腸炎癥狀，特征有頻繁嘔吐、腹瀉、沉郁、厭食等癥狀。本病一年四季均可發(fā)生，以冬季多發(fā)，病犬是主要的傳染源，犬可通過呼吸道、消化道、糞便及污染物傳染。該病一旦發(fā)生，同窩犬同室犬很難控制均可造成感染。該病經常和犬細小病毒，輪狀病毒及其他胃腸道疾病混合感染，幼犬死亡率較高。犬細小病毒（ canineparvovirus，cpv）屬細小病毒科，細小病毒屬。cpv主要感染犬，尤其幼犬，傳染性極強，死亡率也較高。

2、常見的ccv和cpv檢測方法主要有臨床癥狀觀察、血清學檢測、免疫血清學試驗、病毒分離、膠體金試紙板檢測、免疫熒光試紙檢測、普通pcr擴增、實時熒光定量pcr檢測、實時熒光環(huán)介導等溫擴增檢測等。病毒分離培養(yǎng)是鑒定ccv和cpv的金標準，特異性較強，但操作復雜并費時費力，需要實驗操作熟練的技術人員在專業(yè)的細胞培養(yǎng)設備中培養(yǎng)增殖，并且病毒分離和血凝試驗在病毒感染前期容易造成假陰性結果，靈敏度不高。應用電子顯微鏡可以對病毒這類超微小的病原體進行形態(tài)學觀察，這是直接對病原體進行判定的標準方法，但是受制于設備昂貴、養(yǎng)護復雜，還要求觀測人員有熟練判別的經驗，不能實時檢測并且難以應用于現場診斷，故存在一定局限性。膠體金試紙板檢測是通過膠體金免疫層析法，樣本抗原與膠體金標記的抗體結合，形成金標抗原抗體復合物并檢測出結果，此方法操作簡單迅速，但當病毒含量較低時容易出現假陰性，導致醫(yī)生漏診。免疫熒光實驗是將帶有標記熒光分子的抗體或抗原與對應的抗原或抗體特異性結合后，利用熒光顯微鏡觀測特異性熒光進行病原檢測的方法，這種方法雖然靈敏度較高，但也存在非特異性結合，且切片不易長期保存，成本也較高，無法廣泛應用于基層單位。實時熒光pcr檢測是通過將標有熒光素的taq-man探針與樣本抗原dna和引物混合并擴增，擴增過程中通過特定光照射游離的熒光素產生熒光，進而求得ct值。此方法檢測結果準確，可同時檢測多個樣本，但成本高，操作耗時。

技術實現思路

1、有鑒于此，本發(fā)明提供了檢測犬冠狀病毒和犬細小病毒的核酸組合物、試劑盒及應用，以至少一定程度上解決上述技術問題之一。

2、本發(fā)明目的之一提供檢測犬冠狀病毒和犬細小病毒的核酸組合物。所述核酸組合物包括：如seq?id?no:1~4所述的dna分子。

3、本發(fā)明目的之一提供檢測犬冠狀病毒和犬細小病毒的比色傳感試劑盒。該試劑盒包括：生物素化如seq?id?no:1的dna分子，生物素化如seq?id?no:3的dna分子，烷氨基化如seq?id?no:2的dna分子，烷氨基化如seq?id?no:4的dna分子。

4、具體的，所述烷氨基化為丁氨基化。

5、具體的，該試劑盒還包括偶聯物。

6、具體的，所述偶聯物的制備方法包括：

7、（1）取5mg鐵基金屬有機骨架重懸于4.4mlpbs緩沖液（10mmol/l，ph7.4）中，超聲5min；

8、（2）然后加入250μledc（1.0mol/l）和250μlnhs（0.4mol/l）溶液，室溫孵育1h；

9、（3）然后加入100μl丁氨基適配體2（10μmol/l）和丁氨基適配體4（10μmol/l），37℃孵育12h；

10、（4）反應結束后以10000r/min離心10min，去上清，沉淀用pbs（10mmol/l，ph7.4）洗滌3次，將制備的鐵基金屬有機骨架與丁氨基適配體2以及丁氨基適配體4的偶聯物分散于5mlph7.4的結合緩沖液中，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

11、本發(fā)明的目的之一提供一種檢測犬冠狀病毒和犬細小病毒的方法。該方法包括：

12、（1）將生物素化如seq?id?no:1的dna分子或生物素化如seq?id?no:3的dna分子用結合緩沖液稀釋至100nmol/l，取200μl加入到酶標板反應孔中，溫育20min；

13、（2）每孔用pbst緩沖液（10mmol/pbs，0.05%tween-20）洗滌3次，棄去孔內溶液，加入200μl?bsa（10g/l）封閉溶液，4℃條件下封閉2h，棄去封閉液，以pbst洗滌3次；

14、（3）加入200μl待測樣品溶液，同時做空白對照和陽性對照孔，室溫孵育20min，棄去待測液，pbst洗滌；

15、（4）加入200μl偶聯物（0.8mg/ml）溶液，室溫孵育20min，棄去孔中反應液，pbst洗滌。加入100μltmb-h2o2顯色液，室溫反應20min后加入50μl硫酸（2mol/l）；

16、（5）采用酶標儀測定652nm處的吸光度，通過標準曲線計算待測病毒的含量。

17、具體的，結合緩沖液為含1.6g/ml?nacl、0.04g/ml?kcl、0.04g/ml?kh2po4、0.02g/ml?cacl2、0.23g/ml?na2hpo4和0.02g/ml?mgcl2?的ph7.4溶液。

18、本發(fā)明的目的之一提供一種核酸組合物在檢測犬冠狀病毒和犬細小病毒中的應用。該核酸組合物包括：如seq?id?no:1~4所述的dna分子。

19、與現有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

20、本發(fā)明提供的檢測犬冠狀病毒的適配體，具有與ccv的e蛋白的高度親和性，能夠有效捕獲和檢測病毒體。

21、本發(fā)明提供的檢測犬細小病毒的適配體，具有與cpv的vp2蛋白的高度親和性，能夠有效捕獲和檢測病毒體。

22、本發(fā)明提供的檢測犬細小病毒的試劑盒，通過制備生物素化的適配體和烷氨基化適配體，并以生物素化適配體作為捕獲病毒的載體，以偶聯于鐵基金屬有機骨架的適配體作為檢測載體，能夠構建比色傳感檢測試劑盒。該試劑盒能夠單獨或同時檢測ccv或cpv，檢測靈敏度高，特異性強。并且，該檢測試劑盒能有效避免其他類似病毒干擾，無交叉反應性。

23、另外，本發(fā)明提供的試劑盒相對于商業(yè)elisa試劑盒具有更高的檢測敏感性、特異性和準確性，檢測過程具有無創(chuàng)、簡便、經濟等特點，于犬病毒檢測領域具有良好的應用前景。

技術特征：

1.檢測犬冠狀病毒和犬細小病毒的核酸組合物，所述核酸組合物包括：如seq?id?no:1~4所示的dna分子。

2.檢測犬冠狀病毒和犬細小病毒的比色傳感試劑盒，包括：生物素化如seq?id?no:1所示的dna分子，生物素化如seq?id?no:3所示的dna分子，烷氨基化如seq?id?no:2所示的dna分子，烷氨基化如seq?id?no:4所示的dna分子。

3.根據權利要求2所述的試劑盒，所述烷氨基化為丁氨基化。

4.根據權利要求2所述的試劑盒，還包括偶聯物。

5.根據權利要求4所述的試劑盒，所述偶聯物的制備方法包括：

技術總結
本發(fā)明犬細小病毒的檢測領域，具體涉及一種檢測犬冠狀病毒和犬細小病毒的核酸組合物、試劑盒及應用。該試劑盒通過制備生物素化的適配體和烷氨基化適配體，并以生物素化適配體作為捕獲病毒的載體，以偶聯于鐵基金屬有機骨架的適配體作為檢測載體，能夠構建比色傳感檢測試劑盒。該比色傳感試劑盒能夠單獨或同時檢測CCV或CPV，檢測靈敏度高，特異性強。并且，該檢測試劑盒能有效避免其他類似病毒干擾，無交叉反應性。

技術研發(fā)人員：黃挺,李杰,孫堯
受保護的技術使用者：上?；`生物科技有限公司
技術研發(fā)日：
技術公布日：2024/12/19