伊文氏藍(lán)或其衍生物修飾的Exendin-4及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明公開了伊文氏藍(lán)（Evans Blue)衍生物定位修飾Exendin-4的方法及經(jīng)定 位修飾后的Exendin-4在II型糖尿病和心肌梗死治療中的應(yīng)用，屬于生物醫(yī)藥、藥物制劑 領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 胰高血糖素肽_1(以下稱為GLP-1)的功能主要是誘導(dǎo)體內(nèi)各種生物學(xué)效應(yīng)，包括 刺激胰島素的分泌，抑制胰高血糖素的分泌，促進(jìn)飽腹感，抑制胃腸的蠕動(dòng)，增加葡萄糖的 攝取并減輕體重。有報(bào)道稱GLP-1能有效預(yù)防II型糖尿病的發(fā)展引起的胰腺細(xì)胞病變，在 非胰島素依賴型糖尿?。∟IDDM)中，GLP-1能夠促進(jìn)新生細(xì)胞的生長(zhǎng)，恢復(fù)胰島素的分泌。 GLP-1具有促進(jìn)胰島素的分泌卻不降低血糖方面的顯著地特性。此外，GLP-1的注射不會(huì)引 起任何毒副作用。因此GLP-1在治療II型糖尿病方面是非常有用的。另一方面，有大量實(shí) 驗(yàn)報(bào)道，GLP-1受體在心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞中均有表達(dá)，因此GLP-1對(duì)心肌缺血，心肌缺血/ 再灌注損傷以及慢性心臟衰竭，繼發(fā)心肌梗死都具有潛在的治療作用。在心肌缺血性損傷 中，GLP-1能夠通過GLP-1受體而激活cAMP和磷脂酸肌醇-3激酶，這兩種分子在保護(hù)心肌 缺血性損傷中發(fā)揮重要作用。另外，GLP-1能夠活化抗氧化酶而減輕心肌缺血所引起的纖 維化，并促進(jìn)左心室的功能恢復(fù)。鑒于GLP-1在心肌中的重要作用，開發(fā)出以GLP-1為先導(dǎo) 化合物的心肌疾病治療藥物成為當(dāng)代新藥研發(fā)的熱點(diǎn)方向之一。
[0003] 然而，GLP-1的廣泛應(yīng)用卻存在一個(gè)瓶頸問題，即GLP-1體內(nèi)半衰期短。詳細(xì)的 說，GLP-1是一種內(nèi)源性二肽基肽酶-IV(DPP-IV)的底物，DPP-IV通過移除GLP-1N-末端 組氨酸-丙氨酸的二肽部分（氨基酸7和8)使GLP-1失活，使得GLP-1生物周期短。目 前有許多方法可以減少GLP-1的降解或者延長(zhǎng)GLP-1在血漿中的壽命，同時(shí)保持其生物 活性，這些方法包括使用DPP-IV抑制劑，使用GLP-1受體和GLP-1衍生物反應(yīng)的配體，如 Exendin。Exendin是John Eng(美國(guó)專利號(hào)：5. 424. 286)從南美產(chǎn)毒蜥的唾液分泌物中 分離和鑒定出的天然產(chǎn)物，它屬于多肽類分子，能夠降低血液葡萄糖含量。Exendin-4與 GLP-1 (7-36)-見12具有高度同源性，其序列如下：
[0004] His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-The-Ser-Asp-Leu-Ser-Lysl2-Gln-Met-Glu-Glu-G lu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pr〇-Ser-Ser-Gly-Ala-Pr〇-Pr〇-Pr〇-Ser-Cys-NH2〇
[0005] 在體內(nèi)試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)Exendin-4的半衰期大大高于GLP-1，為2到4小時(shí)，每天腹部 注射2到3次，Exendin-4在血液中即可達(dá)到足夠的含量。此外，由于Exendin-4能夠調(diào)節(jié)胃 腸蠕動(dòng)，減少攝取食物并且抑制血液中胰高血糖素（美國(guó)專利號(hào)：6. 858. 576, 6. 956. 026， 6. 872. 700)。Exendin-4于2005年4月獲美國(guó)FDA批準(zhǔn)，用于改善使用二曱雙胍和磺酰 脲類藥物作用不理想的II型糖尿病患者的血糖控制。臨床結(jié)果顯示，Exendin-4用于糖 尿病治療效果明顯，且副反應(yīng)較小，但是每天兩次的皮下給藥給病人帶來很多不便。由于 Exendin-4在II-糖尿病治療機(jī)理方面具有明顯優(yōu)勢(shì)，開發(fā)其長(zhǎng)效類似物是很多國(guó)外制藥 公司研發(fā)熱點(diǎn)之一。目前已經(jīng)有多種嘗試將PEG修飾Exendin-4多肽，從而開發(fā)出長(zhǎng)效穩(wěn) 定的糖尿病治療藥物。目前常用的Exendin-4多肽的PEG修飾多為利用Exendin-4序列中 的賴氨酸實(shí)現(xiàn)修飾。例如美國(guó)專利NO. 6924264中闡述，使用分子量從5000到12000道爾 頓的PEG的分子通過與賴氨酸的e-氨基通過共價(jià)鍵結(jié)合而形成的Exendin-4類似物與未 經(jīng)修飾的Exendin-4相比，具有更長(zhǎng)的半衰期，同時(shí)保留了原有的生物活性。在另一專利 (CN102397558A)中報(bào)道，通過在Exendin-4序列中利用半胱氨酸替換某個(gè)氨基酸后可實(shí)現(xiàn) 對(duì)Exendin-4的定點(diǎn)PEG修飾，增加體內(nèi)半衰期并維持其生物活性。但是，由于序列中的賴 氨酸在Exendin-4與其受體結(jié)合時(shí)，需要發(fā)揮一定作用，通過此類方法定點(diǎn)或隨機(jī)的修飾 Exendin-4分子在與其受體結(jié)合時(shí)，由于PEG的存在導(dǎo)致Exendin-4與受體結(jié)合力減弱，進(jìn) 而明顯的降低Exendin-4的生物活性。另外，采用隨機(jī)標(biāo)記法，所得到的產(chǎn)物復(fù)合物在分離 純化上則受到很大挑戰(zhàn)，增加了生產(chǎn)制備成本。以上兩點(diǎn)嚴(yán)重限制了Exendin-4在臨床上 的進(jìn)一步應(yīng)用。
[0006] 伊文氏藍(lán)又稱為伊文思蘭，英文名稱為Evans blue (EB)，分子量為960. 8,化學(xué)分 子式為C34H24N6Na40 14S4，它為帶有金屬光澤的藍(lán)色結(jié)晶，極易溶于水，水溶液穩(wěn)定，微溶于乙 醇，幾乎不溶于苯、氯仿、乙醚。EB是一種重氮鹽類熒光染料，在550nm激發(fā)光照射下成紅 色熒光。EB在體內(nèi)和體外能夠以10:1摩爾比與血漿蛋白不可逆地結(jié)合，形成EB-白蛋白 復(fù)合物。白蛋白（又稱清蛋白，albumin, Alb)是由肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞合成，在血衆(zhòng)中的半衰期約 為15-19天，是血漿中含量最多的蛋白質(zhì)，占血漿總蛋白的40% -60%。白蛋白含585個(gè) 氨基酸殘基的單鏈多肽，分子量為66458,分子中含17個(gè)二硫鍵，不含有糖的組分。在體液 pH7. 4的環(huán)境中，白蛋白為負(fù)離子，每分子可以帶有200個(gè)以上負(fù)電荷。它是血漿中很主要 的載體，許多水溶性差的物質(zhì)可以通過與白蛋白的結(jié)合而被運(yùn)輸。利用EB和白蛋白之間特 異的結(jié)合，主要在以下幾個(gè)方面研宄，如血管-脊髓屏障通透性研宄；白蛋白定位；組織染 色等方面。
[0007] 伊文氏藍(lán)的示意結(jié)構(gòu)式：
[0008]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 伊文氏藍(lán)（Evans Blue)或其衍生物修飾的Exendin-4,其特征在于：Exendin-4氨 基酸序列為： His-Xaa-Glu-Gly-Thr-Phe-The-Ser-Asp-Xaa-Ser-Xaa-Xaa-Xaa-Glu-Xaa-Xaa-Ala -Xaa-Xaa-Xaa-Phe-IIe -Xaa-Trp-Leu-Xaa-Xaa -Gly-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa -Xaa-Xaa-Xaa-Xaa _Xaa_Xaa_Cys ;其中： 第 2 位的 Xaa 是 Gly，Thr，Ala，Ser，Leu，Ile 或 Lys ; 第 10 位的 Xaa 是 Leu，Ala，Ser，Leu，He，Glu 或 Lys ; 第 12 位的 Xaa 是 Lys，Leu，Thr，Ser，Leu，lie 或 Cys ; 第 13 位的 Xaa 是 Gin，Thr，Ala，Val，Leu，lie 或 Lys ; 第 14 位的 Xaa 是 Met，Tyr，Thr，Ala，Ser，lie 或 Lys ; 第 16 位的 Xaa 是 Glu，Lys，Ala，Ser，Leu，Trp 或 Thr ; 第 17 位的 Xaa 是 Glu，Asp，Ala，Ser，Leu，lie 或 Lys ; 第 19 位的 Xaa 是 Val，Cys，Ala，Ser，Leu，lie 或 Lys ; 第 20 位的 Xaa 是 Arg，Thr，Tyr，Ser，Leu，lie 或 Lys ; 第 21 位的 Xaa 是 Leu，Thr，Ala，Asp，Glu，His 或 Lys ; 第 24 位的 Xaa 是 Glu，Leu，Thr，Ala，Ser，Lys 或 lie ; 第 27 位的 Xaa 是 Lys，Ala，Ser，Leu，Thr，lie 或 Lys ; 第 28 位的 Xaa 是 Asp，Thr，Ala，Ser，Leu，lie 或 Lys ; 第 30 位的 Xaa 是 Gly，Thr，Ala，Ser，Leu，lie 或 Arg ; 第 31 位的 Xaa 是 Pro, Val，Ser，Ala，Leu，lie 或 Lys ; 第 32 位的 Xaa 是 Ser，Thr，Glu，Ser，Asp，Lys 或 lie ; 第 33 位的 Xaa 是 Thr，Ser，Ala，Met，Leu，lie 或 Lys ; 第 34 位的 Xaa 是 Gly，Thr，Met，Ser，He，Leu 或 Lys ; 第 35 位的 Xaa 是 Ala，Thr，Ala，Glu，Leu，lie 或 Phe ; 第 36 位的 Xaa 是 Pro, Ala，Thr，Ser，Leu，lie 或 Cys ; 第 37 位的 Xaa 是 Pro, Thr，Ser，Ala，His，Lys 或 lie ; 第 38 位的 Xaa 是 Pro, Thr，Val，Ser，Leu，Lys 或 lie ; 第 39 位的 Xaa 是 Ser，Tyr，Ala，Leu，Ser，lie 或 Lys ; 未經(jīng)伊文氏藍(lán)或其衍生物修飾的Exendin-4簡(jiǎn)稱為CysEX4, CysEX4通過化學(xué)合成獲得 或通過基因工程重組表達(dá)的方式獲得。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的CysEX4,其特征在于：CysEX4是基于天然或重組的 Exendin-4〇
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的CysEX4,其特征在于：伊文氏藍(lán)（Evans Blue)或其衍生物偶 聯(lián)到CysEX4的C末端半胱氨酸巰基上。
4. 一種制備權(quán)利要求1所述CysEX4的方法，其特征在于：步驟如下： (1) 含有還原劑的醋酸鈉溶液中CysEX4與伊文氏藍(lán)（Evans Blue)或其衍生物偶聯(lián)反 應(yīng)； (2) 在避光條件下，4°C，反應(yīng)2小時(shí)，儲(chǔ)存步驟（1)的反應(yīng)混合物； (3) 從反應(yīng)混合物中移除未反應(yīng)物質(zhì)； (4)從未反應(yīng)物質(zhì)的游離混合物中分離和提純伊文氏藍(lán)（Evans Blue)或其衍生物單 獨(dú)修飾的CysEX4。
5. 伊文氏藍(lán)（Evans Blue)或其衍生物修飾的CysEx4作為制備預(yù)防和治療II型糖尿 病藥物的應(yīng)用，通過促進(jìn)胰島素的過量分泌來實(shí)現(xiàn)。
6. 伊文氏藍(lán)（Evans Blue)或其衍生物修飾的CysEx4作為制備預(yù)防和治療心肌梗死藥 物的應(yīng)用。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的CysEx4,其特征在于：伊文氏藍(lán)或其衍生物為伊文氏藍(lán) 琥珀酰亞胺基丙酸酯、伊文氏藍(lán)N-羥基琥珀酰亞胺、伊文氏藍(lán)醛、伊文氏藍(lán)馬來酰亞胺、伊 文氏藍(lán)吡啶基二硫酚或伊文氏藍(lán)碘代乙?；?。
8. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于：在伊文氏藍(lán)與CysEx4偶聯(lián)反應(yīng)中，采用 的還原劑為NaCNBH3。
9. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于：步驟（1)中伊文氏藍(lán)與CysEX4的摩爾比 為 I: Io
10. 根據(jù)權(quán)利要求5或6中所述的用途，其特征在于：伊文氏藍(lán)修飾CysEX4的復(fù)合物 作為活性劑制備成口服或注射劑。
【專利摘要】本發(fā)明涉及伊文氏藍(lán)(Evans Blue)或其伊文氏藍(lán)衍生物定位修飾的Exendin-4的制備方法及其應(yīng)用。經(jīng)伊文氏藍(lán)或其伊文氏藍(lán)衍生物在Exendin-4的C末端特異性修飾后的產(chǎn)物與未經(jīng)修飾的Exendin-4具有相似的生物活性，同時(shí)擁有比未修飾的Exendin-4更長(zhǎng)的體內(nèi)半衰期。鑒于Exendin-4在疾病中的重要作用，本發(fā)明同時(shí)公開了伊文氏藍(lán)(Evans Blue)或其衍生物修飾的Exendin-4作為制備治療II型糖尿病以及心肌梗死藥物方面的應(yīng)用，其具有制備簡(jiǎn)便，療效明顯，藥效長(zhǎng)久、穩(wěn)定、便于儲(chǔ)存等優(yōu)點(diǎn)，在制備促進(jìn)抗糖尿病、抗心肌梗死高效治療的新藥研發(fā)中具有重要意義。
【IPC分類】A61P9-10, A61P3-10, A61K38-22, C07K14-575, A61K47-48, C07K1-107
【公開號(hào)】CN104650217
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510039442
【發(fā)明人】陳小元, 朱雷, 郎立新
【申請(qǐng)人】匯佳生物科技（上海）有限公司
【公開日】2015年5月27日
【申請(qǐng)日】2015年1月26日