亂沙門氏菌薩拉姆亞種（51 subsp.Salamae)、腸沙門氏菌亞利桑那亞種 (51 subsp.arizonae)、豬霍亂沙門氏菌雙亞利桑那亞種（51 subsp. Diarizonae)、豬霍亂沙門氏菌豪頓亞種（51 subsp.Houtenae)、邦戈沙門氏 菌（51 、和豬霍亂沙門氏菌印度亞種（51 subsp.Indica))、和0型 1-67、假單胞菌屬種（銅綠假單胞菌0血清型1-20)、克雷伯氏菌屬種（特別是肺炎克雷 伯氏菌（K. 血清型 01、02 (和血清亞型）、03、04、05、06、07、08、09、010、 011、012)、不動桿菌0抗原（特別是鮑氏不動桿菌（1如〃^3/?/^7)0抗原）、沙眼衣原體 抗原（血清型A、B、C、D、E、F、G、H、I了、1(、11、12、13)、霍亂弧 菌（K/AriocAWera)0抗原01至155、李斯特菌屬種，特別是單核細胞增生李斯特菌（Z. 1、2、3、4型和其血清亞型、嗜肺軍團菌（Ze^ione^a/we_9/?AiJa)血清型 1至15 0抗原、副百日咳博德特氏菌（ifo/Y/e^e^7ajOarajOerto^i^OO抗原、鼻疽伯克霍爾 德氏菌（及/r々AoJoferiaaza^ei)和類鼻疽伯克霍爾德氏菌（iferMoJoferia/wei/t/fmaUei) 0抗原、土拉弗朗西斯菌（/^raflciseWatoJare/^is)、彎曲桿菌屬種（空腸彎曲桿菌）； 艱難梭狀芽胞桿菌（(血清型A、G、H、K、Sl、S4、D、Cd-5、和產(chǎn)氣 莢膜梭菌（C/^r/rii^eas)血清型A、B、C、D和E)的莢膜多糖、金黃色葡萄球菌5和8 型、釀膿鏈球菌（StrejOtococciA?jOjrogefle^ )(組B鏈球菌莢膜血清型多糖）、大腸桿 菌、無乳鏈球菌（組A鏈球菌莢膜多糖）、腦膜炎奈瑟氏菌（Afeisseria ) (血清型A、B、C、W、Y、X)、白色念珠菌a辦icaas人流感嗜血桿菌、糞腸球菌莢 膜多糖類型I-V;和其他表面多糖結構，例如伯氏疏螺旋體（fer/Wia/wr&/or/kri)糖 脂）、腦膜炎奈瑟氏菌菌毛蛋白〇聚糖和脂低聚糖（LOS)、流感嗜血桿菌L0S、利什曼原蟲 (Leishmania)主要脂磷聚糖、腫瘤相關的碳水化合物抗原、瘧疾糖基磷脂酰肌醇或結核分 枝桿菌（mycobacteriumtuberculosis)阿拉伯甘露聚糖。
[0092] 在特定的實施方案中，在本文中提供的是通過前文段落中任一段的革蘭氏陰性菌 生產(chǎn)的重組糖蛋白。
[0093] 在特定的實施方案中，在本文中提供的是生產(chǎn)重組糖蛋白的方法，其包括在對生 產(chǎn)蛋白質適合的條件下培養(yǎng)前文段落中任一段的革蘭氏陰性菌。在特定的實施方案中，方 法進一步包括純化重組糖蛋白。
[0094] 在特定的實施方案中，在本文中提供的是包含類志賀鄰單胞菌0抗原基因簇的經(jīng) 工程改造的大腸桿菌，其中〇抗原基因簇的因是失活的，并且其中大腸桿菌細胞生 產(chǎn)Und-PP-D-FucNAc4N。
[0095] 在特定的實施方案中，在本文中提供的是包含索氏志賀氏菌或類志賀鄰單胞菌 017 0抗原基因簇的經(jīng)工程改造的大腸桿菌細胞，其中0抗原基因簇的感因是失活的， 并且其中大腸桿菌細胞生產(chǎn)Und-PP-D-FucNAc4N。
[0096] 6-實施例 實施例1 :在大腸桿菌中CPS1綴合物的合成： 本發(fā)明實施方案的目標是在大腸桿菌中生產(chǎn)CPS1型抗原多糖。如在上文討論的，本 發(fā)明人以新的方式利用大腸桿菌表達肺炎鏈球菌CPS簇的生物合成機器的能力。
[0097]在圖2中描述CPS簇DNA(由也^辟口 之間的DNA序列定義)，并且在圖3中 顯示1型肺炎鏈球菌的重復單元結構。重復單元以D_FucNAc4N開始，隨后是在a1-3糖 苷鍵中連接的兩個D-GalA殘基（-4-a-D-GalA-l, 3-a-D-GalA-l, 3-a-D-FucNAc4N-)。此 外，RU是非化學計量地 〇-乙?；模˙entleySD,AanensenDM,MavroidiA,Saunders D,RabbinowitschE,CollinsM,DonohoeK,HarrisD,MurphyL,QuailMA等人： Geneticanalysisofthecapsularbiosyntheticlocusfromall90pneumococcal serotypes.PLoSgenetics2006, 2(3) :e31)。DNA序列含有編碼用于以下的蛋白質的推 定的基因： i)轉運 / 調節(jié)（Wzg、Wzh、Wzd、Wze)， ii)如從同源性搜索中所推斷的，兩種最可能負責兩個GalA殘基（WchBD)的轉移的糖 基轉移酶 iii) 推定的乙酰轉移酶WchC， iv) 聚合酶wzy，其用于重復單元在細胞質膜的外部小葉（outerleaflet)上的聚合 v) 翻轉酶wzx，將單一重復單元從內部翻轉至細胞質膜的外部小葉 vi) 負責核苷酸活化的D-GalA的合成的兩種蛋白質，即Gla和Ugd。顯示了通過從持 家UDP-Glc的Gla和Ugd的UDP-D-GalA合成（MunozR，LopezR，deFrutosM，Garcia E:Firstmolecularcharacterizationofauridinediphosphategalacturonate 4-epimerase:anenzymerequiredforcapsularbiosynthesisinStreptococcus pneumoniaetype1.MolMicrobiol1999, 31 (2):703-713) vii) 已知制造TOP-L-鼠李糖的四種蛋白質RmlACBD。這些基因是隱藏的并且可能對 CPS生產(chǎn)是可有可無的。
[0098] 總之，這意味著用于制造1型CPS的全部所需基因在簇中編碼，除了 ： a) 編碼用于起始物糖UDP-D-FucNAc4N合成的蛋白質的生物合成基因； b) 編碼用于將磷酸-D-FucNAc4N添加至脂質載體Und-P的磷酸糖轉移酶 (phosphorsugartransferase)的基因。為了通過修飾的LPS生物合成途徑合成CPS1型， 需要以通過添加CPS1型簇可以使得肺炎球菌LPS莢膜合成的方式在大腸桿菌宿主菌株中 提供a)和b)。大腸桿菌菌株一般不編碼這樣的酶。引人注意地，已知只有少數(shù)微生物合成 FucNAc4N并且將其摻入多糖：肺炎鏈球菌CP1菌株、索氏志賀氏菌、類志賀鄰單胞菌017和 脆弱擬桿菌（你c 。
[0099] 因此本發(fā)明人推斷需要發(fā)現(xiàn)提供所述功能性的基因簇。本發(fā)明人通過使用用于 索氏志賀氏菌或類志賀鄰單胞菌017 0抗原合成的生物合成機器的基因元件實現(xiàn)這一 點。這兩種生物均使用同樣的結構合成〇抗原。該〇抗原是由通過二糖重復單元-4-a-L -AltNAcA-1，3-a-D-FucNAc4N-l-構成的直鏈聚合物構成的真正的革蘭氏陰性0抗原，（圖 4)(BattaG，LiptakA，SchneersonR，PozsgayV:Conformationalstabilization ofthealtruronicacidresidueinthe〇-specificpolysaccharideofShigella sonnei/Plesiomonasshigelloides.CarbohydrRes 起抱H 顯亦為D_FucNAc4N(Kubler-KielbJ，VinogradovE，Ben-MenachemG，PozsgayV，RobbinsJB，SchneersonR:Saccharide/proteinconjugatevaccinesforBordetella species:preparationofsaccharide,developmentofnewconjugationprocedures, andphysico-chemicalandimmunologicalcharacterizationoftheconjugates. 治2008，26(29-30):3587-3593X生物合成所需的基因簇（圖5)在類志賀鄰單胞 菌的基因組中和索氏志賀氏菌毒力質粒上編碼（KopeckoDJ，Washington0，F(xiàn)ormalSB: GeneticandphysicalevidenceforplasmidcontrolofShigellasonneiformI cellsurfaceantigen. 蕭1980，29(1) :207_214)?；蚬δ芡?過同源性分析推定已知（XuDQ，CisarJ0，AmbulosJrN，Jr.，BurrDH，KopeckoDJ:MolecularcloningandcharacterizationofgenesforShigellasonneiformI0 polysaccharide:proposedbiosyntheticpathwayandstableexpressioninalive salmonellavaccinevector.InfectImmun2002，70 (8):4414_4423)〇
[0100] 因此，在大腸桿菌中裝配用于CPS1型生產(chǎn)的生物合成機器的策略如下： 首先，本發(fā)明人以重組Und-PP-D-FUcNAc4N生產(chǎn)途徑為目標。為了實現(xiàn)該目標，本發(fā)明 人在大腸桿菌中重組表達了類志賀鄰單胞菌〇抗原。
[0101] 第二，本發(fā)明人從類志賀鄰單胞菌017簇缺失了L-AltNAcA糖基轉移酶，導致了 Und-PP-D-FucNAc4N截短的脂質前體。
[0102] 第三，本發(fā)明人將CPS1型簇添加在質粒上。相信在該質粒中編碼的酶延伸通過 類志賀鄰單胞菌系統(tǒng)制造的Und-PP-D-FucNAc4N前體以完成CPS1型RU并且聚合RU以制 造修飾的LPS。
[0103] 技術上，這如下完成： 在第一個步驟中，本發(fā)明人將類志賀鄰單胞菌〇抗原基因簇（r/A類志賀鄰單胞菌017 ) 克隆至供體質粒pDOC-C中（LeeDJ,BingleLE,HeurlierK,PallenMJ,PennCW， BusbySJ,HobmanJL:Genedoctoring:amethodforrecombineeringinlaboratory andpathogenicEscherichiacolistrains.BMCMicrobiol2009, 9:252)。通過使用 該供體質粒和編碼重組酶和核酸內切酶的輔助質粒（KuhlmanTE,CoxEC:Site-specific chromosomalintegrationoflargesyntheticconstructs.Nucleicacidsresearch 2010, 38(6):e92)，本發(fā)明人通過同源重組將W3110ArecAr從ECAAraaZ大腸桿菌菌株 的簇交換為來自質粒的類志賀鄰單胞菌簇（r〃至r/wZ，圖5)。參見，例如，國際申請?zhí)?PCT/EP2013/071328,其通過引用以其整體并入本文。產(chǎn)生的染色體整合的菌株制造重組0 抗原，其在蛋白質印跡中對抗索氏志賀氏菌分型血清是反應性的。
[0104] 根據(jù)Datsenko和Wanner的方法，通過同源重組將在該整合的類志賀鄰單胞菌簇 中編碼的因從染色體缺失（DatsenkoKA,WannerBL:One-stepinactivationof chromosomalgenesinEscherichiacoliK-12usingPCRproducts.ProcNatlAcad USA2000，97(12) :6640-6645)。產(chǎn)生的菌株不再生產(chǎn)任何抗索氏志賀氏菌特異的 連接脂質的多糖，最可能是由于菌株制造完整的二糖重復單元的無能性。
[0105] 接下來，將從r頌至收〇的CPS1簇（圖2)克隆至大腸桿菌中有活性的人工啟動子 (J23103,http://partsregistry.org/Part:BBa_J23103)和優(yōu)化核糖體結合位點之后。 [0106] 在用于脂質連接的寡糖生物合成分析的搖瓶培養(yǎng)物中的描述的遺傳系統(tǒng)的表達 在使用抗CPS1型特異抗血清的蛋白質印跡中產(chǎn)生了梯狀帶型圖案（圖6)。這顯示修飾的LPS生物合成途徑在1型肺炎鏈球菌的CPS的重組表達中協(xié)作。
[0107] 為了進一步提供生產(chǎn)的反應性蛋白酶抗性物質確實是連接至十一異戊烯焦磷酸 的CPS1型的證據(jù)；對來自圖6的樣品實施酸敏感性測試。通過TFA的溫和酸處理消除 了抗CPS1型信號，指示連接多糖和十一異戊烯的焦磷酸鍵的存在（圖7)。本發(fā)明人發(fā) 現(xiàn)可能在轉運蛋白基因mg-mo的存在下制造修飾的0抗原。為了檢查這些基因是否具 有直接的效果，本發(fā)明人通過同源重組從CPS1型質粒缺失了四個轉運蛋白基因（Bloor AE,CranenburghRM:Anefficientmethodofselectablemarkergeneexcisionby Xerrecombinationforgenereplacementinbacterialchromosomes.Appliedand environmentalmicrobiology2006, 72 (4): 2520-2525)。修飾的質粒的共表達令人驚訝 地導致了抗CPS1型信號的失去（圖8)。這表明轉運蛋白基因對修飾的0抗原的有效生產(chǎn) 是必需的。
[0108] 為顯示重組CPS1型可以用于蛋白質的糖基化并且因此形成蛋白質-碳水化合 物綴合物，本發(fā)明人對在合適的重組大腸桿菌菌株中綴合物生產(chǎn)的能力測試了細菌蛋白 質糖基化機器（WackerM,LintonD,HitchenPG,Nita-LazarM,HaslamSM,North SJ,PanicoM,MorrisHR,DellA,WrenBff等人：N-linkedglycosylationin CampylobacterjejunianditsfunctionaltransferintoE.coli.Science2002, 298(5599):1790-1793)。
[0109] 使用在（FeldmanMF,WackerM,HernandezM,HitchenPG,MaroldaCL, KowarikM,MorrisHR,DellA,ValvanoMA,AebiM:EngineeringN-linked proteinglycosylationwithdiverse0antigenlipopolysaccharidestructuresin Escherichiacoli.ProcNatlAcadSciUSA2005, 102(8) :3016-3021;Kowarik M,YoungNM,NumaoS,SchulzBL,HugI，CallewaertN,MillsDC,WatsonDC,HernandezM,KellyJF等人：DefinitionofthebacterialN-glycosylationsite consensussequence.TheEMB0journal2006, 25 (9):1957-1966;ffackerM,Linton D,HitchenPG,Nita-LazarM,HasiamSM,NorthSJ,PanicoM,MorrisHR,DellA, WrenBW等人：N-linkedglycosylationinCampylobacterjejunianditsfunctional transferintoE.coli.Science2002, 298(5599):1790-1793;IhssenJ,Kowarik M,DilettosoS,TannerC,ffackerM,Thony-MeyerL:Productionofglycoprotein vaccinesinEscherichiacoli.Microbialcellfactories2010, 9:61.)中記錄的 N-糖基化系統(tǒng)進行實驗。使用兩種可誘導質粒轉化表達CPS1型脂質連接的寡糖的重組大 腸桿菌。一種質粒編碼PglB酶，其重復地顯示使受體蛋白質通常地N糖基化(所述蛋白編 碼-D/E-x-N-x-S/T-類型的共有氨基酸序列，其中x不能是脯氨酸)。在第二種質粒上，編 碼載體蛋白EPA，其含有兩種插入的N糖基化共有序列和用于Ni親和色譜純化的His-標 簽。在糖基化實驗后，將EPA蛋白純化并且使用抗his標簽抗血清（圖9,小圖A)和抗CPS 1型抗血清（圖9,小圖B)探測并且清楚地在洗脫級分中檢測到。這證明PglB系統(tǒng)連同重 組CPS1型表達系統(tǒng)允許蛋白質綴合物的有效生產(chǎn)，所述蛋白質綴合物可以作為抗肺炎球 菌疫苗候選使用。
[0110] 實施例2 :在大腸桿菌中CPS4綴合物的合成 為進一步顯示蛋白質糖基化可以用于生產(chǎn)活性綴合疫苗，本發(fā)明人以在關于CPS1的 轉運蛋白基因的存在下生產(chǎn)CPS4型綴合物為目標。
[0111]CPS4在還原端具有含GalNAc的重復單元結構（圖10)。完整結構為： -1, 4-(2, 3Spyr)-a-D-Gal-1, 3-a-D-ManNAc-l, 3-a-L-FucNAc-l, 3-a-D-GalNAc不像CPS1的基因簇，編碼來自肺炎鏈球菌CPS4型的簇編碼合成CPS4的全部所 需酶（圖 11)。通過蛋白質MnaA、FnlA、B和C制造UDP-D-FucNAc和UDP-D-ManNAc。不 同糖基轉移酶的功能根據(jù)它們對其他具有已知特異性的糖基轉移酶的同源性進行預測。 Weil是預測的糖基化-磷酸轉移酶并且因此負責Und-PP-D-GalNAc合成，WciJ、K和L是 D-ManNAc、L-FucNAc和D-Gal轉移酶，并且WciM是丙酮酸轉移酶的同源物（JiangSM， WangL,ReevesPR:Molecular