通過rna原位雜交檢測免疫球蛋白輕鏈限制性的制作方法
【專利說明】通過RNA原位雜交檢測免疫球蛋白輕鏈限制性
[0001] 本申請主張2013年3月15日提交的美國申請序列號No. 13/843408的優(yōu)先權，和 2012年4月5日提交的美國臨時申請序列號No.61/620634的優(yōu)先權，和2012年10月22 日提交的美國臨時申請序列號No. 61/717064的優(yōu)先權，它們中的每一篇的全部內容作為 參考并入本文。
[0002] 本發(fā)明是在國家癌癥學會（National Cancer Institute)授予的基金號 R43CA168019的政府支持下進行的。政府對本發(fā)明具有一定的權利。
【背景技術】
[0003] 本發(fā)明總體上涉及原位雜交測定，并且更具體地涉及用于診斷B細胞腫瘤的測 定。
[0004] 免疫球蛋白由兩條重鏈和兩條輕鏈組成。在B細胞分化期間，編碼免疫球蛋白基 因的DNA經歷重排以產生個體免疫系統(tǒng)可用的具有較大多樣性的可能免疫球蛋白的免疫 球蛋白域的獨特組合。每種成熟B細胞表達不同的免疫球蛋白域的組合。存在兩類輕鏈， 分別表示為κ和λ。在B細胞成熟期間，所發(fā)生的DNA重排導致每種成熟B細胞表達具有 κ輕鏈或λ輕鏈中任一種的免疫球蛋白。因此，在給定分化的B細胞中，B細胞將表達κ 輕鏈或λ鏈中的一種。在正常哺乳動物生物體中，所述生物體將具有單獨表達κ或λ輕 鏈中一種的B細胞群體，但是作為群體，其將具有κ和λ輕鏈表達細胞的混合。這種細胞 群體被認為是多克隆的。
[0005] 贅生性細胞的特征在于無限制的細胞生長。就B細胞腫瘤來說，腫瘤B細胞的無 限制細胞生長導致產生了包括相同細胞多個拷貝的群體B細胞。由于成熟B細胞通常表達 κ或λ輕鏈中的一種，因此腫瘤B細胞群體將顯示出相同細胞的多種拷貝的特征，以及因 此僅表達κ鏈或僅表達λ輕鏈的細胞的多種拷貝的特征。這種含有相同細胞的多個拷貝 的群體被認為是克隆的，并且克隆性的特征在于贅生性細胞的異常細胞生長。
[0006] 因此，克隆性擴增（clonal expansion)是B細胞惡性腫瘤的標志之一，并且最常 表示為免疫球蛋白（Ig)輕鏈（κ或λ中的任一種）的限制性表達（Cook, "Molecular Hematopathology, "Tubbs&Stoler 主編，Cell and Tissue Based Molecular Pathology, Churchill Livingstone ElsevierQOOS))。]^輕鏈限制性（LCR)的臨床實驗室 檢測是分化診斷（包括淋巴增生、非典型淋巴增生、慢性炎癥和B細胞腫瘤）中有幫助的輔 助工具（Cook，如上，2008 ;Taylor, Applied Immunohistochem.Mol.Morphology 17:470 -482 (2009a) ；Taylor, Applied Immunohistochem. Mol. Morphology 17:366 - 374(2009b))〇
[0007] 通過免疫組織化學和常規(guī)顯色原位雜交（CISH)的LCR鑒定對于表達大量κ或 AmRNA和細胞質免疫球蛋白的B細胞腫瘤來說是可行的（Beck等人，Diagnostic Mol. Pathol. 12:14 - 20(2003))。在福爾馬林固定的石蠟包埋的（FFPE)組織中，漿細胞骨髓瘤 LCR幾乎總是可行的。但是僅非霍奇金氏淋巴瘤（NHL)的罕見亞型（少數(shù)具有大量Ig mRNA 和蛋白質表達）是通過這些傳統(tǒng)方法可評價的（Beck等人，如上，2003)。相反，在所有NHL 亞型的絕大部分中，放射自顯影原位雜交足夠靈敏以檢測極低水平的輕鏈mRNA (Segal等 人，Diagnostic Mol. Pathol. : Am. J. Surg. Pathol.，part B, 3:170 - 177 (1994)，所述亞型 包括最常見的NHL變體-濾泡性淋巴瘤、彌漫性大B細胞淋巴瘤、小B淋巴細胞性淋巴瘤和 MALT型結外邊緣區(qū)淋巴瘤。但是，放射自顯影信號需要兩周或更長時間來顯影（Segal等 人，如上，1994)，對于臨床控制來說，這種延遲是不可接受的。
[0008] 因此，需要用于良性和癌性B細胞樣品鑒定的精確并且快速的測定。本發(fā)明滿足 了這種需要并且也提供了相關優(yōu)勢。
[0009] 發(fā)明概述
[0010] 本發(fā)明提供了用于檢測B細胞中免疫球蛋白輕鏈限制性和克隆性的方法。所述方 法可以包括以下步驟：從受試者獲得B細胞樣品；利用（i)設計為特異性雜交至免疫球蛋 白κ鏈恒定區(qū)（IGKCR) RNA的至少一種探針組；和（ii)設計為特異性雜交至免疫球蛋白λ 鏈恒定區(qū)（IGLCR)RNA的至少一種探針組對所述樣品進行雙重原位雜交測定；檢測樣品中B 細胞群體中與雜交的IGKCR探針有關的信號和與雜交的IGLCR探針有關的信號；和確定B 細胞群體中單個細胞內與雜交的IGKCR探針和雜交的IGLCR探針有關的信號模式，其中單 個細胞中的信號模式表明存在或不存在B細胞的輕鏈限制性和克隆性。
[0011] 在另外的實施方式中，本發(fā)明提供了檢測B細胞中免疫球蛋白輕鏈限制性和克隆 性的方法。所述方法可以包括以下步驟：從受試者獲得B細胞樣品；利用（i)設計為特異 性雜交至免疫球蛋白κ鏈恒定區(qū)（IGKCR)RNA的至少一種探針組；（ii)設計為特異性雜交 至免疫球蛋白λ鏈恒定區(qū)（IGLCR)RNA的至少一種探針組；和可選地（iii)設計為特異性 雜交至免疫球蛋白λ樣多肽5 (IGLL5) RNA的至少一種探針組對所述樣品進行一種或多種 原位雜交測定；檢測樣品中B細胞群體中與雜交的IGKCR探針有關的信號、與雜交的IGLCR 探針有關的信號和與雜交的IGLL5探針有關的信號；和確定B細胞群體中單個細胞內與雜 交的IGKCR探針、雜交的IGLCR探針和雜交的IGLL5探針有關的信號模式，其中單個細胞中 的信號模式表明存在或不存在B細胞的輕鏈限制性和克隆性。
【附圖說明】
[0012] 本專利或專利申請文件包含至少一幅彩圖。索取需支付必要的費用，專利局將提 供帶有彩圖的本專利或專利申請公開文本的復本。
[0013] 圖IA和圖IB示出了原位雜交測定的實例，其示出了 K-限制性（模式1，圖1Α， 左側部分）和λ-限制性（模式2,圖1Β，右側部分）中明顯的限制性輕鏈表達，其中在所 述腫瘤細胞中表達了兩條輕鏈中的一條。
[0014] 圖2示出了原位雜交測定，其中檢測了 κ (左側部分）和λ (右側部分）信號兩 者。
[0015] 圖3Α-圖3C示出了原位雜交測定，其中檢測了 κ和λ信號兩者。圖3Α示出了 κ染色，而圖3Β示出了 λ染色。圖3C示出了用RNA酶A的處理和λ探針的使用。
[0016] 圖4示出了編碼IgA輕鏈的區(qū)域中人染色體22的一部分的示意圖。
[0017] 圖5Α-圖示出了用λ和IGLL5探針的組織切片染色。圖5Α和圖5Β分別示出 了用λ和IGLL5探針的相鄰組織切片的染色。圖5C和圖分別示出了使用λ和IGLL5 探針，通過熒光或顯色測定檢測的雙重測定。
[0018] 圖6示出了 B細胞淋巴瘤的原位雜交測定，其中κ和λ信號存在于相同細胞中。 用κ (左上部分）、λ (右上部分）、IGLL5(左下部分）染色組織樣品，或用κ (DAB，棕色染 色）和λ (固紅，紅色染色）的雙重染色（右下部分）。
[0019] 圖7示出了原位雜交測定，其顯示了不同細胞中的K和λ信號。用K (用De印 Space Black染色，黑色染色）和λ (固紅，紅色染色）探針進行雙重染色。
[0020] 圖8示出了基于κ、λ和IGLL5mRNA表達模式確定輕鏈限制性的示意圖。數(shù)字 1-5對應于5種所觀察的表達模式。
[0021] 圖9示出了用于檢測靶核酸，如免疫球蛋白κ輕鏈恒定區(qū)（IGKCR)mRNA、免疫球蛋 白λ鏈恒定區(qū)（IGLCR)mRNA或者免疫球蛋白λ樣多肽5(IGLL5)的示例性探針構造。
[0022] 發(fā)明詳述
[0023] 本發(fā)明涉及用于檢測B細胞的免疫球蛋白輕鏈限制性和克隆性的方法。本發(fā)明所 述的方法提供了對于鑒定腫瘤B細胞有用的高靈敏度測定。本發(fā)明所述的方法還能夠用于 區(qū)分和鑒定通常使用常規(guī)免疫球蛋白輕鏈限制性分析被鑒定為良性的腫瘤B細胞。因此， 本發(fā)明所述的方法能夠用于診斷應用中，從而對B細胞腫瘤評價的診斷測定的有效性提供 更大的信心。
[0024] 已開發(fā)了 被稱為 RNAscope? 的 RNA ISH 技術平臺（Advanced Cell Diagnostics, Inc. ;Hayward CA)，其具有單分子靈敏度，能夠多重檢測并且適合于福爾 馬林固定和石蠟包埋（FFPE)的組織（參見，例如，Masand等人，5:108 - 116(2011); Ukpo 等人，Am. J. Surg. Pathol. 35:1343 (2011) ;Wang 等人，J. Mol. Diagnostics 14:22 - 29(2012))。RNAscope?代表了分子形態(tài)中的重大技術進步，并且在診斷病理學中提供了 多種應用，特別是那些必須檢測極低水平的mRNA的基于組織切片的測定。如本文所公開 的，將RNAscope?用于B細胞中的輕鏈限制性（LCR)檢測并且發(fā)現(xiàn)其提供了優(yōu)于先前的 LCR分析方法的結果和靈敏度。如本文進一步所公開的，RNAscope?.在LCR檢測中的應用 產生了比簡單的κ和λ鏈限制性更復雜的染色模式。這些模式的分析允許開發(fā)用于準確 確定B細胞的LCR，并因此確定其克隆性的測定和解釋算法（interpretation algorithm) (參見實施例）。
[0025] 免疫系統(tǒng)腫瘤是多種細胞來源的腫瘤的異質組。非霍奇金淋巴瘤（NHL)是免疫系 統(tǒng)腫瘤的最大的單個組。就B細胞腫瘤來說，腫瘤的特征取決于腫瘤類型，其包括與腫瘤有 關的B細胞發(fā)展階段。腫瘤源細胞可以與B細胞發(fā)展階段有關并且通常是骨髓B細胞、卵 泡B細胞或免疫母細胞B細胞（參見Cecil Textbook of Medicine，第20版，Bennet和 Plum 主編，WB Saunders, Philadelphia PA(1996) ;Harrison, s Principles of Internal Medicine,第 14 版，F(xiàn)auci 等人主編，McGraw-Hill, New York (1998))。基于分級（根據 5 年存活率），將B細胞淋巴瘤可被分類并且包括（例如）低級別淋巴瘤，如小淋巴細胞淋巴 瘤（SLL)、濾泡性小裂細胞淋巴瘤（FSCL)、濾泡性小裂細胞與大細胞混合性淋巴瘤（FML)和 粘膜相關淋巴組織（MALT);中級別淋巴瘤，如濾泡性大細胞型淋巴瘤（FLCL)、彌漫性小裂 細胞淋巴瘤（DSCL)、彌漫性小裂細胞與大細胞混合型淋巴瘤（DML)、彌漫性大細胞型（裂或 無裂）淋巴瘤（DLCL);和高級別淋巴瘤，如大細胞免疫母細胞型淋巴瘤（IBL)和小無裂細 胞型（伯基特和非伯基特）淋巴瘤（SNCL)。
[0026] 建立B淋巴細胞增殖的克隆性通常是通過證實單一種類的重鏈和/或輕鏈細胞 表面免疫球蛋白來實現(xiàn)的。在DNA水平，可以通過單一免疫球蛋白基因重排的存在確認克 隆性。在缺乏表面免疫球蛋白的前體B淋巴細胞腫瘤中，基因重排研宄是證實克隆性所必 需的。用于建立克隆性的常規(guī)測定法包括流式細胞術和/或基于免疫球蛋白或其他細胞 表面標志物的表面表達的免疫組織化學或者核酸基檢測測定，如原位雜交或聚合酶鏈反應 (PCR)測定。如本文所討論的，B淋巴細胞克隆性的一個標志是κ或λ輕鏈中一種的表達 的限制性。本發(fā)明涉及能夠高度準確和快速檢測免疫球蛋白輕鏈限制性的極敏感的原位雜 交測定的使用，其能夠被用于B細胞腫瘤的診斷中。
[0027] 本發(fā)明的測定在臨床應用，尤其是在B細胞腫瘤中是有用的。如本文所述，通過本 發(fā)明的測定和算法對LCR和B細胞克隆性的準確確定對于確診B細胞增殖性疾病是有用 的，從而使得能夠將B細胞腫瘤（克隆B細胞群體）與良性B細胞增殖性疾?。ǘ嗫寺。?相區(qū)分。本發(fā)明所述的方法在將通常將鑒別為陰性或不確定的含有明顯多克隆B細胞染色 模式的樣品與含有具有κ和λ染色兩者的單克隆細胞（即腫瘤細胞）的樣品區(qū)分中是尤 其有益的。
[0028] 此外，本發(fā)明另外提供了用于區(qū)分具有潛在臨床意義的多種κ / λ /IGLL5表達的 先前未識別模式（pattern)的測定和算法。已表明如通過流式細胞術確定的雙輕鏈蛋白質 表達與侵襲性B細胞淋巴瘤有關（Fujiwara等人，Internal Med. 46:1458 - 1461 ((2007)) 〇 有可能的是κ / λ/IGLL5mRNA表達的不同模式是可能具有不同預后和/或對療法的反應的 B細胞淋巴瘤的不同亞型的生物標志物。因此，本發(fā)明所述的方法可以用于鑒定B細胞淋巴 瘤的亞型和/或預測或監(jiān)控對B細胞淋巴瘤療法的反應。
[0029] 如本文所使用的，術語"核酸"，或者可替代地，術語"多核苷酸"是指核苷酸單體 單元的聚合物，如本領域技術人員公知的。示例性核酸包括例如DNA和RNA，其包括mRNA、 siRNA、hnRNA、基因組DNA、cDNA或核酸的其他公知形式。核酸或多核苷酸可以含有天然存 在的核苷酸，其包括公知的天然存在的核苷酸修飾，和非天然存在的核苷酸，如通過化學合 成制備的那些。這些修飾包括但不限于肽核酸（PNA)、修飾的寡核苷酸，例如，包含對于生 物RNA或DNA非典型的核苷酸的寡核苷酸，如2' -O-甲基化寡核苷酸等。多核苷酸的核苷 酸可以是脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或核苷酸類似物，可以是天然的或非天然的，并且可 以是未取代的、未修飾的、取代的或修飾的。所述核苷酸可以通過磷酸二酯鍵或通過硫代磷 酯鍵、膦酸甲酯鍵、硼烷磷酸酯鍵等連接。所述多核苷酸另外可以包含非核苷酸成份，如標 記物、猝滅劑、保護基團等，如本文所公開的。所述多核苷酸可以是單鏈的或雙鏈的。
[0030] 如本文所使用的，"核酸靶標"或"靶核酸"是指待檢測的核酸或其區(qū)域。通過本 發(fā)明的方法，本領域技術人員能夠容易地確定期望檢測的靶核酸。如本文所述，本發(fā)明涉 及檢測B細胞中免疫球蛋白輕鏈限制性和克隆性的方法。在本發(fā)明所述的方法中，靶核酸 通常是免疫球蛋白κ鏈恒定區(qū)（IGKCR)mRNA、免疫球蛋白λ鏈恒定區(qū)（IGLCR)mRNA和/ 或免疫球蛋白λ樣多肽5(IGLL5)。利用公知的探針設計方法和公共數(shù)據庫中可用的序 列，本領域技術人員能夠容易地設計適合于檢測IGKCR、IGLCR和/或IGLL5的探針。示例 性IGKCR序列可以在GenBank登錄號No. AF026381. I (GI :3169769)中找到。示例性IGLCR 序列可以在 GenBank 登錄號 No. U07991. I (GI :468246)和 HF541912. I (GI :444737700)中 找到。示例性 IGLL5 序列可以在 GenBank 登錄號 No. NM_001178126. I (GI :295986607)和 匪_001256296.1(61:372466585)中找到。161(〇?、161^〇?和/或161^5的其他示例性序列可 在公共數(shù)據庫，如NCBI的GenBank或EMBL中獲得，并且也可以使用它們。如果需要，探針 可以考慮B細胞發(fā)育期間發(fā)生的DNA重排，包括特定外顯子中探針的選擇。
[0031] 如本文所使用的，"標記物"是有利于分子檢測的部分。在本發(fā)明的背景中，常規(guī) 的標記物包括熒光、發(fā)光、光散射和/或比色標記物。適合的標記物包括酶，和熒光和顯色 部分以及放射性核素、底物、輔因子、抑制劑、化學發(fā)光部分、磁性顆粒等。在本發(fā)明具體 的實施方式中，標記物是酶。示例性酶標記物包括（但不限于）辣根過氧化物酶（HRP)、 堿性磷酸酶（AP)、B-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶等以及多種蛋白酶。其他標記物包括 但不限于熒光團、二硝基苯酚（DNP)等。標記物對于本領域技術人員來說是公知的，如， 例如，在 Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, (1996)以及美國專利 No. 3, 817, 837 ;3, 850, 752 ;3, 939, 350 ;3, 996, 345 ;4, 277, 437 ;4, 275, 149 和 4, 366, 241 中所述的。多種標記物是可商購的并且可以在本發(fā)明的方法和測定中使用，其包括可 檢測的酶/底物組合（Pierce，Rockford IL ;Santa Cruz Biotechnology, Dallas TX; Invitrogen, Carlsbad CA)。在本發(fā)明具體的實施方式中，酶能夠利用顯色或焚光底物以產 生可檢測信號，如本文所述的。
[0032] 如本文所使用的，"原位雜交"或"ISH"是指使用直接或間接標記的互補DNA或RNA 鏈（如探針）以結合至或定位樣品，具體地組織的部分或切片中特定核酸的一種雜交（原 位）。探針的類型可以是雙鏈DNA(dsDNA)、單鏈DNA(ssDNA)、單鏈互補RNA(sscRNA)、信使 RNA(mRNA)、微小RNA(miRNA)和/或合成寡核苷酸。術語"熒光原位雜交"或"FISH"是指使 用熒光標記物的一類ISH。術語"顯色原位雜交"或"CISH"是指使用顯色標記物的一類ISH。 ISH、FISH和CISH方法對于本領域技術人員來說是公知的（參見，例如，Stoler，Clinics in Laboratory Medicine 10 (1):215-236 (1990) ； In situ hybridization.A practical approach, Wilkinson 主編,IRL Press, Oxford(1992) ；Schwarzacher and Heslop-Harrison, Practical in situ hybridization, BIOS Scientific Publishers Ltd, Oxford(2000)) 〇
[0033] 如本文所使用的，短語"免疫球蛋白輕鏈限制性"是指