楸樹扦插生根率主效QTL位點(diǎn)qRR3的分子標(biāo)記方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明提供了楸樹扦插生根率主效QTL位點(diǎn)qRR3的分子標(biāo)記方法，屬于分子遺傳 學(xué)領(lǐng)域，專用于定向培育扦插易生根的楸樹新品種。
【背景技術(shù)】
[0002] 楸樹(Catalpabungei)屬于紫葳科(Bignoniaceae)梓屬(Catalpa)的優(yōu)良珍貴用 材樹種。隨著工業(yè)的發(fā)展和世界人口的增長、木材需求與日劇增，木材短缺已成為世界性問 題，我國尤為突出。發(fā)展無性系林業(yè)成為緩解我國木材短缺問題的有效途徑，而扦插生根率 是制約無性系林業(yè)發(fā)展的瓶頸。楸樹為扦插生根率低的樹種，扦插生根困難限制了楸樹無 性系林業(yè)的發(fā)展。因此挖掘與扦插生根率相關(guān)的標(biāo)記位點(diǎn)對培育扦插易生根的楸樹新品種 具有重要的意義。
[0003] SSR分子標(biāo)記是目前應(yīng)用最廣泛的分子標(biāo)記技術(shù)之一，被廣泛的應(yīng)用于基因定位、 QTL定位、標(biāo)記輔助育種和遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建等方面。陳永霞等(陳永霞，張新全，馬嘯， 謝文剛.SSR標(biāo)記與扁穗牛鞭草農(nóng)藝性狀關(guān)聯(lián)分析.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，50(7):1494-1498.)選用10對SSR引物對44份外部形態(tài)差異較大的扁穗牛鞭草進(jìn)行掃描，進(jìn)行性狀與SSR 標(biāo)記的關(guān)聯(lián)分析，其中找到18個SSR標(biāo)記與8個農(nóng)藝性狀顯著相關(guān)，并篩選出優(yōu)異種質(zhì)，加快 扁穗牛鞭草的育種進(jìn)程。
[0004]前期研究發(fā)現(xiàn)不同楸樹無性系間扦插生根能力存在顯著差異，根據(jù)生根率、單株 生根數(shù)和單株最長根長等3個指標(biāo)可以將其分為生根能力較差、生根能力中等、生根能力較 好和易生根類等4個組（馬玲玲，王鵬，張振宇，李林芳，楊如同，李亞.梓屬植物嫩枝 扦插生根能力的評價.北方園藝，2014,（15): 72-77.)。該研究結(jié)果表明利用此群體開 展關(guān)聯(lián)分析，可能檢測到扦插生根率相關(guān)的QTL位點(diǎn)或分子標(biāo)記。目前還未見開展相關(guān)研究 的論文或?qū)＠?br>
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是公布楸樹扦插生根率主效QTL位點(diǎn)及其分子標(biāo)記。
[0006] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：利用SSR分子標(biāo)記引物CB202的正向引 物序列 5 ' -CTTGGAGCGACGTTTCTTTC-3 ' 和反向引物序列 5 ' -CCAAACATCATCGACAAACG-3 ' 結(jié)合 PCR技術(shù)擴(kuò)增楸樹嫩葉的基因組DNA，如果能擴(kuò)增出95bp的DNA片段，則標(biāo)志著楸樹扦插生 根率主效QTL位點(diǎn)qRR3的存在，利用TASSEL2.1軟件的GLM程序測得對楸樹扦插生根率的貢 獻(xiàn)率為19.16%。
[0007]有益效果:本發(fā)明首次公布了一個楸樹扦插生根率的主效QTL位點(diǎn)及其分子標(biāo)記， 該標(biāo)記將有利于縮短楸樹的育種周期，降低育種成本，定向培育扦插生根率高的楸樹品種， 進(jìn)而加速楸樹的推廣，最終為在緩解我國的優(yōu)質(zhì)木材短缺的問題上發(fā)揮重要的作用。
【具體實(shí)施方式】
[0008] 楸樹扦插生根率統(tǒng)計分析：2013年3月上旬和2014年3月上旬，將87個楸樹無性系 的五年生枝條截成30cm長后均勾地臥置于平整的沙床內(nèi)，然后覆蓋3~5cm的細(xì)沙，饒透水。 每周用500倍的多菌靈濁液噴灑澆透沙床。將泥炭和珍珠巖按1:1的體積比混勻后裝進(jìn)育苗 盆(規(guī)格為15X15X20cm)中并用500倍的多菌靈濁液噴灑澆透。當(dāng)沙床內(nèi)新萌發(fā)的嫩枝高 度達(dá)到10~15cm時，去掉嫩枝的頂端，一周后，將嫩枝帶踵取下，作為插穗。將插穗上的葉片 連同葉柄一起剪掉，只剩頂部的一片葉子，并將其剪掉一半。將處理好的插穗基部浸蘸75% 的酒精消毒30s，用清水沖洗干凈，然后在3,000mg/L的IBA中浸蘸lmin，將插穗插入育苗 盤，每個穴杯插1根，深度為插穗長度的1/2~2/3。每個無性系扦插20個插穗，重復(fù)3次。扦插 完之后用85%遮陰網(wǎng)遮蓋防曬，自動噴霧裝置噴霧給水。每周用500倍的多菌靈濁液噴灑澆 透。扦插后70天統(tǒng)計各無性系生根率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)楸樹不同無性系間的生根率差異極大，生根 率變幅為10.06%~95.80%。
[0009] 楸樹群體遺傳結(jié)構(gòu)分析:利用CTAB法提取楸樹嫩葉基因組DNA，然后用277對SSR引 物隨機(jī)PCR擴(kuò)增12個楸樹無性系DNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)70對引物可以成功的擴(kuò)增出條帶清晰且多態(tài) 性好的條帶，合成引物的可用性為25.26%。70對SSR引物的多態(tài)性頻率介于40%~100%，平均 的多態(tài)性頻率為87.17%，多態(tài)性豐富(表1)。SSR引物由南京思普金生物科技有限公司合成。 PCR擴(kuò)增體系為10yL包括20ng基因組DNA，2.5mM的MgC12,0.5mM的dNTPs，20ng的引物， 0.5UTaqDNA聚合酶。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性5分鐘，94°C變性30秒，57°C退火45 秒，72°C延伸60秒，循環(huán)32次，最后72°C延伸5分種。PCR反應(yīng)在伯樂T100PCR儀上完成。 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測：利用8%濃度的聚丙烯酰胺凝膠電泳，進(jìn)行PCR產(chǎn)物檢測，上樣量為1.5μ L，電泳緩沖液為1ΧΤΒΕ，電壓設(shè)為220V，電泳至溴酚藍(lán)帶跑出膠最低端為止。膠片用銀染 方法染色:先用固定液(去離子水、10%乙醇、1%乙酸）固定10min，再1.5%硝酸銀溶液浸泡10 min，去離子水迅速洗滌2遍后，顯色液(去離子水、1.5%氫氧化鈉、1%甲醛)顯色10min，最后 用去離子水沖洗，放入膠片觀察燈上拍照。以二進(jìn)制記錄SSR引物擴(kuò)增結(jié)果，同一位點(diǎn)上具 有相同迀移率的條帶記為1，無帶記為0,獲得87個楸樹無性系的基因型數(shù)據(jù)。利用 Structure2.1軟件結(jié)合基因型數(shù)據(jù)對梓屬群體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果表明對應(yīng)似然值InP (D)隨K值的增大而持續(xù)增大，因此參照Evanno等（EvannoG,RegnautS,GoudetJ. DetectingthenumberofclustersofindividualsusingthesoftwareSTRUCTURE: asimulationstudy.Molecularecology, 2005, 14(8): 2611-2620.)通過ΛΚ來確定K 值。ΛΚ在K=7時出現(xiàn)峰值，所以87份楸樹材料可被分為7個亞群。將K=7代入Structure軟件 重新運(yùn)算，得到各個材料的對應(yīng)Q值，作為下一步生根性狀與SSR標(biāo)記關(guān)聯(lián)分析的協(xié)變量，可 以有效降低群體結(jié)構(gòu)對關(guān)聯(lián)分析的影響。
[0010] 楸樹連鎖不平衡分析:通過對70個SSR標(biāo)記486個位點(diǎn)分析，表明在117，855個成 對組合的SSR位點(diǎn)中，存在一定程度的LD。統(tǒng)計概率(P<0.01)支持的LD成對位點(diǎn)77,106 個，占全部位點(diǎn)組合的65.42%，平均值為0.557，值在0.4以上的LD位點(diǎn)組合數(shù)為42，523， 占總LD位點(diǎn)組合數(shù)的55.15%，其中位于0.8-1之間的位點(diǎn)數(shù)最多，有29,667個，以上均說明 位點(diǎn)間整體LD水平較高。
[0011]楸樹扦插生根率的關(guān)聯(lián)分析:利用TASSEL2.1軟件的GLM程序以87個無性系對應(yīng)的Q值為協(xié)變量，將70個SSR標(biāo)記與生根率進(jìn)行線性回歸分析，結(jié)果檢測到6個扦插生根率的 QTL，分別命名為qRRl~qRRejTL位點(diǎn)qRR3緊密連鎖的標(biāo)記為CB202,解釋的表型變異率為 19 · 16%。CB202的正向引物序列是：5 ' -CTTGGAGCGACGTTTCTTTC-3 '，反向引物序列為：5'_CCAAACATCATCGACAAACG-3'，擴(kuò)增片段大小為95bp。
[0012] 表1 70對SSR引物的擴(kuò)增片段多態(tài)性
【主權(quán)項(xiàng)】
1.楸樹扦插生根率主效QTL位點(diǎn)qRR3的分子標(biāo)記方法，其特征在于：利用SSR分子標(biāo)記 引物CB202的正向引物序列5'-CTTGGAGCGACGTTTCTTTC-3'和反向引物序列5'-CCAAACATCATCGACAAACG-3 '結(jié)合PCR技術(shù)擴(kuò)增楸樹嫩葉的基因組DNA，如果能擴(kuò)增出95bp 的DNA片段，則標(biāo)志著楸樹扦插生根率主效QTL位點(diǎn)qRR3的存在，利用TASSEL2.1軟件的GLM 程序測得對楸樹扦插生根率的貢獻(xiàn)率為19.16%。
【專利摘要】本發(fā)明提供了楸樹扦插生根率主效QTL位點(diǎn)qRR3的分子標(biāo)記方法，屬于分子遺傳學(xué)領(lǐng)域。利用70對SSR分子標(biāo)記確定楸樹87份無性系材料的基因型結(jié)合其扦插生根率進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)連鎖分析，檢測到楸樹扦插生根率主效QTL位點(diǎn)qRR3，解釋19.16%表型變異，SSR分子標(biāo)記CB202與之極顯著相關(guān)。本發(fā)明不但有助于解決我國楸樹育種進(jìn)展遲緩的問題，而且有助于解決現(xiàn)有育種技術(shù)對提高楸樹扦插生根率成本高、時間長、穩(wěn)定性低等技術(shù)難題，大大加快我國楸樹新品種培育與無性系林業(yè)發(fā)展。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開號】CN105420367
【申請?zhí)枴緾N201510956104
【發(fā)明人】王鵬, 楊如同, 李林芳, 李亞, 馬玲玲, 王淑安, 汪慶
【申請人】江蘇省中國科學(xué)院植物研究所
【公開日】2016年3月23日
【申請日】2015年12月21日