一種抗手足口病特異性納米抗體及其效價(jià)測(cè)定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明公開(kāi)了一種抗手足口病抗體及其效價(jià)測(cè)定方法，具體地說(shuō)，是一種抗手足口病特異性納米抗體及其效價(jià)測(cè)定方法；屬于免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]手足口病(Hand-foot-mouth disease, HFMD)是由多種腸道病毒引起的急性傳染病，多發(fā)生于5歲以下的嬰幼兒，成人也偶見(jiàn)發(fā)生，可引起發(fā)熱和手、足、口腔等部位的皮疹、潰瘍，具有很強(qiáng)的傳染性，可以通過(guò)玩具、食具、鼻咽分泌物、飛沫等多種途徑傳染。其癥狀表現(xiàn)為:急性起病，發(fā)熱，手或腳掌部出現(xiàn)斑丘疹和皰疹，臀部或膝蓋也可以出現(xiàn)皮疹。皮疹周?chē)醒仔约t暈，皰內(nèi)液體較少；口腔粘膜出現(xiàn)散在的皰疹，疼痛明顯。部分患者伴有咳嗽、流涕、食欲不振、惡心、嘔吐和頭疼等癥狀。少數(shù)患者可引起心肌炎、肺水腫、無(wú)菌性腦膜腦炎等并發(fā)癥，個(gè)別重癥患者如果病情發(fā)展快，會(huì)導(dǎo)致死亡。
[0003]引發(fā)手足口病的腸道病毒有20多種，其中腸道病毒71型(EV71)和柯薩奇病毒A16型(CoxA16)最為常見(jiàn)。1957年在新西蘭首次報(bào)道，1958年分離出柯薩奇病毒，1959年提出HFMD命名，60年代以后，許多國(guó)家和地區(qū)多次報(bào)道該病的流行。早期發(fā)現(xiàn)的手足口病的病原體主要是CoxA16型，1969年分離并首次確認(rèn)EV71病毒。1981年在上海首次報(bào)道本病。此后，北京、河北、天津、福建、吉林和廣東等10幾個(gè)省市均有報(bào)道。1995年武漢病毒研究所從手足口病人中分離出EV71，1998年深圳市衛(wèi)生防疫站從患者標(biāo)本中分離出EV71病毒。
[0004]1993年，Hamers-Casterman等報(bào)道了在胳駐科動(dòng)物(單峰駐、雙峰駐、美洲駐等)體內(nèi)存在一種只含重鏈不含輕鏈的天然重鏈抗體(Heavy chain antibody, HCAb)。
[0005]由于駱駝重鏈抗體是純天然的，不能直接作用于人，或者為人類(lèi)所用。因此克隆駱駝體內(nèi)重鏈抗體的可變區(qū)后，得到的僅有一個(gè)重鏈可變區(qū)組成的單域抗體，稱(chēng)之為重鏈可變區(qū)基因抗體(Variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody, VHH), VHH抗體是迄今為止發(fā)現(xiàn)的具有結(jié)合抗原功能的最小分子量抗體片段，分子量為15KD，僅為常規(guī)抗體的1/10，其分子高度4.8nm，直徑2.2nm，故又被稱(chēng)為納米抗體(Nanobody)。
[0006]目前，雖然已有針對(duì)預(yù)防HFMD的疫苗等，臨床用藥主要有抗病毒藥、中藥和抗菌藥等，治療效果不理想，而且有副作用，影響兒童健康。此外，雖現(xiàn)已有治療手足口病的抗體，但是由于傳統(tǒng)抗體的一些缺點(diǎn)，如:純度低、穩(wěn)定性差及特異性差等特點(diǎn)，使其在治療手足口病方面有了一定的局限性。因此，本發(fā)明的抗手足口病特異性納米抗體不但能有效治療手足口病，而且相比于傳統(tǒng)抗體而言，具有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]針對(duì)上述不足，本發(fā)明的目的在于提供一種分子量小、水溶性好、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性高的抗手足口病特異性納米抗體，本發(fā)明還提供該抗手足口病特異性納米抗體的效價(jià)測(cè)定方法。
[0008]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供的前一個(gè)技術(shù)方案是這樣的:
[0009]—種抗手足口病特異性納米抗體，所述的抗手足口病特異性納米抗體依次通過(guò)下述步驟制得:
[0010]1)采用滅活純化的EV71型病毒株制成可溶性抗原；
[0011]2)用0.01M的磷酸鹽緩沖液將步驟1)制備的可溶性抗原配成0.8-1.2mg/ml抗原液，與弗氏完全佐劑按體積比1:0.8-1.2充分乳化后制得免疫抗原；
[0012]3)采用步驟2)制備的免疫抗原多點(diǎn)注射雙峰駱駝背部皮下，平均500-700 μ L/只，免疫周期為12-18天，中間加強(qiáng)免疫3次，采用初免相同免疫方法和劑量，免疫4個(gè)周期后，靜脈取血，收集血清，3-5°C冰箱保存?zhèn)溆茫?br>[0013]4)將收集到的血清，通過(guò)PEG三步沉淀法和改進(jìn)水體綜合PEG法進(jìn)行純化，得到納米抗體。
[0014]上述的抗手足口病特異性納米抗體，步驟1)所述的制備抗原是將EV71病毒液接種到生長(zhǎng)至單層的橫紋肌肉細(xì)胞中，每瓶加0.5mL，放入0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至90%左右細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變時(shí)收獲，_15-25°C凍融2-4次，3-5°C時(shí)以6000-10000rpm離心0.5-1.5h，收集病毒液3-5°C lOOOOrpm離心1.5-2.5h，棄上清，沉淀用PBS緩沖液懸?。?br>[0015]2) CsCl密度梯度離心純化病毒抗原
[0016]將CsCl裝入梯度離心管中，輕輕吹打至溶解，3-5°C時(shí)以12000-18000rpm離心10-15h，3-5°C保存過(guò)夜，次日3-5°C 18000-22000rpm離心3_5h，以去除殘余CsCl和上清液，加入PBS稀釋純化病毒液3-5°C，即得可溶性抗原。
[0017]進(jìn)一步的，上述的抗手足口病特異性納米抗體，步驟2)所述的磷酸鹽緩沖液pH7.0-7.8o
[0018]進(jìn)一步，上述的抗手足口病特異性納米抗體，步驟3)所述的加強(qiáng)免疫采用初免相同免疫方法和劑量。
[0019]進(jìn)一步，上述的抗手足口病特異性納米抗體，步驟4)所述的PEG三步沉淀法是PEG粉末加入到駱駝血清中使其終濃度為3-6%，調(diào)PH值至7.0-7.5，充分混勻后3_5°C，離心分離后過(guò)濾，棄沉淀；取上清液中加入PEG粉末使其終濃度為8.0-10.0%，調(diào)PH值至7.0-7.5，充分混勻后3-5°C，離心分離后過(guò)濾，棄上清液，沉淀用3-5°C PBS緩沖液溶解后再加入PEG至終濃度為10-18%，離心分離后過(guò)濾后再次棄上清，再用PBS溶解沉淀，轉(zhuǎn)入透析袋，透析48h以上，每12h更換一次透析液，最終收集截留物質(zhì)，-50-60°C真空冷凍干燥至粉末，_20°C保存。
[0020]進(jìn)一步，上述的抗手足口病特異性納米抗體，步驟4)所述的改進(jìn)水體綜合PEG法是駱駝血清與3-5°C凍存蒸餾水2:6-10混勻，調(diào)PH值至5.0-5.5，冰箱3_5°C靜置過(guò)夜；3-5 °C離心分離后過(guò)濾后取沉淀。
[0021]進(jìn)一步，上述的抗手足口病特異性納米抗體，所述的PEG粉末為PEG 6000粉末。
[0022]本發(fā)明還有一個(gè)技術(shù)方案是提供該抗手足口病特異性納米抗體的效價(jià)測(cè)定方法，該方法依次包括下述步驟:
[0023]1)包被
[0024]將純化過(guò)的EV71病毒抗原用0.01M PBS 1:1000稀釋至最佳包被溶度后包被于96孔酶標(biāo)板上，37°C溫育lh后，4°C過(guò)夜，次日甩干孔中液體，用PBST洗滌1次，吸水紙拍干；
[0025]2)封閉
[0026]用含3%脫脂奶粉的0.01M PBS液封閉，37°C溫育lh后甩干，PBST洗滌3次，每次2-5min，吸水紙拍干；
[0027]3)加一抗
[0028]駱駝抗體血清用0.01M PBS 倍比系列 1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1: 32000、1:64000、空白PBS稀釋后加入96孔酶標(biāo)板，PBS作為空白對(duì)照，37°C溫育lh,甩干，PBST洗滌3次，每次2-5min，吸水紙拍干；
[0029]4)加酶標(biāo)二抗
[0030]每孔加入用0.01MPBS 1:8000稀釋的兔抗駱駝抗體100 μ L，置37°C溫育lh后甩干，PBST洗滌3次，每次2-5min，吸水紙拍干；
[0031]5)顯色和讀數(shù)
[0032]用新鮮配制的TMB顯色液，置37°C溫育顯色約15min后，每孔加50 μ L 2Μ H2S04if液終止反應(yīng)，立即用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在0D 450nm處吸光值，以免疫駱駝抗體與未免疫駱駝抗體陰性對(duì)照0D值之比大于2.1，且陰性駱駝抗體吸光值大于0.1做為抗體陽(yáng)性的判定閾值，陽(yáng)性孔0D值多2.1倍陰性孔0D值的最高稀釋倍數(shù)為駱駝抗體的效價(jià)。
[0033]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所制備的納米抗體，具有分子量小、可水溶性好、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)；且耐熱、耐酸，穩(wěn)定性高。這些獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)使納米抗體在臨床和基礎(chǔ)科學(xué)的應(yīng)用中起著重要的作用。因此，納米抗體在腫瘤的診斷和治療、食品科學(xué)、抗病毒等領(lǐng)域都有較大的應(yīng)用價(jià)值與前景。
【附圖說(shuō)明】
[0034]圖1是抗EV71病毒納米抗體純化分析圖；
[0035]圖2是抗EV71病毒納米抗體效價(jià)消長(zhǎng)規(guī)律圖；
[0036]圖3是雙向免疫瓊脂擴(kuò)散圖；
[0037]圖4是蛋白印跡分析抗EV71病毒納米抗體圖；
[0038]圖5是特異性納米抗體體外中和活病毒分析圖。
【具體實(shí)施方式】
[0039]下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】，對(duì)本發(fā)明的權(quán)利要求做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，但不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的任何限制，任何人在本發(fā)明權(quán)利要求保護(hù)范圍內(nèi)所做的有限次的修改，仍在本發(fā)明的權(quán)利要求保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0040]實(shí)施例1
[0041]抗手足口病納米抗體的制備
[0042]1、抗原制備
[0043]1)將EV71病毒液接種到生長(zhǎng)至單層的RD (橫紋肌肉細(xì)胞)細(xì)胞中，每瓶加0.5mL，放入0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至90%左右細(xì)胞出現(xiàn)CPE(細(xì)胞病變)時(shí)收獲，-20°C凍融3次，4°C 8000rpm，lh離心，收集上清液(病毒液)，4°C lOOOOrpm離心2h，棄上清，沉淀用PBS緩沖液懸浮。
[0044]2) CsCl密度梯度離心純化病毒抗原
[0045]稱(chēng)取3.2g CsCl裝入7.6mL梯度離心管中，輕輕吹打至溶解，水平轉(zhuǎn)頭4°C 15000rpm，離心12h，4°C保存過(guò)夜。次日4°C 20000rpm離心4h，以去除殘余CsCl，棄上清，加入300 μ L PBS稀釋純化病毒液4°C保存。
[0046]2、免疫
[0047]用PBS溶解純化后EV71抗原，配成lmg/ml溶液。取上述溶液0.6ml與弗氏完全佐劑按1:1混合后充分乳化，采用背部皮下多點(diǎn)注射雙峰駝，600 μ L/只；免疫周期為15天，加強(qiáng)免疫3次，加強(qiáng)免疫采用弗氏不完全佐劑與病毒液按1:1乳化，采用初免相同免疫方法和劑量。加強(qiáng)免疫3次后收集血清，分裝后，4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0048]3、納米抗體的分離純化
[0049]分別采用PEG三步沉淀法和改進(jìn)水體綜合PEG法純化免疫后獲得的駱駝血清蛋白。結(jié)果見(jiàn)圖1。
[0050]1)PEG三步沉淀法:PEG 6000粉末加入到駱駝血清中使其終濃度為4.5%，調(diào)PH值至7.2，充分混勻后4°C，8000rpm離心30min，過(guò)濾，棄沉淀。上清液中加入PEG 6000粉末使其終濃度為9.0%，調(diào)PH值至7.2，充分混勻后8000rpm 4°C離心30min，棄上清液。沉淀用適量4°C PBS緩沖液(