不同。為此，首先用MTT法確定實驗用的藥物濃度范圍。結果如 表1(VS對照組#P〈0.01)顯示，不同濃度的化合物（I)對內皮細胞的作用效應不同，低劑 量的藥物濃度（5~20μg/mL)細胞活性與對照組比較，沒有統(tǒng)計學差異。40μg/mL作用 48小時后細胞活力下降了約50%，80μg/mL作用48小時后細胞活力下降了 70%，與對照 組比較有統(tǒng)計學差異（P〈〇. 01)，產生了一定的毒副作用。因此本實驗所用的化合物（I) 濃度為5、10、20μg/mL，以排除藥物自身對細胞的毒性作用。
[0067] 2、不同濃度ox-LDL對臍靜脈內皮細胞活力的影響
[0068] 由于氧化低密度脂蛋白氧化程度的差異，氧化低密度脂蛋白的細胞毒性范圍 會有所不同。因此我們先采用MTT確定ox-LDL細胞毒的范圍。結果如表2(VS對照組 卞〈0. 05ttP〈0. 01)所示，不同濃度ox-LDL對HUVEC細胞活性影響不同。與對照組相比，10μg/ mL組有促進HUVEC細胞活性增加的趨勢，但與對照組比較沒有統(tǒng)計學差異（P>0. 05) ;20~ 100μg/mL各組內皮細胞活性隨濃度增加而減少，與對照組比較有統(tǒng)計學差異（P〈0. 05或 P<0. 01) 〇
[0069] 3、化合物（I)對ox-LDL誘導臍靜脈內皮細胞損傷的干預作用
[0070] 結果如表 3 (VS.ox-LDLgroup#P〈0. 01)所示，ox-LDL(50μg/mL)組的細胞 活性下降，與對照組比較有統(tǒng)計學差異（P〈〇. 01)，說明ox-LDL組細胞活性顯著降低， 〇X-LDL(50yg/mL)對正常HUVEC具有損傷作用。化合物（I)不同劑量組的細胞活性均 高于ox-LDL組，與ox-LDL組比較差異有統(tǒng)計學意義（P〈0. 01)，說明此三個劑量組的細胞 活性顯著高于ox-LDL組，提示化合物（I)可抑制ox-LDL誘導的HUVEC損傷?；衔?(I)10yg/mL和化合物（I)20yg/mL組的細胞活性高于化合物（I)5yg/mL組，與化 合物（I) 5μg/mL比較有統(tǒng)計學差異（P= 0· 01或Ρ〈0· 01)。化合物（I) 20μg/mL細胞 活性較化合物（I) 10μg/mL組有升高趨勢，但沒有統(tǒng)計學差異（P= 0. 185)。提示化合物 (I)的內皮保護作用在一定范圍內具有量效關系。
[0071] 4、化合物（I)對OX-LDL誘導損傷的臍靜脈內皮細胞凋亡的影響
[0072] 各組流式細胞結果顯示：各組細胞的凋亡率差異有統(tǒng)計學意義（P〈0. 01)，ox-LDL 組的增殖指數(shù)明顯升高，與對照組比較有統(tǒng)計學差異（P〈〇.〇l)說明〇X-LDL(50yg/mL)對 正常HUVEC具有損傷作用?；衔铮↖)不同劑量組的凋亡率均低于ox-LDL組，與ox-LDL 組比較差異有統(tǒng)計學意義（P〈〇. 01)，說明此三個劑量組的凋亡率顯著低于ox-LDL組，提 示化合物（I)可抑制ox-LDL誘導的HUVEC凋亡?；衔铮↖)不同劑量組的凋亡率 隨著劑量升高逐漸降低，各組之間差異有統(tǒng)計學意義（P〈〇.〇l)。結果見表4(VSox-LDL group#P〈0. 01)。提示化合物（I)的內皮保護效應在一定范圍內具有量效關系。
[0073] 結論，本研究采用MTT法檢測發(fā)現(xiàn)化合物（I)能明顯提高ox-LDL損傷的人臍靜 脈內皮細胞的細胞活力，說明其具有抑制ox-LDL誘導的HUVEC損傷的作用。進一步采用AnnexinV-FITC、PI雙染色流式細胞術檢測細胞凋亡，研究發(fā)現(xiàn)各濃度組化合物（I)均能 顯著減少ox-LDL誘導的HUVEC凋亡，并且效果呈劑量依賴性。提示化合物（I)能通過抑 制ox-LDL誘導的HUVEC凋亡來實現(xiàn)內皮保護作用。
[0074] 表1不同濃度化合物（I)對HUVEC細胞活力的影響（_x±s，n=6)
[0075]

[0076] 表2ox-LDL對HUVEC細胞活力的影響（S±s，n=6)
[0077]
[0078] 表3不同劑化合物（I)對ox-LDL誘導HUVEC損傷的干預作用（n=€>
[0079]

[0080] 表4不同劑量化合物（I)對OX-LDL誘導HUVEC凋亡的作用（its,n=3
[0081]
[0082] 實施例3
[0083] 片劑的制備：按實施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有機酸如酒石酸、或 檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無機酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按其與賦形劑重量比為 1:9的比例加入賦形劑，制粒壓片。
[0084] 實施例4
[0085] 口服液制備：按實施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有機酸如酒石酸、或 檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無機酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按常規(guī)口服液制法制成 口服液。
[0086] 實施例5
[0087] 膠囊劑或顆粒劑的制備：按實施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有機酸如 酒石酸、或檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無機酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按其與賦形劑 重量比為1:9的比例加入賦形劑，制成膠囊或顆粒劑。
[0088] 實施例6
[0089] 注射液的制備：按實施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有機酸如酒石酸、 或檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無機酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按常規(guī)加注射用水，精 濾，灌封滅菌制成注射液。
[0090] 實施例7
[0091] 無菌粉針的制備：按實施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有機酸如酒石 酸、或檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無機酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，將其溶于無菌注射 用水中，攪拌使溶，用無菌抽濾漏斗過濾，再無菌精濾，分裝于安瓿中，低溫冷凍干燥后無菌 熔封得粉針劑。
[0092] 本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發(fā)明的技術方案進行修改或者等同替 換，而不脫離本發(fā)明技術方案的實質和保護范圍。
【主權項】
1. 具有下述結構式的化合物（I )，2. 權利要求1所述的化合物（I )的制備方法，其特征在于包含以下操作步驟：(a)將 烏藥的干燥塊根粉碎，用80~90%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石 油醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇 萃取物；(b)步驟（a)中乙酸乙酯萃取物用大孔樹脂除雜，先用10%乙醇洗脫6個柱體積， 再用75 %乙醇洗脫10個柱體積，收集75 %乙醇洗脫液，減壓濃縮得75 %乙醇洗脫物浸膏； (c)步驟（b)中75%乙醇洗脫浸膏用正相硅膠分離，依次用體積比為85:1、55:1、25 :1、10:1 和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到5個組分；（d)步驟（c)中組分4用正相硅膠進一 步分離，依次用體積比為15:1、10:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個組分；（e) 步驟（d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為70%的甲醇水 溶液等度洗脫，收集8~10個柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物（I )。3. 根據(jù)權利要求2所述的化合物（I )的制備方法，其特征在于：所述大孔樹脂為AB-8 型大孔吸附樹脂。4. 根據(jù)權利要求2所述的化合物（I )的制備方法，其特征在于：所述用乙醇熱回流 提取采用的乙醇濃度為85 %。5. -種藥物組合物，其特征在于：其中含有治療有效量的權利要求1所述的化合物 (I )和藥學上可接受的載體。6. 權利要求1所述的化合物（I )在制備內皮細胞保護藥物中的應用。7. 權利要求5所述的藥物組合物在制備內皮細胞保護藥物中的應用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種原魯烷型倍半萜類化合物及其制備方法和醫(yī)藥用途。該化合物為首次報道，是一種結構新穎的原魯烷型倍半萜類化合物，可以從烏藥的干燥塊根中提取、分離純化得到。體外試驗證明該化合物能明顯提高ox-LDL損傷的人臍靜脈內皮細胞的細胞活力，說明其具有抑制ox-LDL誘導的HUVEC損傷的作用，可以用來開發(fā)成內皮細胞保護的藥物。
【IPC分類】A61P9/00, C07D307/00, A61K31/343
【公開號】CN105418544
【申請?zhí)枴緾N201511020022
【發(fā)明人】吳金鳳
【申請人】吳金鳳
【公開日】2016年3月23日
【申請日】2015年12月29日