櫻花品種八重紅枝垂和雨情枝垂的分子特異性標記引物的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及櫻花品種"八重紅枝垂"和"雨情枝垂"的分子特異性標記引物以及利 用該分子特異性標記引物對櫻花品種"八重紅枝垂"和"雨情枝垂"進行快速鑒定的方法。 (二）
【背景技術】
[0002] 櫻花隸屬于薔薇科（Rosaceae)櫻屬（Cerasus)，是世界著名的觀賞植物。目前已 知櫻花品種有300多個，因其株型優(yōu)美、花色艷麗、整個花期延續(xù)期長，在園林上有極大的 應用價值。近年來，我國各地大規(guī)模種植櫻花并應用于公園、學校、街道、庭院等綠地中，成 為早春主要觀賞花木之一。北京、武漢、青島、上海等城市每年紛紛舉辦櫻花節(jié)，櫻花產(chǎn)業(yè)得 到迅猛發(fā)展，這對于建設美麗中國，促進農(nóng)民增收，推進山區(qū)綜合開發(fā)和建設社會主義新農(nóng) 村，都具有十分重要的意義。
[0003] 我國櫻屬植物資源豐富，分布廣泛，且櫻屬植物表型具有較強可塑性，種間雜交容 易，品種數(shù)量眾多，有些品種間性狀差異較小，傳統(tǒng)形態(tài)分類很難快速、準確有效評價與區(qū) 分。學術界對目前種植櫻花品種的名稱和描述都很混亂，"同物異名"或"同名異物"現(xiàn)象較 為嚴重，缺乏統(tǒng)一規(guī)范的名稱及科學系統(tǒng)的分類體系，不便于品種鑒定、推廣、交流及新品 種的培育，因此亟需建立一個科學合理的櫻花品種分類鑒定系統(tǒng)。
[0004] 目前就全國范圍內(nèi)的櫻花品種調(diào)查和分類還僅僅是通過傳統(tǒng)的形態(tài)學特征、過氧 化物酶和酯酶同工酶技術、電鏡掃描花粉粒和Q型聚類分析等方法，這些方法盡管有用，但 很難對櫻花品種進行正確的鑒定和應用。而近年來在植物分類界已廣泛應用的DNA分子標 記技術迄今尚未在櫻花品種分類、品種間親緣關系及遺傳多樣性等研宄上得以應用。因此， 有必要利用分子標記技術手段，對我國現(xiàn)有的櫻花品種進行科學鑒別，不僅有助于櫻花品 種分類鑒定系統(tǒng)的建立，也為櫻屬植物資源的進一步研宄提供分子依據(jù)。
[0005] 目前國內(nèi)引進大量的櫻花品種，在北京、青島、武漢、上海等各大公園內(nèi)廣泛栽植， 觀賞價值極高，其中以晚櫻品種居多，普遍具有花量大、花色艷麗、花瓣多、花期長、抗性 強、適應性廣等特點。我們經(jīng)過長期的調(diào)查工作，發(fā)現(xiàn)20個晚櫻品種包括紅笠（Cerasus serrulata'Benigasa'）、紅華（C.serrulata'Kouka'）、一葉（C.serrulata'Hisakura'）、 福綠壽（C.serrulata'Contorta'）、普賢象（C.serrulata'Albo-rosea'）、 松月（C.serrulata'Superba'）、郁金（C.serrulata'Grandifora'）、紅豐 (CerasusXsieboldii'Beni-yutaka'）、御衣黃(C.serrulata'Gioiko'）、關 山（C.serrulata'Kanzan'）、大提燈（C.serrulata'Ojochin'）、八重紅枝垂 (C.spachiana'PlenaRosea'）、市原虎尾（C.serrulata'AlboPlena'）、咲耶 姬（CerasusXyedoensis'Sakuyahime'）、朱雀（C.serrulata'Shujaku'）、楊貴 妃（C.serrulata'Mollis'）、雨情枝垂（C.spachiana'Ujou-shidare'）、菊垂 樓（C.serrulata'Plena-pendula'）、平野妹背（C.serrulata'Imose'）、旭山樓 (C.serrulata'Asahiyama'）在園林中的應用極其廣泛，但這些品種的"同名異物"、"同物 異名"現(xiàn)象也異常嚴重，從表型特征方面很難鑒別，給園林植物應用、推廣以及新品種選育 帶來很多困難，因此著力從分子水平上開發(fā)出這些品種穩(wěn)定、特異的DNA指紋標記才是實 現(xiàn)櫻花品種準確快速鑒定的科學途徑。 (三）
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明目的是提供櫻花品種"八重紅枝垂"和"雨情枝垂"的分子特異性標記引物， 以及利用該對引物對櫻花品種"八重紅枝垂"和"雨情枝垂"進行快速鑒定的方法。
[0007] 本發(fā)明采用的技術方案是：
[0008] 櫻花品種"八重紅枝垂"和"雨情枝垂"的分子特異性標記引物，所
[0009] 述引物序列為：
[0010] 上游引物：5，-AGCGGCCGCAACTAGCTATAATG-3，；
[0011] 下游引物：5，-AGCGGCCGCAAGAGAACG-3，。
[0012] 該引物對是采用PCR技術，經(jīng)過大量篩選試驗獲得櫻花品種"八重紅枝垂"和"雨 情枝垂"的特異性DNA片段之后，將該片段克隆測序，以得到的DNA序列為基礎設計特異性 引物，以該特異性引物對櫻花品種進行PCR擴增，僅"八重紅枝垂"和"雨情枝垂"可獲得 684bp大小的特異性片段，其他櫻花品種均不能獲得特異性片段。需要說明的是，本發(fā)明分 子特異性標記引物僅限于櫻花品種的鑒定（鑒定其是否為"八重紅枝垂"或"雨情枝垂"之 一，后續(xù)再進行進一步鑒定），即待測樣品僅限于櫻花。
[0013] 本發(fā)明還涉及一種利用所述的分子特異性標記引物對櫻花品種"八重紅枝垂"和 "雨情枝垂"進行快速鑒定的方法，所述方法為：提取待測櫻花品種葉片的基因組DNA作為 模板，以所述分子特異性標記引物作為擴增引物，進行PCR擴增，對擴增產(chǎn)物進行電泳檢 測，若電泳結果出現(xiàn)684bp大小的DNA條帶，則待測櫻花品種為櫻花品種"八重紅枝垂"或 "雨情枝垂"，反之則否；所述分子特異性標記引物序列為：
[0014] 上游引物：5，-AGCGGCCGCAACTAGCTATAATG-3，；
[0015]下游引物：5，-AGCGGCCGCAAGAGAACG-3，。
[0016] 本發(fā)明方法關鍵在于擴增引物的選擇、DNA提取、PCR反應體系及反應條件確定， 以及電泳檢測，均可按照本領域常規(guī)方法進行。
[0017] 優(yōu)選的，本發(fā)明所述PCR擴增體系組成如下：
[0018]
【主權項】
1. 樓花品種"八重紅枝垂"和"雨情枝垂"的分子特異性標記引物，所述引物序列如下： 上游引物；5' -AGCGGCCGCAACTAGCTATAATG-3'; 下游引物；5' -AGCGGCCGCAAGAGAACG-3'。
2. -種利用權利要求1所述的分子特異性標記引物對樓花品種"八重紅枝垂"和"雨情 枝垂"進行快速鑒定的方法，所述方法為：提取待測樓花品種葉片的基因組DNA作為模板， W所述分子特異性標記引物作為擴增引物，進行PCR擴增，對擴增產(chǎn)物進行電泳檢測，若電 泳結果出現(xiàn)684bp的特異DNA條帶，則待測樓花品種為樓花品種"八重紅枝垂"或"雨情枝 垂"，反之則否；所述分子特異性標記引物序列為： 上游引物；5' -AGCGGCCGCAACTAGCTATAATG-3'; 下游引物；5' -AGCGGCCGCAAGAGAACG-3'。
3. 如權利要求2所述的方法，其特征在于所述PCR擴增條件如下；95°C預變性3min ; 95°C變性40s，65°C退火40s，72°C延伸2min，共35個循環(huán)；最后于72°C補平7min，終止溫 度為4°C。
4. 如權利要求2所述的方法，其特征在于所述方法如下： (1)取待測樓花葉片，加液氮磨碎，W SDS-CTAB法提取待測樓花葉片的基因組DNA ; 似W步驟（1)提取的基因組DNA為模板，W所述分子特異性標記引物作為擴增引物， 進行PCR擴增： PCR擴增體系每25 y L組成如下；
dd&O補足至25 y L ; PCR擴增條件如下： 95°C預變性3min ;95°C變性40s，65°C退火40s，72°C延伸2min，共35個循環(huán)；最后于 72°C補平7min，終止溫度為4°C ; (3)取步驟（2)擴增產(chǎn)物5 y L與1 y L 0. 25 %漠酪蘭緩沖液混勻，點樣于1. 5%的瓊 脂糖凝膠上，于1XTAE緩沖液中、5V/cm電壓下電泳，電泳結束后邸染色，于自動凝膠圖像 分析儀上照相，若電泳結果出現(xiàn)684bp的DM條帶，則待測樓花品種為"八重紅枝垂"或"雨 情枝垂"，反之則否。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一對特異性高的櫻花品種“八重紅枝垂”和“雨情枝垂”的分子特異性標記引物，以及一種能對櫻花品種“八重紅枝垂”和“雨情枝垂”進行快速鑒定的方法。所述引物序列如下：上游引物：5′-AGCGGCCGCAACTAGCTATAATG-3′；下游引物：5′-AGCGGCCGCAAGAGAACG-3′。本發(fā)明分子特異性標記引物可對櫻花品種“八重紅枝垂”和“雨情枝垂”進行快速的早期鑒別，方法簡單、快捷、準確，是表觀特征辨別櫻花品種所不能替代的分子手段。
【IPC分類】C12N15-11, C12Q1-68
【公開號】CN104593368
【申請?zhí)枴緾N201510023281
【發(fā)明人】柯樂芹, 楊暉, 袁留斌, 求淵, 吳曉梅, 梁巧玲
【申請人】麗水學院
【公開日】2015年5月6日
【申請日】2015年1月16日