抗腫瘤活性α-螺旋多肽及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及WT ρ53抗腫瘤活性α-螺旋多肽及其制備方法，同時(shí)還涉及其在生物學(xué) 上對(duì)腫瘤的治療作用。
【背景技術(shù)】
[0002] 現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為腫瘤是一種基因疾病。ρ53是一種非常重要的人類(lèi)腫瘤抑制基因，它 具有DNA修復(fù)、細(xì)胞周期阻滯、凋亡的功能。由其表達(dá)產(chǎn)生的ρ53蛋白是一種腫瘤抑制功能的 執(zhí)行者。MDM2是1987年發(fā)現(xiàn)的致癌基因。MDM2的表達(dá)產(chǎn)物是一種重要的ρ53負(fù)性調(diào)節(jié)蛋白。 癌基因 MDM2及其表達(dá)產(chǎn)物可與ρ53蛋白結(jié)合，同時(shí)抑制ρ53的正常生物學(xué)功能，從而可導(dǎo)致 腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。
[0003] ρ53腫瘤蛋白是一個(gè)多功能蛋白。在不同形態(tài)(如低氧、熱休克、DNA損傷等）的腫瘤 誘導(dǎo)下，Ρ53抑癌蛋白被激活，直接或間接地通過(guò)其他轉(zhuǎn)錄因子阻止細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋 亡。一旦Ρ53失活或缺失，腫瘤就得到發(fā)生發(fā)展。癌基因 MDM2在很多腫瘤中表現(xiàn)出擴(kuò)增，如： 13 %食道癌、10 %高分化神經(jīng)膠質(zhì)瘤和20 %軟組織肉瘤中都有MDM2的擴(kuò)增。
[0004] Kussie等人于1996年報(bào)道了P53-MDM2復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)。晶體結(jié)構(gòu)表明ρ53和 MDM2蛋白的結(jié)合界面面積為14.98nm2，疏水作用是兩者之間主要的結(jié)合力。晶體結(jié)構(gòu)同時(shí) 表明P53蛋白的N端反式激活區(qū)域與MDM2蛋白的p53結(jié)合區(qū)相互作用，形成p53-MDM2復(fù)合物。 P53的N端17-27位的11個(gè)氨基酸形成的α螺旋復(fù)合物可緊密地嵌合到MDM2的N端103個(gè)(25-127位)氨基酸形成的疏水裂隙中，二者之間主要靠疏水作用結(jié)合。
[0005] Verdine等人于2007年將多肽WT ρ53(17-29位)作為模板，利用側(cè)鏈帶有末端烯烴 的非天然氨基酸替換母體WT ρ53肽鏈上相應(yīng)的氨基酸殘基，然后通過(guò)Grubbs催化劑關(guān)環(huán) "釘合"成具有生物活性的α-螺旋多肽。通過(guò)一系列優(yōu)化實(shí)驗(yàn)最終找到抑制癌細(xì)胞效果最好 的構(gòu)象鎖定多肽 SAH-p53-8(EC50 = 8.8yM)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的一個(gè)目的是針對(duì)WT p53在體內(nèi)穩(wěn)定性差、與靶蛋白結(jié)合能力有限和細(xì)胞 透過(guò)性差等方面的缺陷，設(shè)計(jì)了一系列新的WT p53衍生物。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供該 WT p53衍生物的制備方法。
[0007] WT p53序列：Ac-LSQETFSDLWKLLPEN-NH2
[0008] SAH-p53_8 序列：
[0009]
[0010] 發(fā)明人認(rèn)為，鑒于P53重要的藥學(xué)應(yīng)用價(jià)值，有必要選擇具有生物活性的多肽WT p53和SAH-p53-8作為模板，使用價(jià)格便宜且易得的Cys來(lái)替換母體肽鏈上i/i+7位置上的氨 基酸，然后通過(guò)肽鏈上兩個(gè)半胱氨酸側(cè)鏈的巰基與連接臂環(huán)合形成硫醚橋，來(lái)穩(wěn)定母體多 肽的α-螺旋構(gòu)象，并研究其在提高α-螺旋度、靶蛋白結(jié)合能力、細(xì)胞穿膜性等方面的性質(zhì)， 從而建立一種新型的、簡(jiǎn)單高效的穩(wěn)定合成多肽α_螺旋構(gòu)象的化學(xué)修飾方法，由此完成了 本發(fā)明。
[0011] 發(fā)明人選取WT ρ53和SAH-p53-8作為模板，保持作用位點(diǎn)氨基酸不變，使用便宜易 得的半胱氨酸替換母體肽鏈上相應(yīng)位置的氨基酸殘基，得到如下多肽化合物：
[0012]
[0013] 其中，131/134是在WT ρ53這個(gè)序列上用Cys和D-Cys替換了i/i+7(i = 4)位置上的 氨基酸得到的;004是在SAH-p53-8這個(gè)序列上用Cys替換了 i/i+7(i = 7)位置上的氨基酸得 到的。
[0014] 在以上序列的基礎(chǔ)上，對(duì)替換后的半胱氨酸通過(guò)連接臂（linker)成環(huán)，得到如下9 個(gè)多肽化合物：
[0015]
[0016]
[0017] 所述連接臂（linker)見(jiàn)下表：
[0018]
[0019]本發(fā)明還公開(kāi)了所述FT P53衍生物在制備抗腫瘤藥物中的用途。另外，本發(fā)明還 公開(kāi)了一種藥物，以所述WT p53衍生物為活性成分，用于治療腫瘤。
【附圖說(shuō)明】
[0020]圖1是多肽細(xì)胞穿膜性實(shí)驗(yàn)的熒光照片。
【具體實(shí)施方式】
[0021 ]試劑名稱(chēng)縮寫(xiě)：
[0022] DMF:N，N-二甲基甲酰胺 [0023] DCM:二氯甲烷
[0024] NMP:N-甲基吡咯烷酮
[0025] DIC:N，N_二異丙基碳二亞胺 [0026] TFA:三氟乙酸
[0027] DIPEA:N，N-二異丙基乙胺
[0028] NMM:N-甲基嗎啉
[0029] HOBt: 1-羥基苯并三唑
[0030] H0At:N-羥基-7-氮雜苯并三氮唑
[0031 ] HOOBt: 3-羥基-1，2，3-苯并三嗪-4 (3H)-酮
[0032] Cl-H0Bt:6_氯-1-羥基苯并三氮唑
[0033] HBTU:苯并三氮唑-N，N，N'，N'_四甲基脲六氟磷酸酯
[0034] HATU:2-(7偶氮苯并三氮唑)-N，N，N'，N'_四甲基脲六氟磷酸酯
[0035] PyBOP:六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷
[0036] PyAOP: (3H-1，2，3-三唑并[4，5-b ]吡啶-3-氧基)三-1 -吡咯烷基磷六氟磷酸鹽
[0037] PPTS:對(duì)甲苯磺酸吡啶鹽
[0038] DMP:2,2_二甲氧基丙烷
[0039] EDT:1，2-乙二硫醇
[0040] PIP:哌啶
[0041 ] TIS:三異丙基硅烷
[0042]本發(fā)明中WT p53衍生物改造肽的制備方法采用通常的Fmoc固相合成法合成。
[0043] 實(shí)施例1:
[0044] 原料及試劑:接肽樹(shù)脂為Rink Amide樹(shù)脂。
[0045] 氨基酸衍生物為：Fmoc-Leu-〇H，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-〇H，F(xiàn)moc-Gln(T;rt)-〇H，F(xiàn)moc-Cys (Trt)-〇H，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-〇H，F(xiàn)moc-Phe-〇H，F(xiàn)moc-Asp(OtBu)-〇H，F(xiàn)moc-Trp(Boc)-〇H， Fmoc-Pro-OH，F(xiàn)moc-Glu(OtBu)-〇H，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-〇H;
[0046] (1)制備 H-Asn(Trt)-樹(shù)脂
[0047] 稱(chēng)取2g取代度為0.7mmol/g的Rink Amide樹(shù)脂于固相反應(yīng)器中，加入DCM溶脹 20min，隨后加入20 % PIP/DMF溶液反應(yīng)20min脫除Fmoc保護(hù)基，分別用DCM、Me0H與DMF洗滌 多次，抽干。向固相反應(yīng)器中加入Fmoc-Asn(Trt)-〇H(4mmol)、H0Bt(0 ·648g，4· 8mmol)、DIC (0.7!1^，4.8111111〇1)、01^(1011^)，20°(：反應(yīng)20分鐘。將樹(shù)脂洗滌抽干，即得?111〇(3-4811(1'竹）-樹(shù) 月旨，測(cè)得樹(shù)脂替代度為〇 · 46mmo 1 /g。向樹(shù)脂中加入封閉試劑8mL (醋酸酐（mmo 1): DI PEA (mmo 1) = 1:1)，反應(yīng)2.5h，封閉剩余的氨基，分別用DCM、MeOH與DMF洗滌多次，抽干。用20 % PIP/DMF溶液脫除Fmoc保護(hù)基5min+15min，分別用DMF、DCM與MeOH洗滌多次，抽干，得H-Asn (Trt)_樹(shù)脂。
[0048] (2)制備131樹(shù)脂肽
[0049] 取H-Asn(Trt)-樹(shù)脂（2g)于固相反應(yīng)器中，加入Fmoc-Glu(0tBu)-OH(2.76mmol)、 !108以0.4488,3.312111111〇1)、01(：(0.511^，3.312111111〇1)、01^(1011^)，30°(：反應(yīng)211。偶聯(lián)完成度可 以使用Kaiser測(cè)試檢測(cè)；檢測(cè)通過(guò)后，用20%PIP/DMF溶液脫除Fmoc保護(hù)基5min+15min，分 別用DCM、DMF與MeOH洗滌多次，抽干。
[0050] 以此方法偶聯(lián)剩余的氨基酸，在偶聯(lián)過(guò)程中，偶聯(lián)溶劑選自DCM、DMF和匪P中的任 意一個(gè)或一個(gè)以上的組合;偶聯(lián)體系選自HOBt、H0At、H00Bt和Cl-HOBt中的任意一個(gè)或多個(gè) 與DIC的組合，或選自H0Bt、H0At、H00Bt和Cl-H0Bt中的任意一個(gè)或多個(gè)、DIPEA或NMM中的任 意一個(gè)或兩個(gè)以及HBTU、HATU、PyB0P和PyAOP中的任意一個(gè)或多個(gè)的組合;偶聯(lián)完成后，用 DCM、DMF與MeOH洗滌多次，抽干，得到側(cè)鏈全保護(hù)多肽樹(shù)脂5.45g，封閉氮端的氨基，將此側(cè) 鏈全保護(hù)多肽樹(shù)脂用20 %PIP/DMF溶液5mL反應(yīng)5min+15min，然后抽掉溶液，分別用DMF、DCM 與MeOH洗滌多次，加入封閉試劑1 OmL(醋酸酐（mmo 1): DITOA(mmo 1) = 1:1)，反應(yīng)2 · 5h， Kaiser測(cè)試檢測(cè)通過(guò)后，分別用DMF、DCM與MeOH洗滌多次，抽干。即得131樹(shù)脂肽5.92g。
[0051 ] (3)制備131改造粗肽
[0052] 配置裂解液，其各組分體積比為T(mén)FA: EDT:苯甲醚:苯甲硫醚:水=90.0:2.5:2.5: 2.5:2.5;將裂解液加入固相反應(yīng)器中，室溫震蕩反應(yīng)2h后，將反應(yīng)液注入乙醚中沉淀，離心 收集白色沉淀放入真空干燥器中干燥，即得131改造粗肽3.36g。
[0053] (4)純化131改造粗肽
[0054] 將WT p53改造粗肽用HPLC進(jìn)行純化：層析柱：SinoChrom 0DS-BP(10ym);30.0_X 250mm;檢測(cè)波長(zhǎng)：220nm;梯度洗脫:B% : 32 % -42 % (40min)，洗脫劑A: 0.8%〇HAc/H20，洗脫 劑B:純乙腈;流速15mL/min;收集目標(biāo)肽冷凍干燥，得到131改造肽純品1.2g，純度為96 %。 [0055] (5) 131改造肽成環(huán)
[0056] A、稱(chēng)取0 . lg(4)中凍干得到的131改造純肽純品于50mL圓底燒瓶中，加入5mL乙腈 水溶液(乙腈:水=4:1)溶解，將lmL連接臂1，5-二溴戊烷加入到圓底燒瓶中，加入碳酸氫鈉 調(diào)節(jié)pH至8-9，攪拌反應(yīng)0.5~2h，得反應(yīng)液A，HPLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程。
[0057] B、稱(chēng)取0.1g(4)中凍干得到的WT p53改造肽純品于50mL圓底燒瓶中，加入5mL乙腈 水溶液（乙腈:水=4:1)溶解，將lmL連接臂1，6-二溴己烷加入到圓底燒瓶中，加入碳酸氫鈉