一株含有人工鋅指轉(zhuǎn)錄因子的里氏木霉重組菌株及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一株含有人工鋅指轉(zhuǎn)錄因子的里氏木霉重組菌株及其應(yīng)用，屬于微生 物生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，隨著現(xiàn)代社會(huì)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展和人口的持續(xù)增長，人們對(duì)能源的需求量 與日俱增，可再生能源的開發(fā)引起國內(nèi)外普遍關(guān)注。纖維素和半纖維素是世界上最豐富的 可再生資源，利用纖維素酶和半纖維素酶可以將其水解為葡萄糖和木糖，并進(jìn)一步發(fā)酵生 產(chǎn)可再生生物能源（燃料乙醇和丁醇等），同時(shí)也可以生產(chǎn)多種生物基化學(xué)品。絲狀真菌和 分解纖維素的細(xì)菌能生成胞外纖維素酶，絲狀真菌纖維素酶主要由三類酶組分，纖維素外 切酶、纖維素內(nèi)切酶和葡萄糖苷酶，這些酶通過協(xié)同作用來完成對(duì)底物纖維素的降解。 自然界中纖維素酶的來源十分廣泛，其中絲狀真菌是產(chǎn)纖維素酶重要的微生物之一，里氏 木霉C30是目前公認(rèn)的分泌胞外蛋白能力最強(qiáng)，產(chǎn)纖維素酶系較全的工業(yè)菌株，其胞外分 泌蛋白濃度可尚達(dá)100克每升。
[0003] 盡管里氏木霉具有大量的胞外蛋白質(zhì)分泌，但其產(chǎn)酶周期長、酶活低，導(dǎo)致纖維素 酶的生產(chǎn)成本過高，不能滿足大規(guī)模經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)可再生能源和生物基化學(xué)品的需求。國內(nèi)外 研宄工作者已經(jīng)選育出多種纖維素酶高產(chǎn)菌株，但是在自然環(huán)境中直接分離得到的產(chǎn)纖維 素酶菌種，一般產(chǎn)酶性能較差，不能滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需要。通過人工誘變、基因工程改造 等方法改良菌種的遺傳性狀，選育纖維素酶活力高、酶系組成全面的產(chǎn)酶菌株在纖維素酶 工業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用中有重要意義。
[0004] 鋅指蛋白是一類細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子，是指具有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在真核 生物的胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化、增強(qiáng)抗逆性、基因的表達(dá)調(diào)控等方面有重要作用。鋅指結(jié)構(gòu)既 能與RNA和DNA結(jié)合，又能與DNA-RNA雙鏈分子以及同類蛋白結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上 調(diào)節(jié)和控制基因表達(dá)，因此在人工轉(zhuǎn)錄因子的構(gòu)建中，鋅指蛋白被認(rèn)為是最有前途的DNA 結(jié)合域。不同的蛋白結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)不同的功能，根據(jù)鋅指蛋白保守結(jié)構(gòu)域的差異，可以將其分 為C2H2(Cys2His2)型、C4(Cys4)型和C6(Cys6)型等3個(gè)類群。C2H2型鋅指是經(jīng)典型鋅 指，是目前研宄的最多、分布最廣泛的鋅指。因此，可以設(shè)計(jì)人工的DNA結(jié)合域和效應(yīng)區(qū)， 創(chuàng)建所需要的人工轉(zhuǎn)錄因子（Artificial Transcription Factor, ATF)，同時(shí)調(diào)控細(xì)胞內(nèi) 多個(gè)基因的表達(dá)。人工轉(zhuǎn)錄因子技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域，通過此方法已經(jīng)在提高蛋 白的表達(dá)產(chǎn)量、提高細(xì)胞耐受溶劑、滲透壓、溫度、PH值特性等方面取得了成功，在釀酒酵母 和大腸桿菌菌株改造中都有成功應(yīng)用（參考Nature Biotechnology, 2003, 21:1208-1214 ; Applied Microbiology and Biotechnology, 2015, 99(5) :2441_9)，但在絲狀真菌中的相關(guān) 工作還沒有報(bào)道。
[0005] 本專利通過人工設(shè)計(jì)和改造鋅指蛋白，進(jìn)而將其導(dǎo)入到絲狀真菌里氏木霉細(xì)胞 內(nèi)，通過人工轉(zhuǎn)錄因子在菌體內(nèi)部隨機(jī)整合和激活/抑制相應(yīng)調(diào)控和產(chǎn)生纖維素酶基因的 表達(dá)，產(chǎn)生一個(gè)高庫容量攜帶鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子的里氏木霉重組菌株庫，進(jìn)而通過纖維素 降解活性的篩選獲得纖維素降解酶酶活提高的重組菌株。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明目的是提供一株含有人工鋅指轉(zhuǎn)錄因子的里氏木霉重組菌株及其應(yīng)用，其 基因組中含有本發(fā)明所用的核酸序列（附錄序列1)，其翻譯產(chǎn)物是一種蛋白質(zhì)（附錄序列 2)，可以行使轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能來進(jìn)行纖維素酶的高效誘導(dǎo)表達(dá)，在生物質(zhì)高效降解中具有重 要的應(yīng)用價(jià)值。
[0007] 本發(fā)明提供一株含有人工鋅指轉(zhuǎn)錄因子的里氏木霉重組菌株（Trichoderma reesei)，所述菌株的登記入冊(cè)編號(hào)為CGMCC No. 10649,保藏于中國微生物菌種保藏管理委 員會(huì)普通微生物中心，保藏單位地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生 物研宄所，保藏日期為2015年4月16日。
[0008] 本發(fā)明同時(shí)提供一種技術(shù)路線，可以使里氏木霉菌株獲得高產(chǎn)纖維素酶的性狀和 功能，流程方法如下：
[0009] (1)構(gòu)建絲狀真菌表達(dá)載體PCB303,將人工鋅指蛋白文庫核酸序列連接至表達(dá) 載體中，人工鋅指蛋白文庫基因來源于文獻(xiàn)報(bào)道的人工合成基因 （Nature Biotechnolo gy，2003, 21:1208-1214)。
[0010] (2)將所獲得的文庫集合通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)移至絲狀真菌里氏木霉中。在纖 維素為誘導(dǎo)物條件下通過液體搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，篩選出纖維素酶活性穩(wěn)定提高的菌株。
[0011] 最終得到了一株含有人工鋅指轉(zhuǎn)錄因子的里氏木霉重組菌株U5,并對(duì)遮住菌株進(jìn) 行后續(xù)的各酶活分析測定和分子機(jī)制分析。里氏木霉U5在纖維素麩皮發(fā)酵條件下，總濾紙 酶活可以比出發(fā)菌株C30提高35%，達(dá)到8.4酶活單位每毫升，其中β葡萄糖苷酶活性提 高了 3. 5倍，達(dá)到8. 8酶活單位每毫升。通過基因轉(zhuǎn)錄水平分析確定了纖維素酶活性提高 部分原因是β葡萄糖苷酶基因（bgll)過量表達(dá)所導(dǎo)致。
【附圖說明】：
[0012] 圖1是本發(fā)明鋅指蛋白文庫質(zhì)粒圖譜（其中ZFP-Gal4代表鋅指和Gal4激活結(jié)構(gòu) 域融合蛋白）。
[0013] 圖2是本發(fā)明纖維素酶活性變化顯著菌株纖維素酶的比較。
[0014] 圖3是本發(fā)明中里氏木霉U5和里氏木霉C30的纖維素酶組分活性對(duì)比。
[0015] 圖4是本發(fā)明中鋅指蛋白U5重新轉(zhuǎn)化里氏木霉C30的濾紙酶活驗(yàn)證結(jié)果（其中 ZFP-Gal4代表鋅指和Gal4激活結(jié)構(gòu)域融合蛋白）。
[0016] 圖5是突變體基因表達(dá)水平與對(duì)照菌株的比較分析。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 實(shí)驗(yàn)材料和試劑
[0018] 菌株：出發(fā)菌株里氏木霉Trichoderma reesei C30,在美國典型菌種保藏中心 (ATCC)購買，登錄號(hào)為ATCC 56765。
[0019] 培養(yǎng)基：
[0020] PDA培養(yǎng)基（1升內(nèi)含量）：土豆粉200克，葡萄糖20克，瓊脂粉20克；
[0021] 麥芽浸粉培養(yǎng)基（1升內(nèi)含量）：麥芽粉30克，瓊脂粉20克；
[0022] 孟德爾鹽培養(yǎng)基（1升內(nèi)的含量）：
[0023] 鹽溶液：（NH4)2SO4 1. 4 克；KH2PO4 2 克；Urea 0· 3 克；CaCl2 0· 3 克；MgSOJH2O 0· 3 克；微量兀素溶液1 _升pH 4. 8 ;
[0024] 微量元素溶液：檸檬酸，5 克；ZnSO4 · 7H20, 5 克；Fe (NH4) 2 (SO4) 2 · 6H20,1 克； CuSO4 · 5H20,0. 25 克；MnSO4 · H2O, 50 毫克；H3B04, 50 毫克；NaMnO4 · 2H20, 50 毫克；加去離子 水定容到100毫升；
[0025] 孢子萌發(fā)培養(yǎng)基（1升）：蛋白胨I. 0克；葡萄糖10克；
[0026] 發(fā)酵培養(yǎng)基（1升）：蛋白胨1. 0克；微晶纖維素10克；
[0027] 誘導(dǎo)培養(yǎng)基（1 升）！K2HPO4 2. 05 克；KH2PO4 1. 45 克；NaCl 0· 15 克；MgSO4 · 7H20 〇.5克；〇3(：12.2!12〇〇.〇67克丨65〇 4.7!12〇〇.〇〇25克；(順4)25〇 4〇.5克；葡萄糖2.〇克0!1 5. 3 ；
[0028] 共培養(yǎng)培養(yǎng)基（1升）：誘導(dǎo)培養(yǎng)基中葡萄糖濃度減半，即l.Og，另外添加20g瓊脂 粉；
[0029] 搖瓶篩選培養(yǎng)基（1 升）：KH2P04,1. 4 克；MgSO4 · 7H20,0· 3 克；CaCl2 · 2H20 0· 4 克； FeSO4 · 7H20,10毫克；Urea 0. 3克；微量元素1毫升，40克微晶纖維素；30克酵母粉，20克 麩皮。
[0030] 說明：以下實(shí)施例中未作具體說明的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，均參照《分子克隆實(shí)驗(yàn) 指南》（第三版）J.薩姆布魯克一書所列的具體方法進(jìn)行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說明書進(jìn) 行。
[0031] 實(shí)施例1 :里氏木霉鋅指蛋白文庫構(gòu)建
[0032] 本發(fā)明涉及的人工鋅指為Cys2His2型鋅指，構(gòu)建方法參考Nature Biotechnology, 2003, 21:1208-1214,包含四個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域，由韓國ToolGen公司提供。 此鋅指文庫特征是具有來源于釀酒酵母保守的轉(zhuǎn)錄因子激活域Gal4,和可變的C2H2型 鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域，庫容量大約是IO 6個(gè)；雙元表達(dá)載體骨架是PCB303,該載體是由絲狀真 菌表達(dá)載體 PAN7-1 (參考 Gene, 1987, 56:117-124)和 pCB301 (參考 Plant Molecular Biology, 1999,40:711-717)改造而來，其中包含有來自里氏木霉的pki啟動(dòng)子和trpC終止 子，可將鋅指蛋白文庫核酸序列插入到兩酶切位點(diǎn)之間。本發(fā)明中的鋅指蛋白文庫DNA片 段通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)從酵母鋅指蛋白文庫的pRS316-CYC-lib-Gal4載體上獲得， 并通過Nco I和Xba I的酶切位點(diǎn)連入pCB303表達(dá)載體，組建并獲得pCB303-Lib-Gal-hph 鋅指文庫，見附圖1。該載體在細(xì)菌中的抗性選擇標(biāo)記是卡那霉素（Kanamycin)，在真菌中 選擇標(biāo)記是潮霉素（hygromycin)。
[0033] 1.鋅指蛋白與轉(zhuǎn)錄激活域DNA片段的獲得
[0034] 正向引物 P1 :5' -AACACAAATACACACACTAATCTAGAACTAG-3'
[0035] 反向引物 P2 :5' -CATAACTAATTACATGACTCGAGGTCGACTTAC-3'
[0036] PCR反應(yīng)條件如表1所示：
[0037] 表1PCR反應(yīng)條件
[0038]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一株含有人工鋅指轉(zhuǎn)錄因子的里氏木霉重組菌株（Trichoderma reesei)，其特征在 于：所述菌株的等級(jí)入冊(cè)編號(hào)為CGMCC No. 10649,保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì) 普通微生物中心，保藏日期為2015年4月16日。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一株含有人工鋅指轉(zhuǎn)錄因子的里氏木霉重組菌株的應(yīng)用，其 特征在于：所述菌株應(yīng)用于生物質(zhì)的降解。
【專利摘要】一株含有人工鋅指轉(zhuǎn)錄因子的里氏木霉重組菌株(Trichoderma reesei)及其應(yīng)用，屬于微生物生物技術(shù)領(lǐng)域。該菌株于2015年4月16日保存于中國普通微生物菌種保藏中心，保藏號(hào)為CGMCC No.10649。該菌株命名為里氏木霉U5，它是將人工鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子文庫轉(zhuǎn)入到出發(fā)菌株里氏木霉C30中，通過纖維素酶活性篩選得到的高產(chǎn)纖維素酶的菌株。在麩皮誘導(dǎo)條件下該菌株的纖維素酶活性比野生型里氏木霉C30提高了約35％，達(dá)到了8.4酶活單位每毫升，其中β葡萄糖苷酶和野生型C30相比提高了3.5倍，達(dá)到了8.8酶活單位每毫升。里氏木霉U5纖維素酶分泌活性的增加顯示出了它在可再生能源領(lǐng)域的潛在應(yīng)用價(jià)值，也為生物質(zhì)高效降解提供了一株新的微生物資源。CGMCC No. 1064920150416
【IPC分類】C12N1-15, C12R1-885, C12P19-14
【公開號(hào)】CN104862237
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510338523
【發(fā)明人】趙心清, 張飛, 白鳳武
【申請(qǐng)人】大連理工大學(xué)
【公開日】2015年8月26日
【申請(qǐng)日】2015年6月14日