m)抗性的DNA區(qū)段，即elm抗性盒。
[0030] 圖7顯示了對在大腸桿菌中生產(chǎn)的CPS1多糖的酸處理的敏感性。使用質(zhì)粒 pGVX767(含有完整的CPS1生物合成基因，r雙-y濟/)轉(zhuǎn)化大腸桿菌GVX3329的大腸桿菌蛋白 質(zhì)印跡分析。泳道1、3,蛋白酶K處理的兩個不同菌落的全細胞提取物；泳道2和4，TFA處理 的對應(yīng)的提取物；泳道5,蛋白質(zhì)標(biāo)志物。將樣品在12%Bis-TrisPAGE凝膠（invitrogen) 使用MES緩沖液在200V電泳35分鐘，并且隨后進行電印跡并且通過作為一級抗體的抗CPI 抗體（1:250)顯色。
[0031] 圖8顯示了在肺炎鏈球菌CPS1中轉(zhuǎn)運蛋白基因缺失的效果。莢膜多糖轉(zhuǎn)運蛋白 基因rze的缺失對在大腸桿菌中肺炎鏈球菌CPS1的生物合成上的效果。 使用質(zhì)粒PGVX808 (=pGVX767Ar媒-rze: : 泳道 2-5)和pGVX767 (完整的CPS1 簇， 泳道6)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌GVX3329的四個不同菌落的全細胞提取物（蛋白酶K消化的）的蛋 白質(zhì)印跡分析。將樣品在12%Bis-Tris凝膠（invitrogen)上使用MES以200V電泳35分 鐘，并且隨后在iBlot中印跡并且使用作為一級抗體的抗CP1抗體（1:250)顯色。
[0032] 圖9具有來自工程改造的大腸桿菌的肺炎鏈球菌CPS1型的N-糖基化EPA的 His-Trap純化步驟。具有來自工程改造的大腸桿菌的肺炎鏈球菌莢膜多糖組1的N-糖基 化EPA的His-Trap純化步驟。小圖A和小圖B分別顯示了來自通過抗His和抗CP1顯色 的EPA-CP1綴合物的純化步驟的蛋白質(zhì)樣品的蛋白質(zhì)印跡。使用4-12%Bis-TrisPAGE-凝 膠分析蛋白質(zhì)樣品。使用了由pGVX767、pGVX114和pGVX150轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株GVX3329 (=GVX2174 W3110AraaZAredr從漢^ : ( &類志賀鄰單胞菌 017AwbgW\:clmR)) 〇
[0033] 圖10CPS4亞基的示意圖。
[0034] 圖11CPS4遺傳構(gòu)成。CPS4遺傳構(gòu)成，r媒至兄是涉及莢膜多糖生物合成的基 因。
[0035] 圖12描述了肺炎鏈球菌CPS4多糖在大腸桿菌中的生產(chǎn)。經(jīng)蛋白酶K處理的來自 不同大腸桿菌菌株的全細胞提取物的蛋白質(zhì)印跡分析。泳道1，蛋白質(zhì)標(biāo)志物；泳道2-4， 使用PGVX803 (表達完整的CPS4簇)和pGVX238 (Z3206,表異構(gòu)酶)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌W3110 AraaZ;泳道5-7，使用pGVX803和pGVX207 (識你，表異構(gòu)酶）轉(zhuǎn)化的大腸桿菌W3110 AraaZ;泳道 8-10,使用pGVX753(部分CPS4 簇，無調(diào)芐基因和rci/)和pGVX238 轉(zhuǎn)化的大腸桿菌W3110AraaZ大腸桿菌。使用0. 1%的阿拉伯糖用于誘導(dǎo)。將0. 1 0D的 培養(yǎng)的生物量的等量物在12%Bis-Tris凝膠（invitrogen)上使用MES以200V電泳35分 鐘，并且隨后在iBlot中印跡并且通過作為一級抗體的抗CPS4抗體（1:100)顯色。
[0036] 圖13顯示了來自大腸桿菌SCM6中生產(chǎn)的肺炎鏈球菌CPS4的分析結(jié)果。大腸桿菌 中生產(chǎn)的肺炎鏈球菌CPS4的分析。從大腸桿菌SCM6提取LLO(SchwarzF,HuangW,Li C,SchulzBL,LizakC,PalumboA,NumaoS,NeriD,AebiM,WangLX:Acombined methodforproducinghomogeneousglycoproteinswitheukaryoticN-glycosylation. yVatOea?萬ioJ2010)，并且如先前（US2011/0274720Al)描述的使用2AB標(biāo)記。小圖A;將 2AB標(biāo)記的從使用pGVX803(表達來自pLAFR的完整的CPS4簇)和疾^5表異構(gòu)酶（pGVX207， pMLBAD骨架)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌SCM6提取的LL0 (虛線）相比于使用空載體pLAFR和pMLBAD 轉(zhuǎn)化的背景大腸桿菌菌株(實線）的色譜圖。小圖B，CPS4峰(在53. 9分鐘洗脫）的單一重 復(fù)單元MS/MS分析，（小圖A)。
[0037] 圖14顯示了在大腸桿菌SCM3中生產(chǎn)的肺炎鏈球菌CPS4的分析結(jié)果 (FaridmoayerA,FentabilMA,MillsDC,KlassenJS,FeldmanMF:Functional characterizationofbacterialoligosaccharyltransferasesinvolvedin0-linked proteinglycosylation.JOURNALOFBACTERIOLOGY2007，189(22) :8088-8098)。在大腸 桿菌中生產(chǎn)的肺炎鏈球菌CPS4的分析。從大腸桿菌SCM3 (S(i>874,AraaZ)中提取LLO并 且如描述的（US2011/0274720A1)使用2AB標(biāo)記。將2AB標(biāo)記的從使用pGVX771(pLAFR ，其含有啟動子、RBS、ZXSW?基因和CPS14簇的無調(diào)芐基因）轉(zhuǎn)化的大腸桿菌 SCM3中提取的LL0 (實線）相比與使用空載體pGVX725 (只含有啟動子和RBS的pLAFR)轉(zhuǎn) 化的背景大腸桿菌SCM3菌株(虛線）的HPLC色譜圖。與具有或不具有丙酮酸（Pyr)的單一 CPS4重復(fù)單元（RU)匹配的在50. 8、53. 6和56. 2分鐘洗脫的峰的MS分析。
[0038] 圖15描述了來自使用CPS4-LL0在體外N-糖基化的分析的結(jié)果。在體外使用 CPS4脂質(zhì)連接的寡糖的N-糖基化。LL0是從使用pGVX771 (在前文圖中描述）和pGVX725 (空載體）轉(zhuǎn)化的大腸桿菌SCM3 (SO874AraaZ)提取的。在體外的反應(yīng)通過將純化的空 腸彎曲桿菌PglB、熒光標(biāo)記的肽受體（Tamra-DANYTK)和LL0提取物在反應(yīng)緩沖液中混合過 夜完成。通過有機相分離將肽從反應(yīng)混合物中分離并且經(jīng)歷UPLC隨后進行MS分析。小圖 A和小圖B，在使用從含有pGVX725的SCM3 (陰性對照）和含有pGVX771的SCM3中提取的 LL0糖基化之后肽的UPLC色譜圖。小圖C和小圖D，對應(yīng)在肽上裝配的CPS4的一個或兩個 完整亞基的在15. 43和17. 62分鐘洗脫的糖肽的MS/MS分析。
[0039] 圖16具有肺炎鏈球菌CPS4的N-糖基化EPA的HisTrap純化步驟。從使用 PGVX539、pGVX114、pGVX207和pGVX803轉(zhuǎn)化并且在TB培養(yǎng)基中生長的經(jīng)工程改造的大腸 桿菌W3110AwaaL的具有肺炎鏈球菌CPS4的N-糖基化EPA的HisTrap純化步驟。小圖 A、B和C顯示了考馬斯亮藍染色和分別由抗His和抗CP4顯色的來自EPA-CPS4綴合物的 純化步驟的蛋白質(zhì)樣品的蛋白質(zhì)印跡。使用4-12%Bis-TrisSDS-凝膠分析蛋白質(zhì)樣品。 PGVX539是用于EPA載體蛋白表達的表達質(zhì)粒，其中EPA是脫毒的并且含有兩個N糖基化 共有序列。
[0040] 圖17顯示了通過CPS4-EPA糖綴合物的HPLCRP分析的PMP衍生化分析 (derivatization analysis)。通過在大腸桿菌中生產(chǎn)的CPS4-EPA糖綴合物的HPLCRP分 析的PMP衍生化分析。實線：從糖綴合物水解和分析獲得的跡線，虛線：從CPS4莢膜多糖同 樣制備的跡線。
[0041] 圖18描述了來自使用CPS4-EPA綴合物免疫的兔的血清的斑點印跡分析。來自 使用CPS4-EPA綴合物免疫的兔的血清的斑點印跡分析。將從肺炎鏈球菌組4分離的50ng CPS4莢膜多糖在各點進行印跡。將第二次注射后獲得的血清以1至100的稀釋度用于分析。 分別使用：泳道1，在該研究中使用的兔的免疫前血清合并物；泳道2-7,來自使用EPA-CPS4 注射的不同兔的血清；泳道8-9,分別使用含有氫氧化鋁和弗氏完全佐劑的緩沖液注射的 對照兔的血清；泳道10-11，使用Prevenar-13注射的陽性對照兔的血清；泳道12-13,以 1:100和1:200稀釋度作為一級抗體的來自Statens血清研究所的肺炎球菌抗血清4型。
[0042] 圖19描述了涉及CPS生物合成的基因的CPS14遺傳構(gòu)成。CPS14遺傳構(gòu)成，rM 至rci/是涉及莢膜多糖生物合成的基因。
[0043] 圖20CPS14亞基的示意圖。
[0044] 圖21在大腸桿菌中CPS14LL0的表達。將來自CPS14簇的至rci堪因克 隆至含有016 0抗原簇（r/K)16)啟動子的基因置換載體pDOC-C(pGVX615)中，并且轉(zhuǎn)化 至大腸桿菌GVX1128 (W3110AwaaL)。小圖A，將2AB標(biāo)記的從使用pGVX615r狀^ (生產(chǎn) 單一亞基的CPS14聚合酶突變體）轉(zhuǎn)化的大腸桿菌GVX1128提取的LL0 (實線）相比于從 背景菌株提取的LL0 (虛線）的色譜圖；插圖是由抗CPS14抗體作為一級抗體探測的被蛋白 酶K消化的使用pGVX615轉(zhuǎn)化的大腸桿菌GVX1128蛋白質(zhì)印跡。小圖B，在57分鐘洗脫的 CPS14單一亞基的MS/MS分析(在小圖A中通過箭頭指示)。
[0045] 圖22在使用CPS14簇將莢膜異多糖酸（CA)置換的大腸桿菌菌株中CPS14多糖 的表達。描述了由抗CPS14探測的來自不同整合的大腸桿菌菌株的經(jīng)蛋白酶K消化的細胞 的蛋白質(zhì)印跡。全部整合的菌株；GVX6126 (GVX1052CA::CPS14;泳道1和2)、GVX6129 (GVX1128CA::CPS14;泳道 3 和 4)和GVX6300 (GVX1716;泳道 5 和 6)顯示了 當(dāng)使用 PGVX688轉(zhuǎn)化，表達RcsA時對應(yīng)CPS14聚合酶生產(chǎn)的梯狀圖案。
[0046] 圖23描述了CPS14轉(zhuǎn)運蛋白基因?qū)υ诖竽c桿菌菌株GVX6126 (大腸桿菌W3110 CA::CPS14)中肺炎鏈球菌CPS14多糖的生產(chǎn)上的效果。顯示了經(jīng)蛋白酶K處理的來自不 同大腸桿菌細胞的全細胞提取物的蛋白質(zhì)印跡分析。泳道1，蛋白質(zhì)標(biāo)志物；泳道2,使用 PGVX688 (rcsA)和pGVX72 (空載體）轉(zhuǎn)化的大腸桿菌GVX6126 ;泳道3，使用pGVX688 (rcsA)和pGVX1497 (將CPS14wzg-wze克隆至pGVX72)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌GVX6126。將培 養(yǎng)的生物量的0. 4 0D的等量物在12%Bis-Tris凝膠（Invitrogen)上使用MES以200V電 泳35分鐘，并且隨后在iBlot中印跡并且由作為一級抗體的抗CPS4抗體（1:100)顯色。
[0047] 圖24描述了通過如在0079和0080部分描述的2-AB標(biāo)記以及MS/MS分析來分析 的從使用PGVXN688 (表達RcsA)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌GVX6129 (W3110AWaaLCA::CPS14)提取 的2AB標(biāo)記的LL0和糖脂的色譜圖。MS/MS分析鑒定了CPS14的2個和3個亞基(通過箭頭 指示，分別在95. 9分鐘和115. 3分鐘處洗脫)。
[0048] 5-發(fā)明詳述 肺炎鏈球菌的莢膜多糖是通過通常在肺炎鏈球菌細胞的CPS簇中編碼的一組酶的 協(xié)同，在載體脂質(zhì)上合成的（WhitfieldC,RobertsIS:Structure,assemblyand regulationofexpressionofcapsulesinEscherichiacoli.MolMicrobiol1999, 31 (5) : 1307-1319)。wzy依賴的CPS的合成從在膜的細胞質(zhì)一側(cè)將單糖磷酸添加至^^一異 戊稀磷酸（Und-P)開始。短寡糖通過不同的糖基轉(zhuǎn)移酶從活化的糖核苷酸連續(xù)的添加單糖 延長，并且連接脂質(zhì)的多糖通過翻轉(zhuǎn)酶翻轉(zhuǎn)穿過膜?？乖?重復(fù)單元（RU)通過由蛋白質(zhì)wzy 執(zhí)行的酶促反應(yīng)聚合。隨后將多糖轉(zhuǎn)移至最終的受體結(jié)構(gòu)。相信聚合和轉(zhuǎn)運至細胞表面是 由位于CPS簇5'端的一組3至4種酶控制的。
[0049] 在大多數(shù)情況中，糖基轉(zhuǎn)移酶、聚合酶wzy、翻轉(zhuǎn)酶wzx和單糖磷酸轉(zhuǎn)移酶是在 也xi?至簇中編碼，而核苷酸活化的單糖的生物合成途徑在一般的持家活性情況下 是在基因組的別處編碼，而當(dāng)單糖對CPS特異時其特定在CPS簇中編碼（Bent1eySD， AanensenDM,MavroidiA,SaundersD,RabbinowitschE,CollinsM,DonohoeK, HarrisD,MurphyL,QuailMA等人：Geneticanalysisofthecapsularbiosynthetic locusfromall90pneumococcalserotypes.PLoSgenetics2006, 2(3):e31)〇
[0050] 相信在CPS生物合成中的長度控制涉及用于調(diào)節(jié)的磷酸化事件的循環(huán)（Morona JK,MillerDC,MoronaR,PatonJC.Theeffectthatmutationsintheconserved capsularpolysaccharidebiosynthesisgeneshaveonvirulenceofStreptococcus pneumoniae.JInfectDis.2^\May15; 189 (10) : 1905-13.Epub2004Apr27.PubMed PMID: 15122528)。生產(chǎn)CPS的大多數(shù)生物合成途徑使用核苷酸二磷酸（NDP)活化的單糖作 為底物，即是UDP-Glc和UDP-GlcNAc。這些NDP糖通過持家基因在革蘭氏陰性和革蘭氏陽 性宿主中提供，并且因此可作為用于特定的糖的合成的起始材料得到。用于特定的NDP-糖 的合成或其他修飾的生物合成基因幾乎總是在CPS簇中編碼。
[0051] 0抗原合成和CPS合成在生物合成的最后步驟不同。0抗原通過連接酶WaaL添加 至脂質(zhì)A核心，并且進一步運輸至外膜，而CPS以莢膜結(jié)構(gòu)出現(xiàn)在細胞上。平均地，最終的 〇抗原糖長度比CPS的短得多。
[0052] 將肺炎鏈球菌CPS分類為組ICPS(由于導(dǎo)致其合成的特定生物化學(xué)途徑)。革蘭氏 陰性菌也含有組ICPS途徑，其由于存在負責(zé)外膜轉(zhuǎn)運的另外的膜轉(zhuǎn)運蛋白基因而與肺炎 球菌組I簇不同。例如，這些是莢膜異多糖酸（CA)生物合成機器基因簇wca，（StevensonG， AndrianopoulosK,HobbsM,ReevesPR:OrganizationoftheEscherichiacoliK-12 geneclusterresponsibleforproductionoftheextracellularpolysaccharide colanicacid. / 你cterioJ1996，178(16) :4885-4893)和K30CPS簇（WhitfieldC: BiosynthesisandassemblyofcapsularpolysaccharidesinEscherichiacoli.Annu RevBiochem2006, 75:39-68)〇
[0053] 然而，盡管一些革蘭氏陰性和陽性莢膜多糖簇在功能元件上相似這一事實，但是 從來沒有完整的肺炎球菌CPS簇在大腸桿菌中有功能地表達。普遍認為的是不同細胞被膜 結(jié)構(gòu)（envelopearchitecture)需要用于多糖生產(chǎn)的特定機器，其在當(dāng)必需穿過外膜時是 不同的。因此在本文中描述了肺炎球菌莢膜多糖的改進的生產(chǎn)方法，其使用i)在革蘭氏陰 性生物中的LPS和莢膜多糖途徑的方面和ii)在革蘭氏陰性宿主細胞中革蘭氏陽性莢膜生 物合成調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)運途徑的組合的方面。這樣的多糖在革蘭氏陰性宿主中通過LPS途徑機制 生產(chǎn)，這樣的多糖的結(jié)構(gòu)與LPS多糖相同。因此，在本發(fā)明的革蘭氏陰性系統(tǒng)中生產(chǎn)的這樣 的多糖可以表征為為了本申請目的的"修飾的莢膜多糖"或"LPS莢膜"。此外，該新合成的 表達系統(tǒng)和生物合成途徑(其將LPS與莢膜生物合成途徑組合)可以被表征為為了本申請目 的的"修飾的LPS生物合成途徑"。
[0054] 因此，另外的實施方案涉及通過使用修飾的LPS途徑的糖基化系統(tǒng)制造的肺炎鏈 球菌疫苗，其包括修飾的莢膜多糖或LPS-莢膜的生產(chǎn)。
[0055] 本發(fā)明的另一個特定的實施方案涉及為了肺炎球菌CPS的優(yōu)化表達而進行革蘭 氏陰性大腸桿菌宿主細胞基因組的優(yōu)化。大腸桿菌W3110編碼稱為伯原噬菌體基 因簇。Gtr酶GtrA、B和S編碼了通過向在周質(zhì)空間生長中的0抗原鏈添加分枝葡萄糖 殘基而修飾 〇 抗原的機器（LehaneAM,KorresH,VermaNK:Bacteriophage-encoded glucosyltransferaseGtrIIofShigellaflexneri:membranetopologyand identificationofcriticalresidues.TheBiochemicaljournal2005，389(Pt 1) : 137-143)。該途徑涉及在細胞膜的細胞質(zhì)一側(cè)的^^一異戊烯磷酸（Und-P，不是Und-PP) 連接的葡萄糖的產(chǎn)生，翻轉(zhuǎn)至外周胞質(zhì)，并且不斷的將Und-P-連接的葡萄糖轉(zhuǎn)移至生長中 的〇抗原多糖。
[0056] 在某些實施方案中，^基因被部分地或完全地功能失活或從革蘭氏陰性宿 主細胞缺失，例如在大腸桿菌宿主細胞中缺失。不受理論束縛，這樣的缺失引導(dǎo) 全部CPS生物合成活性至可進行糖基化的Und-PP途徑，并且因此增加了糖蛋白的生產(chǎn)。很 多肺炎球菌多糖使用葡萄糖作為起始單糖合成為重復(fù)單元（RU)聚合物。因此，當(dāng)?shù)鞍自?Und-P上裝配時，這樣的重復(fù)單元可以干它們的糖基化。
[0057] 另一個特定的實施方案是通過增加UDP-葡萄糖：十一異戊烯磷