用于制備和分析核酸的裝置的制造方法
【專利說明】
[0001] 政府權(quán)益聲明
[0002] 本文所述的工作由美國陸軍醫(yī)學(xué)研究購置活動化S.ArmyMedicalResearch AcquisitionActivity)撥款提供部分資金，合同號為W81XWH-10-2-0158。美國政府對本 發(fā)明享有一定的權(quán)利。
[000引背景
技術(shù)領(lǐng)域
[0004] 本發(fā)明一般地設(shè)及用于處理樣品的微流體裝置和方法，所述樣品用于分子診斷應(yīng) 用，例如祀核酸序列的檢測。
[0005] 相關(guān)技術(shù)描述
[0006] 分子診斷在當(dāng)今全球醫(yī)療環(huán)境中具有重要的作用。在發(fā)展中國家，95%的死亡 是由于缺乏對傳染病，即急性呼吸道感染（ARIs)、追疾、HIV、和肺結(jié)核（TB)的正確診斷 W及相關(guān)的后續(xù)治療（Yager，Petal，AnnuRevBiomedEng10:107-144,2008)。最 近的大流行病如2009H1N1甲型流感流行增加了對于有效檢測和控制傳染病的工具的需 要。在控制新型傳染病的挑戰(zhàn)中加入了如"快速病原體突變速度、非人病原體向人病原 體的轉(zhuǎn)變、和非人病原體與人病原體的重組"的因素化iechle，F(xiàn)Letal.，ClinL油Med 29 (3) : 555-560, 2009)。日益增加的全球流動性幫助傳染病從發(fā)源地區(qū)傳播到世界的其它 地方，正如在2009化N1的大流行中所看到的。運(yùn)種流動性彰顯了將快速、便攜式診斷（護(hù) 理點(diǎn)[P0C])裝置作為預(yù)防傳染病全球傳播的初步手段的一部分的需要。目前的實(shí)驗(yàn)室病 原體培養(yǎng)方法需要一天或更長時間來提供結(jié)果。
[0007] 對于特定的其他類型的傳染病，在發(fā)達(dá)國家和發(fā)展中國家中，需要定期地重復(fù)進(jìn) 行診斷性測試，W測量對治療的反應(yīng)，并監(jiān)測疾病狀況。一個運(yùn)樣的例子是對于傳染病如 HIV(人免疫缺陷病毒）和丙型肝炎，監(jiān)測病毒載量（每毫升血液中病毒顆粒的數(shù)量）。南 撒哈拉非洲是AIDS流行嚴(yán)重感染地區(qū)。在運(yùn)些地區(qū)，缺乏標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室設(shè)施和受過訓(xùn)練的實(shí) 驗(yàn)室技術(shù)人員是嚴(yán)重的障礙。在美國的醫(yī)療條件差的地區(qū)存在類似的問題。能夠在人群中 分發(fā)使其易于獲得，甚至是可W在家中獲得的快速、低成本的診斷工具將會允許更快速地 診斷和監(jiān)測疾病和感染，從而提供實(shí)質(zhì)性的益處。
[0008] 核酸生物標(biāo)志物是目標(biāo)分析物，它用于幾種對全球衛(wèi)生有高度重要性的傳染性疾 病，包括HIV、HCV、皿V、流行性感冒、和登革熱。在開發(fā)簡單診斷裝置W測試多種病毒劑上 的主要挑戰(zhàn)是：一些病毒的基因組由DNA組成，而其他病毒的基因組由RNA組成?；赗NA 的分析物的進(jìn)一步的挑戰(zhàn)是樣品處理，所述樣品處理要保護(hù)運(yùn)些不穩(wěn)定分子的完整性。有 幾種市售產(chǎn)品對后者的問題提出了解決方案。運(yùn)些產(chǎn)品大部分是昂貴的、技術(shù)難度大的、和 /或需要某種形式的冷藏。運(yùn)些要求不容易被小型化的微流體裝置滿足，所述微流體裝置具 有盒上試劑庫（on-cartridgereagentreservoirs),所述盒上試劑庫被設(shè)計(jì)用于快速、原 地的診斷性分析。而且，運(yùn)些要求在資源匿乏或遠(yuǎn)程的情況下難W滿足，正如大多數(shù)發(fā)展中 國家的情況。因此，需要有低成本的、無測量的（non-instrumented)、和操作簡單的診斷裝 置，可用于制備核酸的穩(wěn)定樣品，并在護(hù)理點(diǎn)（POC)分析DM和RNA兩種生物標(biāo)志物。
[0009] 血液是人體組織，常規(guī)用于核酸表達(dá)研究和基于血液的生物標(biāo)志物分析，因?yàn)樗?可W容易地收集。但是，全血通常含有許多成分，例如血紅素和肝素，它們干擾和/或抑制 許多下游的分析步驟。而且，血漿的核酸酶（RNase)活性非常高，將運(yùn)種活性減至最小對 于任何RNA分離程序來說都是重要的。雖然可在嚴(yán)格的條件下從臨床樣品制備DNA，并且， 例如，簡單地將DNA點(diǎn)樣在濾紙上并在室溫干燥來使其穩(wěn)定，RNA的制備通常需要使用穩(wěn)定 劑和冷藏和/或冷凍。穩(wěn)定臨床樣品的RNA的步驟是繁瑣的，不適用于微流體、"采樣反饋 (sampletoanswer)"診斷裝置。
[0010] 兩種方法的變形形式曾被用于制備來自生物樣品的RNA:化學(xué)提取和固定在玻璃 上，通常被稱為"固相提取"?；瘜W(xué)提取通常使用高度濃縮的離液鹽和酸性酪或酪-氯仿溶 液來使RNases失活，并從其它生物分子中純化RNA。運(yùn)些方法提供了RNA的非常純的制備 物；但是，通常必須用醇沉淀步驟對RNA進(jìn)行脫鹽和濃縮。固相提取方法，在Boometal的 美國專利No. 5, 234, 809中描述，依賴于離液試劑硫氯酸脈的裂解和核酸酶失活特性，W及 運(yùn)種試劑存在時的固態(tài)二氧化娃顆?；蛲拊孱惖暮怂峤Y(jié)合性質(zhì)。用含有乙醇的高鹽緩沖液 洗涂與二氧化娃結(jié)合的RNA之后，在低離子強(qiáng)度的緩沖液中洗脫RNA。
[0011] 容易理解，需要使用有機(jī)溶劑或離液試劑進(jìn)行水相提取的樣品制備方法是冗長 的、危險的、勞動強(qiáng)度大的、和速度慢的。而且，如果在進(jìn)行運(yùn)些程序的時候沒有特別小屯、， 可能發(fā)生核酸酶的殘余污染，樣本核酸會被降解或消失。用運(yùn)種樣品進(jìn)行的診斷測試可能 由于運(yùn)種降解而給出假陰性結(jié)果。假陰性結(jié)果還可W由于化學(xué)干擾造成，例如來自于殘留 的陰離子去垢劑、離液鹽、或樣品中殘余的并且會抑制祀序列擴(kuò)增程序的乙醇。如果已經(jīng)使 用了陰離子去垢劑和蛋白酶，殘余的蛋白水解活性也可能降解祀序列擴(kuò)增和/或雜交檢測 反應(yīng)中使用的酶，并產(chǎn)生假陰性結(jié)果。在'809專利中公開的基于"爆轟裂解度oomlysis)" 方案的樣品制備方法通常被認(rèn)為是充分應(yīng)對了運(yùn)些問題。但是，本發(fā)明人出人意料地發(fā)現(xiàn)， 運(yùn)些提取方法，即使用離液鹽結(jié)合固相提取，在制備用于皿V基因組的WPCR為基礎(chǔ)的檢測 的血液或血漿樣品時，并不總是有效的。因此，上述的方案均不適于從復(fù)雜生物起始材料， 例如全血或血清中制備用于同時檢測DNA和RNA祀序列的通用樣品。運(yùn)對于在臨床實(shí)驗(yàn)室 條件下和在資源缺乏地區(qū)的傳染病診斷來說的是千真萬確的，在臨床實(shí)驗(yàn)室條件下對時間 的要求非常高，在資源缺乏地區(qū)，成本效益、減少有毒廢物流和簡易性也很重要。
[0012] 雖然在該領(lǐng)域取得了進(jìn)展，在護(hù)理點(diǎn)診斷裝置領(lǐng)域仍然存在需要，例如微流體裝 置，其能夠從測試樣品分離和分析核酸。本發(fā)明滿足了運(yùn)些需要并進(jìn)一步提供了相關(guān)的益 處。
[001引發(fā)明簡述
[0014] 本發(fā)明的實(shí)施方案針對上述的全球健康需要，提供微流體裝置，所述微流體裝置 用于對來自測試樣品，例如血液產(chǎn)品的核酸進(jìn)行制備、穩(wěn)定、和分子分析。本發(fā)明人令人驚 訝地發(fā)現(xiàn)一種簡單的樣品制備方案產(chǎn)生含有DNA和/或RNA的樣品，所述樣品適合作為擴(kuò) 增反應(yīng)中的即用試劑，所述簡單的樣品制備方案的基礎(chǔ)是用粘±礦物和堿性緩沖液進(jìn)行處 理。不受理論的束縛，相信粘±礦物的作用是保護(hù)核酸不被酶降解（由于核酸酶活性）并 且不被水解降解（由于堿性提取試劑）。本發(fā)明裝置制備的核酸樣品基本不含核酸酶活性， 并且在用于修飾酶的時候是優(yōu)選的底物。本發(fā)明的微流體裝置的實(shí)施方案在同時檢測人血 液的微量樣品或其它測試樣品的RNA和DM祀序列時特別具有益處。
[0015] 在相關(guān)的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供改進(jìn)的集成微流體裝置，用于將核酸樣品制備 與下游的分子分析集成化。該裝置的實(shí)施方案尤其適用于同時分析通用測試樣品中的DNA 和RNA。在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明裝置的特征在于用于制備核酸的試劑被預(yù)先裝載到該 裝置中，所述核酸適合于立即擴(kuò)增。運(yùn)些試劑包括，但不限于，粘±礦物和堿性緩沖液。
[0016] 因此，本發(fā)明的實(shí)施方案提供用于制備和分析測試樣品中的核酸的微流體裝置， 其包括具有第一端部和第二端部的微流體通道；與微流體通道的第一端部流體連接的樣品 進(jìn)口；與所述微流體通道流體連接的粘±處理室，其中所述黏±處理室含有粘±礦物試劑； 與所述粘±處理室流體連接的樣品裂解室，其中所述樣品裂解室含有堿性溶液；一個或多 個樣品核酸擴(kuò)增和檢測孔，其與所述樣品裂解室流體連接；和一個或多個樣品出口。在另 一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于制備和分析測試樣品中的核酸的微流體裝置，其中粘± 礦物選自高嶺石、蒙脫石、或伊利石的組。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的粘±礦物是滑石、 埃洛石化allosite)、膨潤±、合成粘±礦物、或裡皂石中的一種。在另一個實(shí)施方案中，本 發(fā)明提供用于制備和分析測試樣品中的核酸的微流體裝置，其中堿性溶液是K0H、化0H、或 LiOH。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于制備和分析測試樣品中的核酸的微流體裝置， 其進(jìn)一步包括在裂解室下游的中和室，其中含有酸性試劑。在其它的實(shí)施方案中，酸性溶液 是肥IX2H4O2、或H2SO4。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于制備和分析測試樣品中的核 酸的微流體裝置，其中測試樣品包含一種或多種感染原。在另一個實(shí)施方案中，感染原是病 毒原。在另一個實(shí)施方案中，感染原是至少兩種病毒原。在另一個實(shí)施方案中，感染原是DNA 病毒和RNA病毒。在另一個實(shí)施方案中，感染源是皿V和HCV或HIV。在另一個實(shí)施方案 中，本發(fā)明提供用于制備和分析測試樣品中的核酸的微流體裝置，其中測試樣品包括血液、 血漿、血清、尿液、唾液、疲液、呼吸系統(tǒng)灌洗液、淚液、或組織拭子。在另一個實(shí)施方案中，本 發(fā)明提供用于制備和分析測試樣品中的核酸的微流體裝置，其中該裝置進(jìn)一步包括載置累 (on-devicepump),其與微流體通道的第二端部流體連接。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明 提供用于制備和分析測試樣品中的核酸的微流體裝置，其中該裝置進(jìn)一步包括設(shè)置在樣品 進(jìn)口和微流體通道的第一端部之間的復(fù)合膜，其中所述復(fù)合膜能夠從血液中除去選定的顆 粒。在其它實(shí)施方案中，復(fù)合膜可W由激發(fā)血液凝固的材料組成。在另一個實(shí)施方案中，復(fù) 合膜可W由玻璃濾膜組成。
[0017] 還提供了使用微流體裝置制備和分析含核酸樣品的方法。例如，在一個實(shí)施方案 中，該方法包括：
[0018] a)將懷疑含有目標(biāo)核酸的樣品引入所公開的微流體裝置的任何一個中；
[0019] b)使樣品與所述微流體裝置中的粘±礦物接觸；W及
[0020] C)在所述微流體裝置中裂解所述樣品。
[0021] 在一些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括在所述微流體裝置中擴(kuò)增裂解的樣品，W 獲得擴(kuò)增的樣品，并可選地檢測擴(kuò)增樣品中的目標(biāo)核酸。
[0022] 還提供了微流體裝置在分離目標(biāo)核酸中的應(yīng)用。在一些實(shí)施方案中，該應(yīng)用進(jìn)一 步包括擴(kuò)增目標(biāo)核酸和可選地檢測目標(biāo)核酸。
[0023] 附圖簡述
[0024] 圖1是示意圖，顯示根據(jù)本發(fā)明的一些方面的微流體裝置的第一實(shí)施方案。
[00巧]圖2是示意圖，顯示根據(jù)本發(fā)明的一些方面的微流體裝置的第二實(shí)施方案。
[0026] 圖3是示意圖，顯示根據(jù)本發(fā)明的一些方面的微流體裝置的第=實(shí)施方案的操 作。
[0027] 圖4是示意圖，顯示根據(jù)本發(fā)明的一些方面的微流體裝置的第四實(shí)施方案的操 作。
[0028] 圖5A-B是剖視圖，顯示根據(jù)本發(fā)明的一些方面的復(fù)合膜的第一和第二實(shí)施方案 的操作。
[0029]圖6是可W在本發(fā)明的裝置中進(jìn)行的過程的實(shí)例的逐步說明。
[0030] 發(fā)明詳述
[0031] 本發(fā)明人令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，粘±礦物和堿性緩沖液的組合可用于從復(fù)雜生物測試 樣品制備核酸，W用于分子分析程序，例如PCR。有利的是，運(yùn)些試劑可W用于制備一個測試 樣品，用于同時檢測DNA和RNA祀分子，而無需進(jìn)一步純化或分離核酸，運(yùn)相對于現(xiàn)有技術(shù) 水平是巨大的提高。不受理論的束縛，相信粘±礦物提供幾種有益效果，包括，但不限于，保 護(hù)核酸在堿性條件下不被水解；保護(hù)核酸不發(fā)生核酸酶介導(dǎo)的降解；保護(hù)下游測定試劑， 例如DNA聚合酶不受測試樣品中存在的抑制劑和其它污染物影響；W及一般性緩沖性質(zhì)。
[0032] 本發(fā)明設(shè)及微流體裝置，它包含內(nèi)置的粘±礦物和堿性緩沖試劑，用于制備和分 析核酸樣品。在一些實(shí)施方案中，該裝置進(jìn)一步包含多個微流體通道、進(jìn)口、閥、膜、累、和 其它部件，它們W各種配置方式布置，控制流體樣品的流動，W從樣品提取核酸，并進(jìn)行可 選的后續(xù)分子分析。本發(fā)明的裝置可W進(jìn)一步包括復(fù)合膜，用于從全血樣品分離血清樣品。 在下面的描述中，說明了本發(fā)明裝置和方法的特定實(shí)施方案，但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理 解，下述的不同的實(shí)施方案和要素可W組合或改變，而不背離本發(fā)明的精神和范圍。
[0033] 1.定全
[0034] 測試樣品：測試樣品包括生物樣品化iologicalsamples)或"生物樣 化i0samp1eS)"，其可W是臨床樣本?？蒞測試的代表性的生物樣品包括，例如：血液、血清、 血漿、血沉棟黃層、唾液、傷口滲出液、脈液、肺和其它呼吸系統(tǒng)吸出物、鼻吸出物和洗涂物、 竇引流物、支氣管灌洗液、疲液、中耳和內(nèi)耳吸出物、囊腫吸出物、腦脊液、糞便、腹瀉液、尿 液、淚液、乳房分泌物、卵巢內(nèi)容物、腹水液、粘液、胃液、胃腸道內(nèi)容物、尿道分泌物、滑液、 腹膜液、胎便、陰道分泌物或溢液、羊水、精液、陰莖溢液、等等。對于代表粘膜分泌物和上皮 細(xì)胞的拭子或灌洗液的測定是可接受的，例如咽喉、扁桃體、牙銀、鼻腔通道、陰道、尿道、直 腸、下部結(jié)腸、和眼部的粘膜拭子，W及各種組織樣本的勻漿物、溶解產(chǎn)物和消化產(chǎn)物。哺乳 動物細(xì)胞是可接受的樣品。除了生理性流體或生物流體之外，水樣、工業(yè)廢水、食品、乳類、 空氣過濾液等等也是測試樣本。在一些實(shí)施方案中，測試樣品直接被放置在所述裝置中；在 其它實(shí)施方案中，預(yù)分析過程在設(shè)想之內(nèi)。
[0035] 生物檢測祀分子：或"目標(biāo)核酸"、或"祀分子"，包括一種或多種核酸。祀核酸包括 基因、基因部分、基因的調(diào)控序列、mRNA、rRNA、tRNA、siRNA、cDNA，并且可W是單鏈的、雙鏈 的或=鏈的。一些核酸祀具有多態(tài)性、缺失和可變剪接序列。
[0036] 粘±礦物：或"粘±"指含水侶娃酸鹽或含水儀娃酸鹽（包括頁娃酸鹽），其具有 層（薄片狀）結(jié)構(gòu)和非常小的顆粒尺寸（通常小于2微米）。粘±礦物可化含有顯著量的 鐵、堿金屬、或堿±金屬。粘±礦物構(gòu)成天然存在的粘±和粘±巖的主要礦物儲備，并且可 w由運(yùn)些地質(zhì)沉積物來生產(chǎn)。粘上礦物還可w來自于其他天然來源，例如粉砂巖、黏板巖、 一些砂子和砂巖。粘上礦物還可W通過合成產(chǎn)生。
[0037] 頁娃酸鹽（phyllosilicate):包括許多被稱為層狀娃酸鹽（sheetsilicates)的 礦物，其形成娃酸鹽四面體的平行層，成分是Si2〇e或娃與氧的比例為2: 5。頁娃酸鹽包括下 述族：葉蛇紋石和纖維蛇紋石的蛇紋石族、魚眼石族、葡萄石族、和粘±礦物族，如下所述。 運(yùn)些頁娃酸鹽中的任一種（包括已知為滑石的礦物）適用于本發(fā)明。
[0038] 病原體：與感染或感染性疾病相關(guān)的生物體。
[0039] 病況：哺乳動物宿主的狀況，其特征在于缺少健康，即疾病、虛弱、發(fā)病、或者與潛 在的發(fā)病相關(guān)的遺傳特征。
[0040] 不同的實(shí)施方案包括能夠分析測試樣品的微流體裝置，所述樣品包含一種或多種 祀感染原。示例性的祀感染原包括微生物和/或病毒，所述病毒具有基于DNA的基因組或 基于RNA的基因組。在一些實(shí)施方案中，適合的病毒包括，但不限于，乙型肝炎病毒（皿V)、 丙型肝炎病毒（HCV)、人免疫缺陷病毒化IV)I和II、甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道 合胞病毒巧SV)A和B、人偏肺病毒（MPV)