本發(fā)明屬于生物，具體涉及一種多肽模擬酶、固定化模擬酶及其在afb1降解上的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、afb1是目前已知毒性最強(qiáng)的黃曲霉毒素之一，被公認(rèn)為強(qiáng)致癌物。對于人類而言，較高水平的afb1暴露會導(dǎo)致黃曲霉毒素中毒癥，表現(xiàn)為嚴(yán)重的肝損傷，甚至可能致命。長期低劑量暴露與肝癌的發(fā)生密切相關(guān)，尤其是在感染乙型肝炎病毒的人群中。此外，afb1還能導(dǎo)致免疫抑制和兒童的生長發(fā)育遲緩。在動物中，afb1同樣會引發(fā)肝損傷、免疫力下降、生長停滯和繁殖能力減弱，這在家畜中尤其令人擔(dān)憂，因為被污染的飼料會直接影響動物的健康和生產(chǎn)力。為了減少黃曲霉毒素的危害，全球各地對食品和飼料中的黃曲霉毒素含量制定了嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)，并提出了作物管理和儲存建議，以防止霉菌的生長和毒素污染。

2、目前國內(nèi)外應(yīng)用于去除afb1的方法可分為物理法、化學(xué)法和生物法。物理法主要是采用吸附劑吸附、高溫加熱、輻照等方式去除afb1，化學(xué)法主要采用一些強(qiáng)氧化劑、強(qiáng)酸強(qiáng)堿等來破壞afb1的毒性位點，但這兩種方法會影響產(chǎn)品品質(zhì)、破壞營養(yǎng)成分，明顯不適用于食品脫毒，與傳統(tǒng)的物理和化學(xué)方法相比，生物方法中的酶降解通過生物催化的方式去除或降afb1，其條件溫和、特異性強(qiáng)、安全有效，且副產(chǎn)物毒性小，因此被視為降解afb1更有前途的策略。然而，天然酶的分離和純化費時、費力。同時在復(fù)雜環(huán)境中也面臨著穩(wěn)定性差、回收困難、可重復(fù)使用性有限等挑戰(zhàn)，嚴(yán)重限制了其實際應(yīng)用。模擬酶是一種受天然酶啟發(fā)的人工生物催化劑，與天然酶相比，模擬酶具有較高的催化效率、較簡單的結(jié)構(gòu)、較高的穩(wěn)定性等優(yōu)點，這些優(yōu)點也有助于模擬酶成為更廣泛應(yīng)用于實際工業(yè)應(yīng)用的催化劑?，F(xiàn)如今，已經(jīng)有報道了許多關(guān)于各種材料的模擬酶，例如磁性四氧化三鐵，碳納米管，金納米粒子，金屬有機(jī)框架以及多肽。這些模擬酶雖然具有高催化活性，但它們存在底物選擇性差、穩(wěn)定性差、重復(fù)使用性差等缺點，不僅如此，某些納米材料可能還會對環(huán)境和生物體產(chǎn)生潛在毒性，而制備高質(zhì)量、高性能的納米材料也需要復(fù)雜的合成過程，這些缺點都使其在實際應(yīng)用中面臨挑戰(zhàn)。其中多肽作為一種理想的生物分子，其結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)與天然酶具有極高相似性；不僅如此，多肽的結(jié)構(gòu)更簡單，更容易進(jìn)行修飾以及催化機(jī)理研究，制備過程也具有更高效率與更低成本；這些特性，奠定了多肽模擬酶能夠被廣泛構(gòu)建，并用于降解afb1；但在高溫等條件苛刻的條件下，降解效果并不佳，且常規(guī)的多肽模擬酶在均相條件下降解，不易分離。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)階段模擬酶在黃曲霉毒素b1降解上存在的問題，本發(fā)明提供了一種多肽模擬酶，為了進(jìn)一步提高酶模擬物在苛刻條件下的穩(wěn)定性和適用性，還提供了一種以金屬磷酸鹽結(jié)晶化合物為無機(jī)成分、以有前景的多肽模擬酶為有機(jī)成分來制造有機(jī)-無機(jī)雜化納米花的簡單固定方法，制備得到固定化酶，用于苛刻條件下的黃曲霉毒素b1降解。

2、本申請的技術(shù)方案如下：

3、本申請的第一個目的，保護(hù)一種多肽模擬酶，原料包括多肽與銅離子；

4、所述多肽的氨基酸序列，如seq?id?no.1所示，具體為ac-icvhlhlhvhi?-conh2；

5、所述多肽的n端進(jìn)行乙?；?，c端酰胺化。

6、根據(jù)本申請的一些實施例，所述多肽分子結(jié)構(gòu)為：

7、

8、和/或，所述銅離子與多肽濃度比為1-3:1。

9、本申請的第二個目的，保護(hù)上述多肽模擬酶的制備方法，多肽與銅離子在ph為6-10的條件下進(jìn)行孵育，避光過夜。

10、根據(jù)本申請的一些實施例，孵育在磷酸緩沖體系下進(jìn)行。

11、本申請的第三個目的，保護(hù)上述多肽模擬酶或上述制備方法制備的多肽模擬酶在afb1黃曲霉毒素b1降解上的應(yīng)用。

12、本申請的第四個目的，保護(hù)一種固定化模擬酶，所述固定化模擬酶為花狀；包括無機(jī)成分、有機(jī)成分；

13、所述無機(jī)成分包括金屬磷酸鹽結(jié)晶化合物；

14、所述有機(jī)成分包括上述多肽模擬酶或上述制備方法制備的多肽模擬酶。

15、根據(jù)本申請的一些實施例，無機(jī)成分、有機(jī)成分的質(zhì)量占比為0.8-3.5；

16、根據(jù)本申請的一些優(yōu)先實施例，無機(jī)成分、有機(jī)成分的質(zhì)量占比分別為0.8、1.7、2.6、3.5。

17、所述金屬磷酸鹽結(jié)晶中的金屬來源于硫酸銅或硝酸銅，磷酸根來源于磷酸鹽緩沖液。

18、根據(jù)本申請的一些實施例，所述磷酸鹽緩沖液選自磷酸氫二鈉或磷酸二氫鉀。

19、本申請的第五個目的，保護(hù)上述固定化模擬酶的制備方法，多肽模擬酶與磷酸鹽緩沖液、硫酸銅或硝酸銅混合孵育即可。

20、本申請的第六個目的，保護(hù)上述固定化模擬酶或上述制備方法制備的固定化模擬酶在afb1黃曲霉毒素b1降解上的應(yīng)用。

21、基于對漆酶結(jié)構(gòu)的解析以及借助模擬酶的思路，設(shè)計了源于漆酶活性結(jié)構(gòu)域的多肽序列（icvhlhlhvhi），其中疏水氨基酸（i：異亮氨酸，v：纈氨酸，l：亮氨酸）與親水氨基酸（c：半胱氨酸，h：組氨酸）交替排列，能通過分子間非共價鍵相互作用，形成結(jié)構(gòu)明確且穩(wěn)定，并且具有理化性質(zhì)的分子聚集體。鑒于cu2+在活性構(gòu)象中的關(guān)鍵作用，在所設(shè)計的肽模擬酶中加入cu2+，利用多肽與cu2+的結(jié)合形成聚集體，得到穩(wěn)定的三維結(jié)構(gòu)，并研究其結(jié)構(gòu)和催化活性，以及在afb1中的降解作用。

22、本發(fā)明的有益效果

23、本發(fā)明基于天然漆酶活性中心設(shè)計肽序列，并與銅離子高效結(jié)合，模擬漆酶中銅離子與氨基酸殘基結(jié)合位點的結(jié)構(gòu)，實現(xiàn)了與天然漆酶不僅在三維結(jié)構(gòu)上，還在氧化活性上的高度一致。該模擬酶肽序列短且簡單、活性高且穩(wěn)定。當(dāng)多肽模擬酶濃度為0.5mg/ml，afb1濃度為0.5μg/ml時，3個小時降解率達(dá)到100%，表明此多肽模擬酶在降解afb1中具有顯著優(yōu)勢。

24、與此同時，通過一步沉淀法合成模擬酶-磷酸銅無機(jī)雜化納米花（peptide-nf），得到固定化模擬酶，該方法合成過程簡單，且所制成的固定化酶比表面積大，同時仍然能保持高活性與高穩(wěn)定性。

技術(shù)特征：

1.一種多肽模擬酶，其特征在于，原料包括多肽與銅離子；

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽模擬酶，其特征在于，所述多肽分子結(jié)構(gòu)為：

3.一種權(quán)利要求1或2所述的多肽模擬酶的制備方法，其特征在于，多肽與銅離子在ph為6-10的條件下進(jìn)行孵育，避光過夜。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，孵育在磷酸緩沖體系下進(jìn)行。

5.權(quán)利要求1或2所述多肽模擬酶或權(quán)利要求3或4所述制備方法制備的多肽模擬酶在afb1黃曲霉毒素b1降解上的應(yīng)用。

6.一種固定化模擬酶，其特征在于，所述固定化模擬酶為花狀；包括無機(jī)成分、有機(jī)成分；

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述固定化模擬酶，其特征在于，無機(jī)成分、有機(jī)成分的質(zhì)量占比為0.8-3.5；

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述固定化模擬酶，其特征在于，所述磷酸鹽緩沖液選自磷酸氫二鈉或磷酸二氫鉀。

9.一種權(quán)利要求7或8所述固定化模擬酶的制備方法，其特征在于，多肽模擬酶與磷酸鹽緩沖液、硫酸銅或硝酸銅混合孵育即可。

10.權(quán)利要求6-8任一所述固定化模擬酶或權(quán)利要求9所述制備方法制備的固定化模擬酶在afb1黃曲霉毒素b1降解上的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種多肽模擬酶、固定化模擬酶及其在AFB1降解上的應(yīng)用。針對現(xiàn)階段模擬酶在黃曲霉毒素B1降解上存在的問題，本發(fā)明提供了一種多肽模擬酶，原料包括多肽與銅離子；所述多肽的氨基酸序列，如SEQ?ID?No.1所示，具體為Ac?ICVHLHLHVHI?CONH<subgt;2</subgt;；所述多肽的N端進(jìn)行乙?；?，C端酰胺化。為了進(jìn)一步提高酶模擬物在苛刻條件下的穩(wěn)定性和適用性，還提供了一種以金屬磷酸鹽結(jié)晶化合物為無機(jī)成分、以有前景的多肽模擬酶為有機(jī)成分來制造有機(jī)?無機(jī)雜化納米花的簡單固定方法，制備得到固定化酶，用于苛刻條件下的黃曲霉毒素B1降解。

技術(shù)研發(fā)人員：李霞,陸子瑞,岳婧超,李丕武,李漸鵬,孫登岳,雷瓊,孫夢雨
受保護(hù)的技術(shù)使用者：齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/19