一種利用囊胚期胚胎細(xì)胞進(jìn)行胚胎染色體異常檢測(cè)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種利用體外發(fā)育到囊胚期的胚胎細(xì) 胞，在單細(xì)胞擴(kuò)增基礎(chǔ)上進(jìn)行染色體異常檢測(cè)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 20年前，我國(guó)育齡人群中的不孕不育率僅為3%，處于全世界較低水平。2009中國(guó) 不孕不育高峰論壇公布的《中國(guó)不孕不育現(xiàn)狀調(diào)研報(bào)告》顯示，全國(guó)不孕不育患者人數(shù)已超 過(guò)5000萬(wàn)，以25歲至30歲人數(shù)最多，呈年輕化趨勢(shì)，平均每8對(duì)育齡夫婦中就有1對(duì)面臨 生育方面的困難，不孕不育率攀升到12. 5% -15%，接近發(fā)達(dá)國(guó)家15% -20%的比率。最為 嚴(yán)峻的是，這一比例還在不斷攀升，衛(wèi)生組織專(zhuān)家預(yù)估中國(guó)的不孕不育率將會(huì)在近幾年攀 升到20%以上。
[0003] 輔助生殖技術(shù)可有效解決這一問(wèn)題，其中，試管嬰兒是最受歡迎的一種輔助技術(shù)， 自1978年誕生第一位試管嬰兒以來(lái)，目前全世界已有超過(guò)500萬(wàn)例試管嬰兒誕生。近年來(lái)， 我國(guó)輔助生殖領(lǐng)域也處在高速發(fā)展階段，但仍存在周期數(shù)高、妊娠率和活產(chǎn)率低的現(xiàn)狀，造 成巨大的醫(yī)療資源的浪費(fèi)和經(jīng)濟(jì)、健康損失，提高試管嬰兒的成功率是各大輔助生殖中心 面臨的主要問(wèn)題。據(jù)報(bào)道，通過(guò)試管嬰兒技術(shù)獲得的胚胎通常有40% -60%存在染色體異 常，這是導(dǎo)致試管嬰兒失敗的主要原因之一，通過(guò)對(duì)植入前的胚胎進(jìn)行遺傳學(xué)檢測(cè)，確保染 色體數(shù)目以及結(jié)構(gòu)正常以后再進(jìn)行胚胎植入，可以有效提高植入健康胚胎的概率，改善妊 娠結(jié)果，因此胚胎植入前遺傳學(xué)篩查（PGS)技術(shù)開(kāi)始越來(lái)越受到重視。
[0004] 胚胎植入前遺傳學(xué)篩查是指胚胎植入著床之前，對(duì)早期胚胎進(jìn)行染色體數(shù)目和結(jié) 構(gòu)異常的檢測(cè)，通過(guò)一次性檢測(cè)胚胎23對(duì)染色體的結(jié)構(gòu)和數(shù)目，分析胚胎是否有遺傳物質(zhì) 異常的一種早期產(chǎn)前篩查方法。目前，臨床上進(jìn)行PGS檢測(cè)的方法主要包括Fish、Array CGH等，然而這兩種技術(shù)都存在一定的局限：FISH技術(shù)目前存在的問(wèn)題在于無(wú)法一次性檢 測(cè)所有染色體，操作繁瑣，分辨率低；CGH的缺點(diǎn)在于只能檢測(cè)已知的染色體異常，并且費(fèi) 用昂貴。而利用半導(dǎo)體高通量測(cè)序法進(jìn)行PGS檢測(cè)，既彌補(bǔ)了FISH在準(zhǔn)確度和檢測(cè)通量方 面的缺陷，又降低了單個(gè)樣本的檢測(cè)成本，同時(shí)提高了檢測(cè)準(zhǔn)確度，已經(jīng)成為未來(lái)PGS檢測(cè) 的發(fā)展方向。
[0005] 胚胎植入前染色體檢測(cè)是通過(guò)分離胚胎中的部分細(xì)胞，通過(guò)對(duì)這部分細(xì)胞的檢測(cè) 推斷整個(gè)胚胎的染色體是否正常。無(wú)論基于何種檢測(cè)技術(shù)，首先需要對(duì)體外發(fā)育中的胚胎 進(jìn)行部分細(xì)胞的分離，目前常用的是卵裂球分離法，從發(fā)育到8細(xì)胞期的胚胎中分離出1-2 個(gè)卵裂球，通過(guò)對(duì)1-2個(gè)卵裂球進(jìn)行單細(xì)胞擴(kuò)增測(cè)序進(jìn)行染色體異常檢測(cè)，但由于模板數(shù) 量極少，經(jīng)常容易發(fā)生擴(kuò)增失敗及擴(kuò)增偏好性大的問(wèn)題，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。而囊胚期的胚胎相 對(duì)于卵裂期而言，細(xì)胞數(shù)量大量增加，而且此時(shí)形成的胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞不直接發(fā)育成胎兒， 可以分離5-10個(gè)滋養(yǎng)層細(xì)胞而胚胎的正常發(fā)育不會(huì)受到影響。本發(fā)明就是建立了一套分 離囊胚期胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行胚胎染色體檢測(cè)的流程，該技術(shù)不僅僅提高了單細(xì)胞擴(kuò)增的 成功率，結(jié)合高通量測(cè)序的方法也使染色體檢測(cè)的準(zhǔn)確度和靈敏度大幅提高，可達(dá)99%以 上。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種利用胚胎囊胚期細(xì)胞進(jìn)行基因組擴(kuò)增并 結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)植入前的胚胎進(jìn)行染色體檢測(cè)，從中篩選出染色體正常胚胎的方 法，所涉及的步驟包括：
[0007] 1、囊胚期滋養(yǎng)層細(xì)胞分離：在受精卵體外發(fā)育到第5天時(shí)，分離5-10個(gè)胚胎滋養(yǎng) 層細(xì)胞；
[0008] 2、全基因組擴(kuò)增：對(duì)分離出的細(xì)胞樣本進(jìn)行全基因組擴(kuò)增，擴(kuò)增后的樣本用磁珠 法純化DNA;對(duì)擴(kuò)增的基因組DNA進(jìn)行定量分析，分析檢測(cè)結(jié)果顯示無(wú)降解、無(wú)污染、符合二 代測(cè)序技術(shù)所要求的DNA起始量的樣品才可以進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)；所述定量分析方法為瓊脂 糖凝膠電泳、Agilent2100Bioanalyzer檢測(cè)或QubitdsDNAHSAssayKit;
[0009] 3、DNA片段化：對(duì)擴(kuò)增樣本進(jìn)行酶切處理，使DNA的片段長(zhǎng)度適合二代測(cè)序的長(zhǎng) 度要求，用EDTA終止實(shí)驗(yàn)，然后用磁珠法純化酶切產(chǎn)物；對(duì)于片段化后的DNA，使用Qubit dsDNAHSAssayKit進(jìn)行定量分析，使用Agilent2100Bioanalyzer檢測(cè)進(jìn)行片段大小分 析；
[0010] 4、Proton文庫(kù)構(gòu)建：用DNA酶切后的產(chǎn)物進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，DNA片段末端補(bǔ)平后純 化，兩端加特異性接頭后純化，PCR擴(kuò)增后純化；
[0011] 5、上機(jī)測(cè)序：計(jì)算文庫(kù)的稀釋倍數(shù)，利用乳液PCR技術(shù)形成達(dá)到測(cè)序要求的陽(yáng)性 測(cè)序模板，利用IonProton半導(dǎo)體測(cè)序系統(tǒng)對(duì)測(cè)序模板進(jìn)行測(cè)序，最終獲得每個(gè)DNA片段 的喊基序列；
[0012] 6、測(cè)序數(shù)據(jù)分析：將測(cè)序結(jié)果利用生物信息學(xué)分析把這些序列定位到人類(lèi)基因組 參考圖譜上，通過(guò)與參考基因組的對(duì)比分析樣本的染色體變異信息。
[0013] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：利用發(fā)育到囊胚期的胚胎進(jìn)行滋養(yǎng)層細(xì)胞分離檢測(cè)，避免了 卵裂期細(xì)胞分離對(duì)胚胎造成的傷害，獲得細(xì)胞數(shù)量比卵裂期更多，提高了基因組擴(kuò)增的成 功率及擴(kuò)增效果；囊胚期的胚胎經(jīng)過(guò)自然淘汰過(guò)程，選擇優(yōu)質(zhì)的囊胚期胚胎進(jìn)行檢測(cè)，更節(jié) 約成本；此外，本發(fā)明利用高通量測(cè)序的方法可以準(zhǔn)確高效的對(duì)染色體全部的非整倍體異 常及4M以上的微缺失微重復(fù)等進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)通量高，準(zhǔn)確性和靈敏度可達(dá)到99%以上。
【附圖說(shuō)明】
[0014] 為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例描述中所需要使 用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹。
[0015] 圖1為用顯微操作儀吸取胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞的操作圖；
[0016] 圖2為基因組擴(kuò)增后的Aglient2100分析結(jié)果圖；
[0017] 圖3為本發(fā)明中3個(gè)樣本的基因組擴(kuò)增測(cè)序重復(fù)性分析圖。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完 整地描述。
[0019] 實(shí)施例1 :
[0020] 分離囊胚滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞
[0021] 選擇試管嬰兒中的高危人群（年齡多35,反復(fù)種植失敗，反復(fù)流產(chǎn)）的體外受精胚 胎，采用常規(guī)胚胎活檢方法獲取囊胚滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞；在胚胎發(fā)育到D3階段時(shí)用激光進(jìn)行 透明帶打孔，繼續(xù)培養(yǎng)至D5階段，此時(shí)滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞擠出透明帶，如圖1，用平口顯微操 作針吸取部分滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞（5-10個(gè)），用激光切斷；吸取的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至PBS溶液中洗滌 3遍。
[0022] 實(shí)施例2 :
[0023] 裂解細(xì)胞及單細(xì)胞擴(kuò)增
[0024] (1)細(xì)胞裂解
[0025] 洗滌好的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至0. 2mL的PCR管，根據(jù)樣本數(shù)量，混合細(xì)胞裂解緩沖液和細(xì)胞 裂解酶，將混合液加入到細(xì)胞樣本中，單個(gè)樣本反應(yīng)體系如下表1所示：
[0026] 表 1
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種利用囊胚期胚胎細(xì)胞進(jìn)行胚胎染色體異常檢測(cè)的方法，其特征在于，包括如下 步驟： (1) 囊胚期滋養(yǎng)層細(xì)胞分離：從發(fā)育至囊胚期的受精卵中分離胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞； (2) 全基因組擴(kuò)增：對(duì)分離出的胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞樣本進(jìn)行全基因組擴(kuò)增并純化、并進(jìn) 行基因組DNA的定量分析； (3)DNA片段化：將步驟（2)中定量分析合格的基因組DNA進(jìn)行片段化處理并定量分 析； (4)Proton文庫(kù)構(gòu)建后進(jìn)行上機(jī)測(cè)序以獲得每個(gè)DNA片段的堿基序列，并對(duì)堿基序列 進(jìn)行分析以獲得染色體變異信息。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用囊胚期胚胎細(xì)胞進(jìn)行胚胎染色體異常檢測(cè)的方法， 其特征在于，步驟（1)中，在受精卵體外發(fā)育到第5天時(shí)，分離5-10個(gè)胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用囊胚期胚胎細(xì)胞進(jìn)行胚胎染色體異常檢測(cè)的方法， 其特征在于，步驟（2)中，對(duì)分離出的細(xì)胞樣本進(jìn)行全基因組擴(kuò)增，擴(kuò)增后的樣本用磁珠法 純化DNA;對(duì)擴(kuò)增的基因組DNA進(jìn)行定量分析，分析檢測(cè)結(jié)果顯示無(wú)降解、無(wú)污染、符合二代 測(cè)序技術(shù)所要求的DNA起始量的樣品用于進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用囊胚期胚胎細(xì)胞進(jìn)行胚胎染色體異常檢測(cè)的方法， 其特征在于，步驟（3)中，對(duì)擴(kuò)增樣本進(jìn)行酶切處理，使DNA的片段長(zhǎng)度適合二代測(cè)序的長(zhǎng) 度要求，用EDTA終止實(shí)驗(yàn)，然后用磁珠法純化酶切產(chǎn)物；對(duì)于片段化后的DNA進(jìn)行定量分析 及片段大小分析。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用囊胚期胚胎細(xì)胞進(jìn)行胚胎染色體異常檢測(cè)的方法， 其特征在于，步驟（4)中，用DNA酶切后的產(chǎn)物進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，DNA片段末端補(bǔ)平后純化，兩 端加特異性接頭后純化，PCR擴(kuò)增后純化。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種利用囊胚期胚胎細(xì)胞進(jìn)行胚胎染色體異常檢測(cè)的方法， 其特征在于，步驟（4)中，文庫(kù)構(gòu)建后，計(jì)算文庫(kù)的稀釋倍數(shù)，利用乳液PCR技術(shù)形成達(dá)到測(cè) 序要求的陽(yáng)性測(cè)序模板，利用IonProton半導(dǎo)體測(cè)序系統(tǒng)對(duì)測(cè)序模板進(jìn)行測(cè)序，最終獲得 每個(gè)DNA片段的堿基序列。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種利用囊胚期胚胎細(xì)胞進(jìn)行胚胎染色體異常檢測(cè)的方法， 其特征在于，步驟（4)中，將測(cè)序結(jié)果利用生物信息學(xué)分析把這些序列定位到人類(lèi)基因組 參考圖譜上，通過(guò)與參考基因組的對(duì)比分析樣本的染色體變異信息。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種利用胚胎囊胚期細(xì)胞進(jìn)行基因組擴(kuò)增并結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)植入前的胚胎進(jìn)行染色體檢測(cè)，從中篩選出染色體正常胚胎的方法，可以全面完整的分析胚胎基因組的遺傳變異信息，從而指導(dǎo)植入前胚胎的選擇，減少遺傳性疾病，提高試管嬰兒的成功率，所涉及的步驟包括：囊胚期滋養(yǎng)層細(xì)胞分離；全基因組擴(kuò)增；DNA片段化；Proton文庫(kù)構(gòu)建、上機(jī)測(cè)序及測(cè)序數(shù)據(jù)分析。該發(fā)明利用發(fā)育到囊胚期的胚胎進(jìn)行滋養(yǎng)層細(xì)胞分離檢測(cè)，避免了卵裂期細(xì)胞分離對(duì)胚胎造成的傷害，獲得細(xì)胞數(shù)量比卵裂期更多，提高了基因組擴(kuò)增的成功率及擴(kuò)增效果；囊胚期的胚胎經(jīng)過(guò)自然淘汰過(guò)程，選擇優(yōu)質(zhì)的囊胚期胚胎進(jìn)行檢測(cè)，更節(jié)約成本。
【IPC分類(lèi)】C12Q1-68
【公開(kāi)號(hào)】CN104711362
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510141442
【發(fā)明人】梁波, 孔令印, 冒燕, 宣黎明, 申靜靜, 祝軼君
【申請(qǐng)人】蘇州貝康醫(yī)療器械有限公司
【公開(kāi)日】2015年6月17日
【申請(qǐng)日】2015年3月27日