專利名稱:一種利用耐酸性細(xì)菌開放式發(fā)酵餐廚垃圾生產(chǎn)乙醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種紫外誘變耐酸性運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的方法及利用該菌株開放式發(fā)酵 餐廚垃圾生產(chǎn)乙醇的方法。
技術(shù)背景
近年來，隨著經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展，化石能源的日益枯竭，對可再生能源的研究日益受 到人們重視。燃料乙醇由于其制備工藝簡單，并且可以作為乙醇汽油使用，得到了世界 各國的廣泛關(guān)注。近年來，人們對利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇的技術(shù)進(jìn)行了廣泛研究， 公開號(hào)為CN1948498的專利公布了一種利用酵母發(fā)酵餐廚垃圾生產(chǎn)燃料乙醇的方法， 具有原料價(jià)格成本低，環(huán)境效益重大的優(yōu)點(diǎn)，但發(fā)酵時(shí)間需要近60h，周期較長。近年 來，運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌由于其乙醇產(chǎn)率高，發(fā)酵速率快，易進(jìn)行基因改良等優(yōu)點(diǎn)而日益受 到人們的重視。但由于該菌株生長條件不如酵母菌粗獷，而制約了其大規(guī)模應(yīng)用的前景。 除卻菌株的發(fā)展，各種節(jié)能低耗的發(fā)酵工藝更是不斷被研發(fā)出來。不滅菌的開放式發(fā)酵 可以省卻滅菌所需的大量能耗，同時(shí)可以避免高溫滅菌過程中對營養(yǎng)物質(zhì)的破壞，而日 益受到人們重視?？刂频孜镏凛^酸環(huán)境，同時(shí)盡量縮短發(fā)酵時(shí)間是實(shí)現(xiàn)開放式發(fā)酵的重 要條件。若能獲得一株在不易孳生雜菌的酸性條件下仍能正常生長且乙醇產(chǎn)率比酵母更 高的菌種，則能夠省卻在生產(chǎn)過程中的滅菌步驟，從而大大降低運(yùn)行成本，使工藝簡單、 節(jié)能、經(jīng)濟(jì)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用經(jīng)紫外誘變的耐酸性細(xì)菌在開放式條件下發(fā)酵餐廚 垃圾生產(chǎn)乙醇的方法，無需外加任何營養(yǎng)物質(zhì)，無需嚴(yán)格的無菌操作條件，易于控制， 具有簡單、節(jié)能、經(jīng)濟(jì)的優(yōu)勢。
本發(fā)明所述的乙醇生產(chǎn)方法，是采用不滅菌的開放式乙醇發(fā)酵方式，即取消現(xiàn)有酶 解一乙醇發(fā)酵工藝中高溫滅菌步驟。
本發(fā)明目的通過如下步驟實(shí)現(xiàn)
1)出發(fā)菌株運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌Zy附omo"Mwo6/fc 70225的酸性馴化 以中國工業(yè)微生物菌種保藏中心的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌Z:v附o附o"as woWfc 70225為出發(fā)菌株，利用0.05~ 0.10 mol/L的HC1溶液調(diào)節(jié)液體葡萄糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基至pH為3.5~4.5， 加入瓊脂，制成固體培養(yǎng)基，滅菌后待用。將運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌活化三代后，在已準(zhǔn)備好 的固體葡萄糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基中用雙層涂布平板法對其進(jìn)行劃線分離，選取生長旺盛的菌株 作為出發(fā)菌株進(jìn)行下一輪酸性馴化，出發(fā)菌株經(jīng)過三輪馴化，使得細(xì)菌能夠在酸性條件 下高效生長，選取生長能力強(qiáng)的一株菌，接入液體葡萄糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基，制成菌株懸液， 進(jìn)行后續(xù)的酸性發(fā)酵試驗(yàn)。
2) 耐酸性菌株的紫外誘變
將馴化后的耐酸菌株接種到液體葡萄糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基，制成菌株懸液，用無菌水稀釋 至每毫升106-108個(gè)細(xì)胞，取稀釋液l 3ml置于培養(yǎng)皿中進(jìn)行紫外照射，照射后，誘變 菌液在黑暗冷凍中保存l-2h，然后在紅燈下稀釋，在固體葡萄糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基上涂菌進(jìn) 行篩選，培養(yǎng)溫度為30-35。C，時(shí)間為24-48小時(shí)，挑選長勢良好的菌株進(jìn)行乙醇發(fā)酵 試驗(yàn)，根據(jù)誘變株在液體葡萄糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基中產(chǎn)乙醇的能力，篩選出一株發(fā)酵速度最快， 產(chǎn)乙醇能力最高且穩(wěn)定性好的菌株，置于4'C左右的冰箱中保存?zhèn)溆谩?br>紫外照射的紫外燈功率為15-20W，紫外照射距離為20-30cm，照射時(shí)間為30~60秒。
3) 利用上述耐酸性運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌開放式發(fā)酵餐廚垃圾生產(chǎn)乙醇 將粉碎后的餐廚垃圾與水按1-2: 1的質(zhì)量比進(jìn)行混合，用稀鹽酸將其pH調(diào)節(jié)到
3.5-4.5，得到餐廚垃圾的發(fā)酵培養(yǎng)基，然后按每克餐廚垃圾發(fā)酵培養(yǎng)基接入50-150 U 的糖化酶和蛋白酶，然后將經(jīng)紫外誘變的耐酸性運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌接入液體葡萄糖基礎(chǔ)培 養(yǎng)基培養(yǎng)24 36h,得到接種液，并按照每100g餐廚垃圾發(fā)酵培養(yǎng)基5-10ml運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單 胞菌的比例接入經(jīng)紫外誘變的耐酸性運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌，在30-35'C的密閉發(fā)酵搖瓶中進(jìn) 行不滅菌的厭氧發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間為24-48小時(shí)，再經(jīng)過蒸餾提純，即獲得工業(yè)乙醇產(chǎn)品。
葡萄糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基所含組分及配比為液體葡萄糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基為葡萄糖100g，酵
母膏5g，磷酸二氫鉀lg，硫酸鎂0.5g，硫酸銨lg，水1000ml;固體葡萄糖基礎(chǔ)培養(yǎng)
基為在上述成分基礎(chǔ)上再加入20g的瓊脂。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明所選用的生產(chǎn)菌種為經(jīng)紫外誘變的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌，
替代了傳統(tǒng)乙醇發(fā)酵所用的酵母菌，該菌具有產(chǎn)乙醇效率高，產(chǎn)生物量少，產(chǎn)醇速率快，
乙醇耐受力強(qiáng)，能夠在偏酸性的pH條件下發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)無需控制加氧，耐高滲透壓，
易于基因操作。本發(fā)明無須高溫滅菌發(fā)酵底物，無需嚴(yán)格的無菌操作條件；發(fā)酵過程無須額外添加 任何營養(yǎng)物，生產(chǎn)條件溫和，能耗低，無污染。
本發(fā)明所述的生產(chǎn)乙醇用原料可以是家庭、餐飲業(yè)拋棄的餐廚垃圾，其營養(yǎng)豐富， 在整個(gè)乙醇發(fā)酵過程中無需外加任何營養(yǎng)物質(zhì)。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1:
以中國工業(yè)微生物菌種保藏中心的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌Zy附omowm wo6z'fc 10225為出 發(fā)菌株，利用0.07mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)液體葡萄糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基至pH為4。葡萄糖培 養(yǎng)基的所含組分及配比為液體培養(yǎng)基為葡萄糖100g，酵母膏5g，磷酸二氫鉀lg，硫 酸鎂0.5g，硫酸銨lg，水1000ml，再加入20g的瓊脂，制成固體培養(yǎng)基，滅菌后待用。 將運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌活化三代后，在已準(zhǔn)備好的固體培養(yǎng)基中用雙層涂布平板法對其進(jìn)行 劃線分離，選取生長旺盛的菌株作為出發(fā)菌株進(jìn)行下一輪酸性馴化，出發(fā)菌株經(jīng)過三輪 馴化，選取生長能力強(qiáng)的一株菌，接種至pH為4的葡萄糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基制成菌株懸液， 用無菌水稀釋至每毫升106-108個(gè)細(xì)胞，取稀釋液2ml置于培養(yǎng)皿中進(jìn)行紫外照射，紫 外燈功率為20W，紫外照射距離為25cm，照射時(shí)間為40秒，照射后，誘變菌液在黑 暗冷凍中保存1.5h，然后在紅燈下稀釋，在固體培養(yǎng)基上涂菌進(jìn)行篩選，培養(yǎng)溫度為 35°C，時(shí)間為30小時(shí)，篩選出一株發(fā)酵速度最快，產(chǎn)乙醇能力最高且穩(wěn)定性好的菌株。 分別將出發(fā)菌株和誘變的菌株接種到pH為4的液體葡萄糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基，發(fā)酵40h，測 定乙醇產(chǎn)量，其中誘變菌株產(chǎn)乙醇為48g/L，而出發(fā)菌株則幾乎不生長，表明誘變菌株 能夠在酸性條件下高效地生產(chǎn)乙醇，而未經(jīng)過酸性馴化的菌株則不能夠生成乙醇。
將粉碎后的餐廚垃圾與水按1.5: l的質(zhì)量比進(jìn)行混合，用0.05 mol/L稀鹽酸調(diào)節(jié) pH至4左右，得到餐廚垃圾發(fā)酵培養(yǎng)基。添加每克餐廚垃圾培養(yǎng)基各100U的糖化酶 及蛋白酶，同時(shí)按照7%(V/M)(接種液體積和餐廚垃圾培養(yǎng)基的質(zhì)量比)的比例接入 預(yù)先在液體葡萄糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)的經(jīng)紫外誘變的耐酸性運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌，35 。C條件下在密閉發(fā)酵搖瓶中厭氧發(fā)酵48小時(shí)，測定乙醇濃度，最終的乙醇濃度為48g/L， 表明馴化后的耐酸性運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌可以在酸性條件下開放式發(fā)酵餐廚垃圾產(chǎn)乙醇。
實(shí)施例2:
將粉碎后的餐廚垃圾與水按2: 1的質(zhì)量比進(jìn)行混合，用0.05mol/L稀鹽酸調(diào)節(jié)pH 至4左右，得到餐廚垃圾發(fā)酵培養(yǎng)基。添加每克餐廚垃圾培養(yǎng)基各100U的糖化酶及蛋白酶，同時(shí)按照5%(V/M)(接種液體積和餐廚垃圾培養(yǎng)基的質(zhì)量比)的比例接入預(yù)先 在液體葡萄糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)的將如實(shí)施例1所述的經(jīng)紫外誘變的耐酸性運(yùn)動(dòng) 發(fā)酵單胞菌，35'C條件下在密閉發(fā)酵搖瓶中厭氧發(fā)酵48小時(shí)，測定乙醇濃度。
對比實(shí)驗(yàn)將粉碎后的餐廚垃圾與水按2: 1的質(zhì)量比進(jìn)行混合，維持pH在7左 右，得到餐廚垃圾發(fā)酵培養(yǎng)基，12rC滅菌20min后，添加每克餐廚垃圾發(fā)酵培養(yǎng)基各 100U的糖化酶及蛋白酶和10%(V/M)(接種液體積和餐廚垃圾培養(yǎng)基的質(zhì)量比)經(jīng)事 先活化的的酵母菌液，35'C條件下在密閉發(fā)酵搖瓶中厭氧發(fā)酵60個(gè)小時(shí)。
結(jié)果表明運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌發(fā)酵到40 h就己經(jīng)基本結(jié)束，乙醇濃度達(dá)到53g/L，而 酵母發(fā)酵60 h才基本結(jié)束，其乙醇濃度僅為32 g/L。因此經(jīng)紫外誘變的耐酸性運(yùn)動(dòng)發(fā) 酵單胞菌與傳統(tǒng)的酵母菌相比，具有發(fā)酵速度快，發(fā)酵時(shí)間短，能夠在不滅菌條件下進(jìn) 行開放式發(fā)酵等優(yōu)點(diǎn)。
實(shí)施例3:
將粉碎后的餐廚垃圾與水按2: 1的質(zhì)量比進(jìn)行混合得到餐廚垃圾發(fā)酵培養(yǎng)基，用 0.07mol/L稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至4，將運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的原始菌株接種至未調(diào)節(jié)pH的液體 葡萄糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基，經(jīng)將如實(shí)施例1所述的紫外誘變的耐酸性運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌接種至調(diào) 節(jié)pH為4的液體葡萄糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基，培養(yǎng)24小時(shí)，得到菌株懸液。按照每克餐廚垃 圾添加各120U的糖化酶及蛋白酶，同時(shí)分別接入運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的原始菌株和經(jīng)紫外 誘變的耐酸性運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌菌株懸液各7%(V/M)(接種液體積和餐廚垃圾培養(yǎng)基的 質(zhì)量比)，3(TC條件下在密閉發(fā)酵搖瓶中厭氧發(fā)酵42個(gè)小時(shí)，得到發(fā)酵液后，蒸餾得到 乙醇。其中未經(jīng)馴化的原始菌株幾乎不生成乙醇，經(jīng)過紫外誘變的耐酸性運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞 菌產(chǎn)乙醇濃度為53g/L，由此可見經(jīng)過紫外誘變的耐酸性菌株可以在酸性條件下進(jìn)行不 滅菌發(fā)酵而獲得較高的乙醇產(chǎn)率。
實(shí)施例4:
將如實(shí)施例1所述的經(jīng)紫外誘變的耐酸性運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌接入pH調(diào)節(jié)到4的液體 葡萄糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基，培養(yǎng)24小時(shí)，得到菌株懸液備用。將粉碎后的餐廚垃圾與水按1.5: 1的質(zhì)量比進(jìn)行混合得到餐廚垃圾發(fā)酵培養(yǎng)基，，將培養(yǎng)基分為兩類， 一類進(jìn)行滅菌處 理，不調(diào)節(jié)pH，另一類不進(jìn)行滅菌處理，使用0.08mol/L調(diào)節(jié)pH至4,2;兩類培養(yǎng)基 按照每克餐廚垃圾培養(yǎng)基添加各150U的糖化酶及蛋白酶，10%(V/M)(接種液體積 和餐廚垃圾培養(yǎng)基的質(zhì)量比)的經(jīng)紫外誘變的耐酸性運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌懸液，35'C條件下在密閉發(fā)酵搖瓶中厭氧發(fā)酵40個(gè)小時(shí)，得到發(fā)酵液蒸餾得到乙醇。其中經(jīng)過滅菌處理 的發(fā)酵液乙醇濃度為50g/L,不經(jīng)過滅菌處理的培養(yǎng)基乙醇濃度為53g/L。從結(jié)果來看， pH為4左右的的酸性條件可以和滅菌處理得到相當(dāng)?shù)囊掖籍a(chǎn)量。酸性條件有效地避免 雜菌的污染，并且由于營養(yǎng)物質(zhì)沒有經(jīng)受高溫的破壞，乙醇的產(chǎn)量還有所提高。
權(quán)利要求
1、一種利用耐酸性細(xì)菌開放式發(fā)酵餐廚垃圾生產(chǎn)乙醇的方法，其特征在于，具體實(shí)施步驟為
1)以運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌Zymomonas mobilis 10225為出發(fā)菌株，利用0.05～0.10mol/L的HCl溶液調(diào)液體葡萄糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基的pH為3.5～4.5，加入瓊脂，制成固體培養(yǎng)基，將運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌活化三代后，采用雙層涂布法在準(zhǔn)備好的固體葡萄糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基中進(jìn)行菌株篩選，選取生長旺盛的菌株進(jìn)行三輪酸性馴化，選取生長能力強(qiáng)的一株菌，接入液體葡萄糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基，制成菌株懸液；
2)將步驟1)的菌株懸液用無菌水稀釋至每毫升106-108個(gè)細(xì)胞，取稀釋液1～3ml置于培養(yǎng)皿中進(jìn)行紫外照射，照射后，將誘變菌液在黑暗冷凍中保存1-2h，然后在紅燈下稀釋，在固體葡萄糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基上涂菌進(jìn)行篩選，培養(yǎng)溫度為30-35℃，時(shí)間為24-48小時(shí)，挑選長勢良好的耐酸性運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌株置于4℃左右的冰箱中保存；
3)將粉碎后的餐廚垃圾與水按1-2∶1的質(zhì)量比進(jìn)行混合，用稀鹽酸將其pH調(diào)節(jié)到3.5-4.5，得到餐廚垃圾的發(fā)酵培養(yǎng)基，按每克餐廚垃圾發(fā)酵培養(yǎng)基接入50-150U的糖化酶和蛋白酶，然后將步驟2制得的耐酸性運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌接入液體葡萄糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)24～36h，得到接種液，并按照每100g餐廚垃圾發(fā)酵培養(yǎng)基5-10ml運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的比例接入經(jīng)紫外誘變的耐酸性運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌，在30-35℃的密閉發(fā)酵搖瓶中進(jìn)行不滅菌的厭氧發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間為24-48小時(shí)，最后蒸餾提純，得到乙醇。
2、 如權(quán)利要求
1所述的利用耐酸性細(xì)菌開放式發(fā)酵餐廚垃圾生產(chǎn)乙醇的方法，其 特征在于，使用的Zymomo"w wo6!'fc 70225出發(fā)菌株為中國工業(yè)微生物菌種保藏中心 的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌。
3、 如權(quán)利要求
l所述的利用耐酸性細(xì)菌開放式發(fā)酵餐廚垃圾生產(chǎn)乙醇的方法，其 特征在于，所述液體葡萄糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基的組分及配比為葡萄糖100g，酵母膏5g，磷 酸二氫鉀lg，硫酸鎂0.5g，硫酸銨lg，水1000ml;所述固體葡萄糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基為在液體葡萄糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分基礎(chǔ)上加入20g的瓊脂。
4、 如權(quán)利要求
1所述的利用耐酸性細(xì)菌開放式發(fā)酵餐廚垃圾生產(chǎn)乙醇的方法，其特征在于，所述紫外照射的紫外燈功率為15-20W，紫外照射距離為20-30cm，照射時(shí) 間為30-60秒。
專利摘要
本發(fā)明公開了一種利用耐酸性細(xì)菌開放式發(fā)酵餐廚垃圾生產(chǎn)乙醇的方法，涉及細(xì)菌的誘變選育過程及利用該菌株開放式發(fā)酵餐廚垃圾生產(chǎn)乙醇。具體步驟是對運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌出發(fā)菌株進(jìn)行誘變，得到能夠在酸性條件下高產(chǎn)乙醇的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌；利用細(xì)菌進(jìn)行開放式乙醇發(fā)酵，將粉碎后的餐廚垃圾與水按1-2∶1的質(zhì)量比進(jìn)行混合，并調(diào)節(jié)pH至4左右；將誘變的耐酸性運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌接入餐廚垃圾進(jìn)行開放式厭氧發(fā)酵；蒸餾乙醇。本發(fā)明所篩選出的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌能夠在不易生長雜菌的酸性條件下生長并進(jìn)行乙醇發(fā)酵，且整個(gè)反應(yīng)過程不需要滅菌，大大降低了其運(yùn)行成本。
文檔編號(hào)C12P7/02GKCN101314781SQ200810115663
公開日2008年12月3日 申請日期2008年6月26日
發(fā)明者張文毓, 汪群慧, 趙芳妮, 馬鴻志 申請人:北京科技大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan