聚乙二醇與腫瘤壞死因子α或其類似物的偶聯(lián)物及其醫(yī)藥用圖【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明設(shè)及聚乙二醇-腫瘤壞死因子aaNFa)或聚乙二醇-腫瘤壞死因子a類似物的偶聯(lián)物，及其制備方法，W及其作為治療藥物在預(yù)防或治療腫瘤或癌癥中的用途。【
背景技術(shù)：
】[0002]腫瘤壞死因子a(TNFa)是一個能夠引發(fā)惡性腫瘤細(xì)胞調(diào)亡的多功能細(xì)胞因子蛋白。TNFa由活化的單核巨隧細(xì)胞分泌，是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的抗腫瘤活性最強(qiáng)的細(xì)胞因子，其對多種惡性腫瘤細(xì)胞具有明顯的殺滅細(xì)胞（tumoricidal)和腫瘤細(xì)胞抑制(tumoristatic)作用（Carswell,EA等人，1975,Anendotoxininducedserumfactorthatcausesnecrosisoftumors.Proc.Natl.Acad.Sci.USA72;3666-3670)。[0003]TNFa在1970年代末期由美國科學(xué)家所發(fā)現(xiàn)，TNFa可通過與一個高分子量受體(TNFRl)及一個較低分子量的受體（TNFR2)結(jié)合，來傳導(dǎo)所有的細(xì)胞生理學(xué)，個體生理學(xué)，病理學(xué)，W及殺滅惡性腫瘤細(xì)胞的藥理學(xué)作用（An化ewsJS等人，1990.Characterizationofthereceptorsfortumornecrosisfactor(TNF)andlymphotoxin(LT)onhumanlymphocytes.J.Immunol.144；2582-2591.DembicZ等人,1990.TwohumanTNFreceptorshavesimilarextracellular,butdistinctintracellular,domainsequences.切tokine2:231-237)。已經(jīng)發(fā)表的臨床治療早期黑色素癌癥和治療軟組織惡性肉瘤的藥效實驗數(shù)據(jù)顯示：TNFa在人體內(nèi)循環(huán)時間太短，并且血液循環(huán)系統(tǒng)器官毒性過高，因此它用于惡性黑色素瘤、軟組織肉瘤的非腸道注射形式的臨床療效不佳度artlettDL等人，Aphase!trialofcontinuoushyperthermicperitonealperfusionwithtumornecrosisfactorandCispl曰tininthetreatmentofperitonealc曰rcinom曰tosis,Cancer,83:1251-1261.)。但是在一種人體局部治療惡性腫瘤的臨床試驗?zāi)Ｐ椭校粗w離體灌注模型（isolatedperfusedlimbmodel)中，TNFa可W從患者單一肢體的局部動脈灌注，肢體上的黑色素瘤或肉瘤病灶可在較長時間暴露于局部動脈注射的TNFa藥物，然后肢體中的TNFa可W從另一端的回流靜脈血管被導(dǎo)入到一個累容器里。運(yùn)種肢體離體灌注模型在運(yùn)用于避免TNFa回流至全身循環(huán)系統(tǒng)而產(chǎn)生全身器官毒性的情況下，顯示了優(yōu)越的殺滅惡性腫瘤細(xì)胞的臨床治療效果煙iristoforidis,D等人，Isolatedlimbperfusion:distincttourniquetandtumornecrosisfactoreffectsontheearlyhemodynamicresponse.2003.ArchSurg,138:17-25.Eggermont,AM等人，1996.Isolatedlimbperfusionwithhigh-dosetumornecrosisfactor-alphaincombinationwithinterferongammaandmephalanfornon-resectableextremitysofttissuesa;rcomas:amulticentertrial;J.Clin.Oncol,14:2653-2665.)。在此治療人體局部的末期惡性腫瘤臨床試驗中，局部灌注的TNFa藥物可大幅度增加腫瘤病灶藥物暴露水平，然后藥物可由靜脈血管回流導(dǎo)入到一個累容器里，因而降低患者的全身循環(huán)系統(tǒng)的全身毒性。從運(yùn)些人體局部治療臨床實驗數(shù)據(jù)可W發(fā)現(xiàn)，TNFa對于肢體上的黑色素瘤或軟組織肉瘤細(xì)胞的治療效果十分驚人巧ggermont,AM等人，2003.Tumornecrosisfactor-basedisolatedlimbperfusionwithforSoftTissueSarcomasandMelanoma:TenyearsofsuccessfulAnti-vascularTherapy.CurrOncolRep,5:79-80.FrakerDL等人,BiologicaltherapywithTNF:systemicadministrationandisolatedlimbperfusion.1995.In:V.T.Devita,S.HeilmanandS.A.RosenbergSA.Philadelphia:J.B.LippincottCo.PP295-328.VanEtten,B.等人，2003.Fiftytumornecrosisfactor-basedisolatedlimbperfusionsforlimbsalvageinpatientsolderthan75yearswithlimb-threateningsofttissuesarcomasandotherextremitytumors.Ann.Surg化col.10:32-37.)。臨床試驗結(jié)果證實TNFa在末期惡性腫瘤患者人體內(nèi)療效特征為病灶腫瘤細(xì)胞出血性壞死，局部腫瘤病灶的完全緩解治療率甚至可達(dá)到90%W上。[0004]為克服TNFa在人體內(nèi)循環(huán)時間短的缺點(diǎn)，從而使其能夠更廣泛地應(yīng)用于惡性腫瘤疾病的全身性臨床治療，近年來國內(nèi)外學(xué)者正在努力研究TNFa藥物載體傳遞系統(tǒng)，即高分子化學(xué)修飾方法，W便延長藥物半衰期，提高藥物的祀向性，W及降低藥物的不良反應(yīng)。本發(fā)明人提出，利用聚乙二醇修飾技術(shù)，來解決非腸道給藥TNFa蛋白藥物半衰期短的缺點(diǎn)，延長藥物半衰期，從而能夠運(yùn)用在人體上，利用非腸道給藥方式充分呈現(xiàn)殺死(tumoricidalactivity)惡性腫瘤細(xì)胞，而非抑制制止（tumoristaticactivity)惡性腫瘤細(xì)胞生長的特異生物活性?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】陽〇化]為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種新的聚乙二醇-腫瘤壞死因子a或聚乙二醇-腫瘤壞死因子a類似物的偶聯(lián)物。本發(fā)明利用不同聚合方式或不同聚合鏈長度的活化聚乙二醇對腫瘤壞死因子a或其類似物進(jìn)行化學(xué)修飾，從而產(chǎn)生一系列新化學(xué)組成與化學(xué)結(jié)構(gòu)的用于預(yù)防或治療各種惡性腫瘤的藥物。[0006]本發(fā)明所述的腫瘤壞死因子a類似物可W為TNFa的突變蛋白，優(yōu)選TNFa的A2化、G3化單點(diǎn)突變TNFa類似蛋白。[0007]在本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案中，所述聚乙二醇為線性聚乙二醇，且所述聚乙二醇線性鏈的長度范圍為5,000-20,000,優(yōu)選為20,000。[0008]在本發(fā)明另一個優(yōu)選的實施方案中，所述聚乙二醇為活化的聚乙二醇，所述活化的聚乙二醇為聚乙二醇的甲氧基班巧酷亞胺戊二酸醋N服醋（Metho巧SuccinimicbdGlutarate畑Seste;r，SG-PEG)或班巧酷亞胺簇甲基NHS醋（SuccinimidylCarboxymeth}^NHSester,SCM-PEG)〇[0009]在本發(fā)明一個特別優(yōu)選的實施方案中，所述聚乙二醇-腫瘤壞死因子a或聚乙二醇-腫瘤壞死因子a類似物的偶聯(lián)物為TNFaSCMPEG5、TNFaSGPEG10、TNFaSCMPEG20、TNFaSGPEG20、TNFaA21KSGPEG20、TNFaG31KSGPEG20、TNFaA2化SCMPEG20、或TNFaG3化SCMPEG20。[0010]本發(fā)明進(jìn)一步提供如上所述的聚乙二醇-腫瘤壞死因子a或聚乙二醇-腫瘤壞死因子a類似物的偶聯(lián)物的制備方法，其包括將活化的聚乙二醇與TNFa或TNFa類似物接觸反應(yīng)的步驟。其中，所述聚乙二醇為線性聚乙二醇，且所述聚乙二醇線性鏈的長度范圍為5,000-20,000,優(yōu)選20,000。所述活化的聚乙二醇優(yōu)選為聚乙二醇的甲氧基班巧酷亞胺戊二酸醋N服醋或班巧酷亞胺簇甲基N服醋。W11]在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中所述TNFa或TNFa類似物與聚乙二醇的用量比范圍為按重量計1:20-1:30,優(yōu)選1:20。[0012]在本發(fā)明另一個優(yōu)選的實施方案中，上述制備方法中，所述反應(yīng)的抑范圍控制在8.5至9.5,優(yōu)選為9.0+0.1。所述反應(yīng)的溫度范圍控制在25至37°C，優(yōu)選的溫度控制在30+0.rc。[0013]聚乙二醇化學(xué)修飾反應(yīng)[0014]聚乙二醇化學(xué)反應(yīng)是本發(fā)明中的重要控制程序?；罨木垡叶紝NFa蛋白修飾反應(yīng)是通過控制優(yōu)化的反應(yīng)抑值在9.0+0.1，反應(yīng)時間控制在短于30分鐘，蛋白與聚乙二醇的用量比為1:20-l:30(w:w)，反應(yīng)溫度控制在25至37°C，使TNFa蛋白表面的賴氨酸能夠充分的與活化聚乙二醇進(jìn)行反應(yīng)，W獲得特定分子量的聚乙二醇修飾偶聯(lián)產(chǎn)物。[0015]如上，如果采用不同分子量，或聚合方式不同的活化聚乙二醇對生物大分子蛋白進(jìn)行化學(xué)修飾，則可獲得聚乙二醇高純度、狹窄單向分布（分子量分布在1.01-1.05之間）、平均分子量為5,000-20,000的聚乙二醇與腫瘤壞死因子a或其類似物的穩(wěn)定偶聯(lián)物燈NFa陽G)。[0016]聚乙二醇化學(xué)反應(yīng)完成后，可W用透過分子量50,000的濾膜裝置，將剩余未完成化學(xué)反應(yīng)的蛋白，及剩余未反應(yīng)的線性聚乙二醇用高速離屯、分離，即可獲得高純度的聚乙二當(dāng)前第1頁1 2 3 4 5