融合蛋白Nt4CL3aPcSTS及其制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中融合蛋白Nt4CL3aPcSTS及其制備方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 白藜蘆醇（Resveratrol，簡稱Res)，化學名為3,4'，5-三輕基-1，2-二苯乙稀（tr ans-3, 4'，5-trihydroxystilbene)，又稱苗三酷，是一種含有苗類結(jié)構(gòu)的非黃酮類多酷化 合物，分子量為228. 2,不溶于水，溶于乙醇等有機溶劑。天然的白藜蘆醇在很多植物中存 在，例如虎杖、花生和葡萄等。
[0003] 白藜蘆醇是植物遭遇紫外線照射、機械損傷及真菌感染時急劇增加的一種植保 素，研宄顯示白藜蘆醇具有抗癌、保護心血管、抗氧化、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)保護和植物 雌激素等作用，可廣泛地應(yīng)用于醫(yī)藥、保健品、食品、化妝品等領(lǐng)域。白藜蘆醇是葡萄酒最重 要的保健成分，法國人在高脂肪、高蛋白、高能量飲食習慣下，心血管疾病的發(fā)病率遠低于 其他歐美國家，就得益于經(jīng)常飲用含白藜蘆醇的紅葡萄酒。
[0004] 白藜蘆醇來源于苯丙燒代謝途徑（Phenylpropanoid pathway)。其生物代謝途徑 為：苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia-lyase，PAL)作用下裂解成反式 肉桂酸，肉桂酸在肉桂酸-4-輕基化酶（Cinnamate-4-hydroxylase，C4H)的催化作用下生 成4-香豆酸，4-香豆酸在4-香豆酰輔酶A連接酶（4-Coumarate-CoA ligase，4CL)的作用 下合成4-香豆酰輔酶A，最后，苗合酶（Stilbene synthase，STS)催化1分子的4-香豆酰 輔酶A和3分子的丙二酰輔酶A生成白藜蘆醇（圖1)。
[0005] 在生物體內(nèi)白藜蘆醇生物合成途徑限速步驟較多，單純過量表達某一關(guān)鍵酶雖然 對白藜蘆醇的含量可能會產(chǎn)生一定的促進作用，但由于其它步驟限制，白藜蘆醇的高水平 積累非常困難。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何提高白藜蘆醇的產(chǎn)量。
[0007] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了融合蛋白Nt4CL3aPcSTS。
[0008] 本發(fā)明所提供的融合蛋白，名稱為Nt4CL3aPcSTS，是如下⑴或⑵的蛋白質(zhì)：
[0009] ⑴由蛋白質(zhì)Nt4CL和蛋白質(zhì)PcSTS融合得到的融合蛋白：
[0010] 所述蛋白質(zhì)Nt4CL是如下a)或b):
[0011] a)氨基酸序列是SEQ ID No. 1第1-542位氨基酸殘基的蛋白質(zhì)；
[0012] b)將a)經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功 能的由其衍生的蛋白質(zhì)；
[0013] 所述蛋白質(zhì)PcSTS是如下A或B :
[0014] A、氨基酸序列是SEQ ID No. 1第546-933位氨基酸殘基所示的蛋白質(zhì)；
[0015] B、將A經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能 的由其衍生的蛋白質(zhì)。
[0016] ⑵將⑴的N端或C端連接標簽得到的帶標簽蛋白質(zhì)。
[0017] 所述融合蛋白中，所述蛋白質(zhì)Nt4CL和蛋白質(zhì)PcSTS通過三個氨基酸殘基連接。所 述三個氨基酸殘基的序列如SEQ ID No. 1第543-545位所示，所述融合蛋白的氨基酸序列 是 SEQ ID No. 1。
[0018] 為了使所述融合蛋白Nt4CL3aPcSTS便于純化，可在所述融合蛋白Nt4CL3aPcSTS 的N端和/或C端連接上如表1所示的標簽。如在SEQ ID No. 1所示的蛋白質(zhì)的N端和C 端分別連接一個6*His標簽（HHHHHH)得到的融合蛋白。
[0019] 表1.標簽的序列
[0020]
【主權(quán)項】
1. 一種融合蛋白，是如下⑴或⑵的蛋白質(zhì)： ⑴由蛋白質(zhì)Nt4CL和蛋白質(zhì)PcSTS融合得到的融合蛋白： 所述蛋白質(zhì)Nt4CL是如下a)或b): a) 氨基酸序列是SEQ ID No. 1第1-542位氨基酸殘基的蛋白質(zhì)； b) 將a)經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的 由其衍生的蛋白質(zhì)； 所述蛋白質(zhì)PcSTS是如下A或B : A、 氨基酸序列是SEQ ID No. 1第546-933位氨基酸殘基所示的蛋白質(zhì)； B、 將A經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由 其衍生的蛋白質(zhì)； ⑵將⑴的N端或C端連接標簽得到的帶標簽蛋白質(zhì)。
2. 如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白中，所述蛋白質(zhì)Nt4CL和 蛋白質(zhì)PcSTS通過三個氨基酸殘基連接。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于：所述三個氨基酸殘基的序列如SEQ ID No. 1第543-545位所示，所述融合蛋白的氨基酸序列是SEQ ID No. 1。
4. 權(quán)利要求1-3中任一所述的融合蛋白的制備方法，包括將所述融合蛋白的編碼基因 在生物細胞中進行表達得到所述融合蛋白。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于：所述融合蛋白的編碼基因在生物細胞中 進行表達包括將所述融合蛋白的編碼基因?qū)胨錾锛毎?br>6. 根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述生物細胞為微生物細胞、非人動 物細胞或植物細胞。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4-6中任一所述的方法，其特征在于：所述微生物細胞為細菌。
8. 根據(jù)權(quán)利要求4-7中任一所述的方法，其特征在于：所述融合蛋白的編碼基因是如 下①或②或③或④所述的DNA分子： ① 編碼序列是SEQ ID No. 2的第1-2802位核苷酸的DNA分子或cDNA分子； ② 核苷酸序列是SEQ ID No. 2的DNA分子或cDNA分子； ③ 與①或②限定的DNA分子或cDNA分子具有75%以上的同一性且編碼所述蛋白質(zhì)的 DNA分子或cDNA分子； ④ 在嚴格條件下與①或②限定的DNA分子或cDNA分子雜交且編碼所述蛋白質(zhì)的DNA 分子或cDNA分子。
9. 一種生產(chǎn)白藜蘆醇的方法，包括在含有4-香豆酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)融合蛋白相關(guān)生 物材料，得到白藜蘆醇；所述融合蛋白相關(guān)生物材料為下述C1)至C12)中的任一種： C1)含有核酸分子的重組微生物；所述核酸分子編碼權(quán)利要求1所述融合蛋白；所述微 生物為原核微生物； C2)含有表達盒的重組微生物；所述表達盒含有所述核酸分子；所述微生物為原核微 生物； C3)含有重組載體的重組微生物；所述重組載體為原核細胞表達載體，所述重組載體 含有所述核酸分子或所述表達盒；所述微生物為原核微生物； C4)含有所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物細胞系； C5)含有所述表達盒的轉(zhuǎn)基因植物細胞系； C6)含有所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細胞系； C7)含有所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物組織； C8)含有所述表達盒的轉(zhuǎn)基因植物組織； C9)含有所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物組織； CIO)含有所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物器官； C11)含有所述表達盒的轉(zhuǎn)基因植物器官； C12)含有所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物器官。 10,1或II的應(yīng)用： I、權(quán)利要求1-3中任一所述的融合蛋白在生產(chǎn)白藜蘆醇中的應(yīng)用； 11、 權(quán)利要求1-3中任一所述的融合蛋白在作為4-香豆酸輔酶A連接酶和芪合酶中的 應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了融合蛋白Nt4CL3aPcSTS及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的融合蛋白Nt4CL3aPcSTS，是由蛋白質(zhì)Nt4CL和蛋白質(zhì)PcSTS融合得到的融合蛋白：所述蛋白質(zhì)Nt4CL是氨基酸序列是SEQ ID No.1自N端第1-542位氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)；所述蛋白質(zhì)PcSTS是氨基酸序列是SEQ ID No.1自N端第546-933位氨基酸殘基所示的蛋白質(zhì)。融合蛋白Nt4CL3aPcSTS能夠催化4-香豆酸和丙二酰輔酶A生成具有生物活性的白藜蘆醇，證明融合蛋白Nt4CL3aPcSTS具有4-香豆酸輔酶A連接酶和芪合酶的活性。
【IPC分類】C12P7-22, C12N9-00, C12N15-62, C12N9-10
【公開號】CN104611302
【申請?zhí)枴緾N201510062467
【發(fā)明人】郭輝力, 馬蘭青, 趙曉萌, 楊明峰, 劉歡, 馬雅迪, 羅在柒, 楊亞東, 劉文彬, 張紅, 馮靜, 馬騰, 馬璇, 張煊宜
【申請人】北京農(nóng)學院
【公開日】2015年5月13日
【申請日】2015年2月5日