所有的 待測序分子僅具有反義鏈。
[0089] 在另一優(yōu)選例中，上述的Z6的長度為150_250bp。
[0090] 在另一優(yōu)選例中，所述的待測序分子中，Z3與Z3a形成互補(bǔ)配對；且Z4與Z4a形 成互補(bǔ)配對。
[0091] 在另一優(yōu)選例中，所述的待測序分子的結(jié)構(gòu)如式V所示：
[0092] 5' -AG*ACAAGCTCXXXXXXXXXXGATCGGGCTTCGACTGGAGAC T ~~~A AGTCGGAGGCCAAGCGGTCTTAGGA-3， 正義鏈
[0093] 3,-CTAGCCCGAAGCTGACCTCTG A~~~T TCAGCCTCCGGTTCGCCAGAATCCT-5' 反義 鏈
[0094] (V)
[0095] 式中，
[0096] "~~~"為待測序片段的序列；
[0097] *硫逐磷酸酯修飾。
[0098] 在本發(fā)明的第五方面，提供了一種用于測序的文庫，所述的文庫是用本發(fā)明第三 方面中所述的構(gòu)建方法制備的。
[0099] 在本發(fā)明的第六方面，提供了一種本發(fā)明的第四方面或本發(fā)明的第五方面所述的 測序文庫的用途，該用途用作高通量測序平臺的文庫。
[0100] 在另一優(yōu)選例中，所述的高通量測序平臺為需要單鏈環(huán)狀文庫的測序平臺。
[0101] 在另一優(yōu)選例中，所述的高通量測序平臺為Complete Genomics測序平臺。
[0102] 應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文（如實(shí)施例）中具 體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附圖說明】
[0103] 圖1顯示了核酸測序單鏈環(huán)狀文庫構(gòu)建方法流程圖。
[0104] 圖2顯不了用標(biāo)準(zhǔn)品universal human reference RNA建立文庫后用6%的TBE 變性膠檢測電泳圖。泳道1和2是單鏈環(huán)狀文庫，泳道3是low range ssRNA ladder。
[0105] 圖3顯示了用標(biāo)準(zhǔn)品universal human reference RNA建立文庫樣本覆蓋度分析 結(jié)果圖，從圖上可以看出樣本覆蓋度均一。
[0106] 圖4顯示了兩次平行實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相關(guān)性分析結(jié)果圖。從圖中可以看出相關(guān)性均大 于0. 85,符合標(biāo)準(zhǔn)，而且得到的絕對定量的基因表達(dá)相關(guān)性非常接近，對同一樣品的重復(fù)性 良好。
[0107] 圖5顯示了用炎黃細(xì)胞（YH cell)總RNA建立文庫后用6%的TBE變性膠檢測電 泳圖。泳道1是low range ssRNA ladder,泳道2是單鏈環(huán)狀文庫。
[0108] 圖6顯示了用炎黃細(xì)胞（YH cell)總RNA建立文庫樣本覆蓋度分析結(jié)果圖，從圖 上可以看出樣本覆蓋度均一。
[0109] 圖7顯示了用Hela腫瘤細(xì)胞的DNA建立文庫后用6%的TBE變性膠檢測電泳圖。 泳道1是low range ssRNA ladder,泳道2是單鏈環(huán)狀文庫。
【具體實(shí)施方式】
[0110] 本發(fā)明人通過廣泛而深入的研究，通過對大量篩選，首次開發(fā)了一種可用于構(gòu)建 核酸測序文庫的接頭，用該接頭來高效制備高質(zhì)量的、可用于RNA測序的單鏈環(huán)狀文庫的 新技術(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，用本發(fā)明所述建庫方法所構(gòu)建的RNA測序單鏈環(huán)狀文庫，其文庫質(zhì) 量非常高，配合CG測序平臺，所得到的數(shù)據(jù)真實(shí)度高、可信度佳，且對信息分析沒有影響。 在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
[0111] CG測序平臺
[0112] CG測序平臺采用了高密度DNA納米芯片技術(shù)，在芯片上嵌入DNA納米球，然后用復(fù) 合探針_錨定分子連接（Combinatorial probe anchor ligation, cPAL)技術(shù)來讀取堿基 序列。
[0113] 文庫構(gòu)建后可獲得單鏈環(huán)狀DNA分子，通過滾環(huán)復(fù)制，可形成一個(gè)包含200多個(gè)拷 貝的DNA納米球（DNB)，然后采用高密度DNA納米芯片技術(shù)，將DNA納米球加到芯片上的網(wǎng) 狀小孔內(nèi)，每個(gè)小孔只能容納一個(gè)DNA納米球（當(dāng)一個(gè)DNB結(jié)合到芯片上的小孔后，會排斥 其他DNB的結(jié)合），DNA納米芯片的占用量超過90%，每一個(gè)制備好的芯片可容納1800億 個(gè)堿基用于成像。
[0114] cPAL技術(shù)利用四種不同顏色標(biāo)記的探針去讀取接頭附近的堿基，每次最多讀取 10個(gè)連續(xù)堿基且每次測序是相互獨(dú)立的，即測序結(jié)果不受前一個(gè)堿基測序結(jié)果的影響，因 此不會發(fā)生錯(cuò)誤累積的現(xiàn)象，測序結(jié)果精準(zhǔn)性高，堿基錯(cuò)誤率可低至十萬分之一。在測序 時(shí)，加入錨定分子與接頭互補(bǔ)配對，然后DNA連接酶將四種不同顏色標(biāo)記的探針結(jié)合到模 板的相應(yīng)堿基上，通過對熒光基團(tuán)的成像來判斷堿基類型。cPAL技術(shù)的另一個(gè)優(yōu)勢是采用 了非連續(xù)、非連鎖聯(lián)合探針錨定連接技術(shù)來讀取堿基可大大減少探針和酶的濃度；與邊合 成邊測序不同，cPAL每個(gè)cycle (循環(huán)）可一次性讀取數(shù)個(gè)堿基，這樣消耗的測序試劑和成 像時(shí)間都大大減少。與目前流行的第二代測序技術(shù)相比，此建庫和測序方法能在消耗更少 試劑的前提下獲得更多的數(shù)據(jù)。
[0115] 構(gòu)建文庫的方法
[0116] 在本發(fā)明中，通過了 一種特殊設(shè)計(jì)的接頭，該接頭包括第一接頭和第二接頭。第一 接頭的第一鏈5'端經(jīng)硫代修飾（優(yōu)選地硫逐磷酸酯修飾），可防止外切酶切除。此外，第一 鏈還可含有標(biāo)簽序列。第一鏈與第四鏈的3'末端堿基均為T，硫逐磷酸酯修飾的鏈（第一 鏈）長度比第二鏈長。第一鏈與第二鏈可形成雙鏈結(jié)構(gòu)成為第一接頭，第三鏈與第四鏈可 形成雙鏈結(jié)構(gòu)成為第二接頭，第二鏈和第三鏈的5'端有A堿基。
[0117] 在本發(fā)明的構(gòu)建文庫的方法中，第一接頭和第二接頭分別連接于目標(biāo)片段序列的 兩端。將獲得兩端加接頭的DNA片段作為模板，用特異性引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而獲得 DNA擴(kuò)增產(chǎn)物，其中所述引物對中的一條引物標(biāo)記有生物素，通過用包被有親和素的珠子通 過"親和素-生物素"的結(jié)合進(jìn)行分離，從而捕獲有生物素標(biāo)記的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，再對被捕 獲的帶有生物素標(biāo)記的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行單鏈化處理，從而獲得單鏈DNA，繼而進(jìn)行單鏈 環(huán)化反應(yīng)得到含有單鏈環(huán)化分子的混合物，即為測序文庫。
[0118] 單鏈環(huán)狀文庫
[0119] 在本發(fā)明中，還提供了用本發(fā)明上述文庫構(gòu)建方法所制備的適用于測序的單鏈環(huán) 狀文庫。
[0120] 在本發(fā)明的優(yōu)選例中，本發(fā)明人通過最佳建庫條件的摸索，最佳條件所得結(jié)果與 其他技術(shù)所得結(jié)果的比較，充分驗(yàn)證該本發(fā)明方法的穩(wěn)定性和可重復(fù)性，并充分驗(yàn)證本發(fā) 明方法的真實(shí)可靠性。此外，選用不同樣品，進(jìn)行多次實(shí)驗(yàn)后，證明利用本發(fā)明的單鏈環(huán)狀 文庫所獲得的測序數(shù)據(jù)真實(shí)可信。
[0121] 本發(fā)明主要優(yōu)點(diǎn)在于：
[0122] (1)首次發(fā)明了一種可用于構(gòu)建核酸測序文庫的接頭；
[0123] (2)本發(fā)明的接頭序列上帶有硫代修飾，能避免內(nèi)切酶消化，完成后續(xù)反應(yīng)。
[0124] (3)本發(fā)明的接頭具有粘性末端，連接效率高，能夠有效降低接頭自連問題。
[0125] (4)本發(fā)明的接頭可以通過引入標(biāo)簽來降低后續(xù)測序成本。
[0126] (5)本發(fā)明的RNA單鏈環(huán)狀文庫可用于需要單鏈環(huán)狀文庫的測序平臺。
[0127] (6)本發(fā)明提供的方法可以實(shí)現(xiàn)一步加接頭，操作簡便。
[0128] (7)本發(fā)明提供的方法具有測序通量高，準(zhǔn)確度高和操作簡便。
[0129] (8)本發(fā)明提供的方法具有穩(wěn)定性，可重復(fù)性和可靠性高的特點(diǎn)。
[0130] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件如 Sambrook 等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和 份數(shù)按重量計(jì)算。
[0131] 材料和方法
[0132] 下列實(shí)施例中試劑來源為：5X第一鏈緩沖液（First strand buffer)含有： 80-400mM 氯化鈉，10-80mM 氯化鎂，200mM-300mM Tris-HCl、磷酸鹽，pH 值為 8. 0-8. 5,溶劑 為水。標(biāo)準(zhǔn)品universal human reference RNA(購自安捷倫），該RNA是10種人細(xì)胞株的 混合物（乳腺細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、宮頸細(xì)胞、胚胎細(xì)胞、惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞、黑色素瘤細(xì)胞、脂肪 肉瘤細(xì)胞、淋巴瘤細(xì)胞、白血病T淋巴細(xì)胞、骨髓B淋巴細(xì)胞）。
[0133] 純化DNA片段均采用市售的Ampure XP磁珠。
[0134] 本實(shí)施例中所用的實(shí)驗(yàn)材料如無特殊說明，均可從市售渠道獲得
[0135] 實(shí)施例1RNA單鏈環(huán)狀文庫的構(gòu)建
[0136] 具體實(shí)驗(yàn)步驟（見圖1中所示流程步驟）：
[0137] I、mRNA提取與純化
[0138] 1)取標(biāo)準(zhǔn)品 universal human reference RNA 3ug至一個(gè)RNase-free 的管中，用 DEPC水稀釋至50 μ 1。混勻，65°C變性5分鐘以打開二級結(jié)構(gòu)，然后立即將樣品置于冰上。
[0139] 2)吸取 15 μ I Dynalbeads Oligo(ClT)25磁珠于 I. 5ml 的不黏 EP 管中，用 100 μ 1 結(jié)合緩沖液（binding buffer)將磁珠洗兩次，將磁珠重新懸浮于50 μ I binding buffer, 將第一步中制得的總RNA加入管中，室溫放置5min。
[0140] 3)將non-stick-EP管置于MPC (磁分離器）上2min，去除上清，再用200 μ 1洗滌 緩沖液（washing buffer)清洗磁珠兩次。取一新的不粘的EP管，加入50 μ 1的結(jié)合緩沖 液（binding buffer)〇
[0141] 4)向含磁珠的 EP 管（即 3)中的 non-stick-EP 管）中加入 50 μ I IOmM Tris-HCl， 80°C加熱2min將mRNA從磁珠上洗脫下來，迅速將EP管轉(zhuǎn)至MPC上，轉(zhuǎn)移mRNA至3)中新 的EP管，將混合溶液在65°C變性5min，打開二級結(jié)構(gòu)，然后立即將樣品置于冰上。另外，立 即將200 μ 1洗滌緩沖液（washing buffer)加入到含有磁珠管中，將磁珠洗兩次。
[0142] 5)將100 μ I mRNA樣品（即4)中洗脫下來的mRNA)加入洗過兩次的磁珠中，室 溫放置5min，將EP管置于MPC上2min，小心吸除上清，再用200 μ 1洗滌緩沖