一種n-boc-d-2-氨基丁酸酯的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種手性中間體N-BOC-2-氨基丁酸酯的制備方法，特別涉及在嗜煙 堿節(jié)桿菌WYG001(CCTCCM2014054)的微生物催化作用下，以外消旋N-BOC-2-氨基丁酸酯 為反應底物，立體選擇性水解反應制備光學純N-BOC-D-2-氨基丁酸酯的方法。 (二）
【背景技術(shù)】
[0002] N-BOC-D-2-氨基丁酸酯（R)是一種重要的生化試劑，用于多肽或模擬肽合成和氨 基酸保護單體。N-BOC-D-2-氨基丁酸酯可以通過化學水解獲得D-2-氨基丁酸。D-2-氨 基丁酸是一種重要的非天然的手性a-氨基酸，它是一種重要的化工原料和手性中間體， 廣泛應用于藥物的合成（白國義，陳立功，邢鵬等.精細化工，2004, 21(12) :943-9452 ; CN1510025A，公開日 2004-07-07)。
[0003] 目前，文獻報道合成D-2-氨基丁酸的方法眾多。例如，以D構(gòu)型的蛋氨酸為 原料經(jīng)脫硫等步驟合成D-2-氨基丁酸（CompagnoneR.S.etal.JournalofOrganic Chemistry. 1986, 51:1713-1719) ;丁酮酸的氨化水解反應法（Archer,IanVictorJames 6七31.恥：20080153137,2008-06-26)，化學拆分法（5〇1〇811〇11〇1^￥.六.6七31.了〇11四1(^ AmericanChemicalSociety. 2009, 131:7208-7209)等。
[0004] 奚強等（奚強，丁友友，林丫丫，李俊.2-氨基丁酸的酶拆分[J].武漢工程大 學學報.2009, 31 (3) : 26-29.)先將外消旋的2-氨基丁酸乙酰化得到N-乙酰-2-氨基丁 酸，然后用從豬腎中提取得到的氨基?；高x擇性的水解掉（S)-構(gòu)型的N-乙酰-2-氨基 丁酸，從而獲得（S)-2-氨基丁酸，并將未被水解的（R)-N-乙酰-2-氨基丁酸用適當?shù)姆椒?進行消旋化處理得到外消旋的2-氨基丁酸，從而實現(xiàn)其動態(tài)動力學拆分，其最終收率達到 71.9%,
[0005] 本發(fā)明所報道的制備N-B0C-D-2-氨基丁酸酯的方法是通過生物催化 N-B0C-DL-2-氨基丁酸酯選擇性水解，實現(xiàn)消旋體中的N-B0C-L-2-氨基丁酸酯被催化水解 開環(huán)成酸，而D構(gòu)型保持不變，進而根據(jù)物理性質(zhì)的不同，將N-B0C-2-氨基丁酸酯的兩種構(gòu) 型分開，最后得到光學純的N-B0C-D-2-氨基丁酸酯。此制備方法具有立體選擇性高、反應 條件溫和、收率高、產(chǎn)物易分離純化及生產(chǎn)成本高等優(yōu)點，易于工業(yè)化生產(chǎn)。 (三）

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明目的是提供一種N-B0C-D-2-氨基丁酸酯的制備方法，該方法以外消旋 N-B0C-DL-2-氨基丁酸酯為反應底物，以嗜煙堿節(jié)桿菌WYG001(CCTCCN0:M2014054)經(jīng)發(fā) 酵培養(yǎng)獲得的濕菌體或干菌體為催化劑，催化立體選擇性水解N-B0C-DL-2-氨基丁酸酯從 而制備N-B0C-D-2-氨基丁酸酯，該方法具有立體選擇性高、反應條件溫和、收率高、產(chǎn)物易 分離純化及生產(chǎn)成本高等優(yōu)點，易于工業(yè)化生產(chǎn)。
[0007] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0008] 本發(fā)明提供一種N-B0C-D-2-氨基丁酸酯的制備方法，所述的方法為：以嗜煙堿節(jié) 桿菌（Arthrobacternicotinovorans)WYG001經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體或濕菌體冷凍干燥 后的干菌體為催化劑，以N-B0C-DL-2-氨基丁酸酯為底物，以0. 1M、pH7. 0磷酸緩沖液為反 應介質(zhì)，在20?40°C、200rpm條件下進行轉(zhuǎn)化反應（優(yōu)選反應1?30h)，反應結(jié)束后，將 反應液分離純化，獲得N-B0C-D-2-氨基丁酸酯；所述嗜煙堿節(jié)桿菌WYG001，保藏于中國典 型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號CCTCCN0:M2014054,保藏日期2014年2月28日，地址為中 國，武漢，武漢大學，郵編430072。
[0009] 本發(fā)明所述催化劑的制備方法為：（1)斜面培養(yǎng)：將嗜煙堿節(jié)桿菌WYG001接種至 斜面培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)24h，獲得菌體斜面；每升斜面培養(yǎng)基（牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基）組成： 牛肉膏58，蛋白胨1(^，恥(：158，瓊脂2(^，口117.0-7.2，加水至 10001^;121°〇滅菌20111111。 [0010] (2)種子培養(yǎng)：從斜面菌體挑取一接種環(huán)菌體接種至種子培養(yǎng)基，在3(TC、200r/ min培養(yǎng)24h，獲得種子液；種子培養(yǎng)基組成：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl10g/L，溶劑 為水，pH7. 0 ;
[0011] (3)發(fā)酵培養(yǎng)：在無菌條件下，以體積濃度6-8%的接種量將種子液接種于產(chǎn)酶培 養(yǎng)基中，30°C、200r/min培養(yǎng)24h，獲得發(fā)酵液，培養(yǎng)結(jié)束后將發(fā)酵液12000rpm離心10min， 棄上清液，得到嗜煙堿節(jié)桿菌WYG001濕菌體；產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成為：乳糖5-15g/L，酵母膏 10-14g/L，NaCl10g/L，MgS040. 22g/L、KH2P040. 136g/L，溶劑為水，pH7. 0 ;
[0012] (4)取步驟（3)濕菌體以1. 2g/ml的量加入pH7. 0、0.lmol/L的磷酸鹽緩沖液中， 攪拌均勻，_80°C條件下冷凍干燥，得到干菌體。
[0013] 進一步，所述濕菌體的用量以緩沖液體積計為1?200g/L，優(yōu)選10?200g/L。
[0014] 進一步，所述干菌體的用量以緩沖液體積計為1?100g/L，優(yōu)選10?50g/L。
[0015] 進一步，所述底物初始濃度為1?50g/L，優(yōu)選10?30g/L。
[0016] 進一步，所述反應在20?40°C反應1?30h。
[0017] 本發(fā)明所述N-B0C-DL-2-氨基丁酸酯為N-B0C-DL-2-氨基丁酸甲酯、 N-B0C-DL-2-氨基丁酸乙酯或N-B0C-DL-2-氨基丁酸丙酯。
[0018] 本發(fā)明所述反應液分離純化的方法為：反應結(jié)束后，將反應液離心，取上清液，加 入等體積的乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯層減壓蒸餾至干脫除溶劑，得到N-B0C-D-2-氨基丁 酸酯。
[0019] 本發(fā)明反應流程見下式所示：
[0020]
【主權(quán)項】
1. 一種N-B0C-D-2-氨基丁酸酯的制備方法，其特征在于所述的方法為：以嗜煙堿節(jié)桿 菌（Arthrobacter nicotinovorans)WYG001經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體或濕菌體冷凍干燥 后的干菌體為催化劑，以N-B0C-DL-2-氨基丁酸酯為底物，以0. 1M、pH7. 0磷酸緩沖液為反 應介質(zhì)，在20?40°C、200rpm條件下進行轉(zhuǎn)化反應，反應結(jié)束后，將反應液分離純化，獲得 N-B0C-D-2-氨基丁酸酯；所述嗜煙堿節(jié)桿菌WYG001，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保 藏編號CCTCC NO :M 2014054,保藏日期2014年2月28日，地址為中國，武漢，武漢大學，郵 編 430072。
2. 如權(quán)利要求1所述N-B0C-D-2-氨基丁酸酯的制備方法，其特征在于所述催化劑的制 備方法為：（1)斜面培養(yǎng)：將嗜煙堿節(jié)桿菌WYG001接種至斜面培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)24h，獲得 菌體斜面；每升斜面培養(yǎng)基組成：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，瓊脂20g，pH 7.0-7.2,加 水至 1000mL ; (2) 種子培養(yǎng)：從斜面菌體挑取一接種環(huán)菌體接種至種子培養(yǎng)基，在3(TC、20〇r/min培 養(yǎng)24h，獲得種子液；種子培養(yǎng)基組成：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，溶劑為水， pH 7. 0 ； (3) 發(fā)酵培養(yǎng)：在無菌條件下，以體積濃度6-8 %的接種量將種子液接種于產(chǎn)酶培養(yǎng) 基中，30°C、200r/min培養(yǎng)24h，獲得發(fā)酵液，培養(yǎng)結(jié)束后將發(fā)酵液12000rpm離心10min， 棄上清液，得到嗜煙堿節(jié)桿菌WYG001濕菌體；產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成為：乳糖5-15g/L，酵母膏 10-14g/L，NaCl 10g/L，MgS04 0? 22g/L、KH2P04 0? 136g/L，溶劑為水，pH 7. 0 ; (4) 取步驟（3)濕菌體以1. 2g/ml的量加入pH 7. 0、0. lmol/L的磷酸鹽緩沖液中，攪拌 均勻，-80°C條件下冷凍干燥，得到干菌體。
3. 如權(quán)利要求1所述N-B0C-D-2-氨基丁酸酯的制備方法，其特征在于所述濕菌體的用 量以緩沖液體積計為1?200g/L。
4. 如權(quán)利要求1所述N-B0C-D-2-氨基丁酸酯的制備方法，其特征在于所述干菌體的用 量以緩沖液體積計為1?l〇〇g/L。
5. 如權(quán)利要求1所述N-B0C-D-2-氨基丁酸酯的制備方法，其特征在于所述底物初始濃 度為1?50g/L。
6. 如權(quán)利要求1所述N-B0C-D-2-氨基丁酸酯的制備方法，其特征在于所述 N-B0C-DL-2-氨基丁酸酯為N-B0C-DL-2-氨基丁酸甲酯、N-B0C-DL-2-氨基丁酸乙酯或 N-B0C-DL-2-氨基丁酸丙酯。
7. 如權(quán)利要求1所述N-B0C-D-2-氨基丁酸酯的制備方法，其特征在于所述反應液分離 純化的方法為：反應結(jié)束后，將反應液離心，取上清液，加入等體積的乙酸乙酯萃取，取乙酸 乙酯層減壓蒸餾至干脫除溶劑，得到N-B0C-D-2-氨基丁酸酯。
8. 如權(quán)利要求1所述N-B0C-D-2-氨基丁酸酯的制備方法，其特征在于產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成 為：乳糖 l〇g/L，酵母膏 12g/L，NaCl 10g/L，MgS04 0? 22g/L、KH2P04 0? 136g/L，溶劑為水，pH 7. 0〇
9. 如權(quán)利要求1所述N-B0C-D-2-氨基丁酸酯的制備方法，其特征在于所述反應在 20?40°C反應1?30h。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種N-BOC-D-2-氨基丁酸酯的制備方法，所述的方法為：以嗜煙堿節(jié)桿菌(Arthrobacter nicotinovorans)WYG001經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體或濕菌體冷凍干燥后的干菌體為催化劑，以N-BOC-DL-2-氨基丁酸酯為底物，以0.1M、pH7.0磷酸緩沖液為反應介質(zhì)，在20～40℃下進行轉(zhuǎn)化反應，反應結(jié)束后，將反應液分離純化，獲得N-BOC-D-2-氨基丁酸酯；本發(fā)明方法中酶的區(qū)域選擇性強，反應轉(zhuǎn)化率高，下游分離簡單，能耗低，環(huán)境污染小，適合工業(yè)化生產(chǎn)。CCTCC NO：M 201405420140228
【IPC分類】C12P13-00, C12R1-06
【公開號】CN104531794
【申請?zhí)枴緾N201410799147
【發(fā)明人】王宇光, 朱冰春, 吳冬梅
【申請人】浙江工業(yè)大學
【公開日】2015年4月22日
【申請日】2014年12月19日