一種激活Nrf2-ARE通路的雙髻鯊魚肉抗氧化肽的用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)的應(yīng)用用途，具體涉及一種激活Nrf2-ARE通路的雙髻鯊魚肉抗氧化肽的用途。
【背景技術(shù)】
[0002]鯊魚全身是寶，有的種類肉質(zhì)鮮美，是餐桌上常見的菜肴。魚皮具有良好的韌性，是皮革加工業(yè)的原料?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)證明鯊魚軟骨也具有很大的藥用價值，1992年美國首先將鯊魚軟骨粉直接用于臨床治療腫瘤。
[0003]雙髻藍(lán)(Sphyrna Iewini)為軟骨魚綱，真藍(lán)目，雙髻藍(lán)科，在我國主要分布于黃海、東海和南海。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種具有激活Nrf2_ARE通路的雙髻鯊魚肉抗氧化肽在肝損傷、皮膚光老化、動脈硬化、中風(fēng)、糖尿病和肥胖等疾病治療藥物方面的應(yīng)用用途。
[0005]本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題所采取的技術(shù)方案為:該抗氧化肽用于制備預(yù)防或治療肝損傷、皮膚光老化、動脈硬化、中風(fēng)、糖尿病和肥胖及其它與Nrf2-ARE通路密切相關(guān)的疾病的食品或保健食品的用途。該抗氧化肽為六肽化合物，氨基酸序列為I Ie-1 Ie-Gly-Leu-Val-Pro (IIGLVP)，ESI_MS測定分子量為610.77 Da。
[0006]該雙髻鯊魚肉抗氧化肽的制備方法為:
1)雙髻鯊魚肉的預(yù)處理:取雙髻鯊魚肉用高速組織搗碎機處理成勻漿，加熱至90?95°C后保溫5?1min，然后按照料液比Ig: 2?4mL加入異丙醇，于25?30°C、功率450?500 W超聲提取2?3 h，然后于4°C、9000~10000 rpm離心10?15min除去異丙醇，收集脫脂雙髻鯊魚肉固形物；
2)脫脂雙髻鯊魚肉固形物的酶解:取脫脂雙髻鯊魚肉固形物，按固液比Ig:1OmL?15mL加入甘氨酸一氫氧化鈉緩沖液(0.05mol/L，pH 9.5)，用0.1 mol/L HCl或0.1 mol/LNaOH調(diào)節(jié)pH到9.0?10.0，得混合液;將混合物溫度調(diào)制55?65°C，按照脫脂雙髻鯊魚肉固形物質(zhì)量的1.2 %?1.5 %加入堿性蛋白酶(酶活力2 1.95X 105 U/g)，酶解時間2 h?2.5h后，酶解液于90?95°C保溫10?15min，滅酶活;將酶解液溫度調(diào)至35?45°C，按照脫脂雙髻鯊魚肉固形物質(zhì)量的1.0 %?1.2%加入胰蛋白酶(酶活力22.5\104 U/g)，酶解時間3 h?4 h，酶解液于90?95°C保溫10?15min后降至室溫，于10000?12000 rpm離心10?15 min，取上清液。
[0007])雙髻鯊魚肉抗氧化肽的分離制備:將上述上清液依次經(jīng)超濾、大孔樹脂純化、凝膠柱層析和RP-HPLC純化，得雙髻鯊魚肉抗氧化肽。
[0008]作為優(yōu)選，所述步驟3)的超濾、大孔樹脂純化、凝膠柱層析和RP-HPLC純化的具體過程為: 超濾:將上述酶解上清液采用I kDa超濾膜進行超濾處理，收集分子量小于I kDa部分，得超濾酶解液。
[0009]大孔樹脂精制:將超濾酶解液配成15?20mg/mL的溶液，緩慢加入到超濾酶解液與DlOl大孔樹脂比為1:10?15的玻璃柱中，用3?5倍柱體積的雙蒸水洗脫除去雜質(zhì)，再用3?4倍柱體積的95%乙醇洗脫，收集95%乙醇洗脫物，噴霧干燥，即為大孔樹脂精制多肽。
[0010]凝膠柱層析:將上述大孔樹脂精制多肽溶于雙蒸水配成濃度為20?30mg/mL的溶液，經(jīng)過葡聚糖凝膠Sephadex G-25柱層析分離，用雙蒸水進行洗脫，流速為0.8?1.2 mL/min，洗出溶液每3 min收集一管并于220 nm檢測，按峰合并試管內(nèi)溶液，比較各峰的輕基自由基的清除活性，選擇活性最強組分凍干，即為凝膠層析酶解物；
RP-HPLC純化:將上述凝膠層析酶解物用雙蒸水配成90?100 yg/mL的溶液，利用RP-HPLC進行純化，根據(jù)對羥基自由基的清除活性得I個高抗氧化活性多肽Ile-1le-Gly-Leu-Val-Pro (IIGLVP)，ESI_MS測定分子量為610.77 Da。
[0011]再優(yōu)選，所述RP-HPLC條件為:進樣量15?20 yL;色譜柱Zorbax SB- Cis(250 mmX4.6 mm,5 μπι)；流動相:水-乙腈梯度洗脫(O?45min乙腈濃度由O勻速升至45%);洗脫速度
0.8~1.0 mL/min;紫外檢測波長220 nm。
[0012]本發(fā)明所提供的一種激活Nrf2_ARE通路的雙髻鯊魚肉抗氧化肽的用途，該抗氧化肽為Ile-1le-Gly-Leu-Val-Pro (IIGLVP) JtDPPHg由基、羥基自由基和超氧陰離子自由基具有良好的清除作用；同時Ile-1le-Gly-Leu-Val-Pro (IIGLVP)還可促進Nrf2蛋白質(zhì)積累，激活Nrf2-ARE通路，進而上調(diào)抗氧化酶和II相解毒酶清除有害物，保護機體免受毒物的損傷。因此，IIe-1le-Gly-Leu-Val-Pro (IIGLVP)可用作治療肝損傷、皮膚光老化、動脈硬化、中風(fēng)、糖尿病和肥胖等與Nrf2-ARE通路密切相關(guān)疾病治療的藥物或功能產(chǎn)品。
【附圖說明】
[0013]圖1是本發(fā)明的葡聚糖凝膠SephadexG_25層析圖。
[0014]圖2葡聚糖凝膠Sephadex G-25制備酶解物的RP-HPLC色譜圖。
[0015]圖3IIe-1Ie-Gly-Leu-Val-Pro (IIGLVP)對Nrf2 蛋白質(zhì)水平的影響。
【具體實施方式】
[0016]以下結(jié)合附圖實施例對本發(fā)明作進一步詳細(xì)描述。
[0017]實施例:
雙髻鯊魚肉抗氧化肽的制備方法，制備工藝流程如下:雙髻鯊魚肉—雙酶酶解—酶解物—超濾—大孔樹脂純化—凝膠過濾層析—高效液相色譜制備—抗氧化肽。
[0018])雙髻鯊魚肉的預(yù)處理:取雙髻鯊魚肉用高速組織搗碎機處理成勻漿，加熱至95°(:后保溫811^11，然后按照料液比18:3 mL加入異丙醇，于25°C、功率500 W超聲提取3 h，然后于4°C、10000 rpm離心10 min除去異丙醇，收集脫脂雙髻鯊魚肉固形物；
2)脫脂雙髻鯊魚肉固形物的酶解:取脫脂雙髻鯊魚肉固形物，按固液比I g:12 mL加入甘氨酸一氫氧化鈉緩沖液(0.05mol/L，pH 9.5)，用0.1 mol/L HCl或0.1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH到9.5，得混合液;將混合物溫度調(diào)制60 0C，按照脫脂雙髻鯊魚肉固形物質(zhì)量的1.2%加入堿性蛋白酶(酶活力2 1.95 X 105 1]/^)，酶解時間2.5 h后，酶解液于95°C保溫15min，滅酶活;將酶解液溫度調(diào)至40 V，按照脫脂雙髻鯊魚肉固形物質(zhì)量的1.0%加入胰蛋白酶(酶活力> 2.5 X 14 U/g)，酶解時間34 h，酶解液于95°C保溫15min后降至室溫，于12000 rpm離心10 min，取上清液。
[0019])雙髻鯊魚肉抗氧化肽的分離制備:將上述上清液依次經(jīng)超濾、大孔樹脂純化、凝膠柱層析和RP-HPLC純化，得雙髻鯊魚肉抗氧化肽。
[0020]①超濾:將上述酶解上清液采用采用IkDa超濾膜進行超濾處理，收集分子量小于I kDa部分，得超濾酶解液。
[0021]②大孔樹脂精制:將超濾酶解液配成20mg/mL的溶液，緩慢加入到濾酶解液與D1I大孔樹脂重量體積比(mg/mL )為1: 15的玻璃柱中，用3倍柱體積的雙蒸水洗脫除去雜質(zhì)，再用4倍柱體積的95%乙醇洗脫，收集95%乙醇洗脫物，噴霧干燥，即為大孔樹脂精制多肽。
[0022]③凝膠柱層析:將上述大孔樹脂精制多肽溶于雙蒸水配成濃度為25mg/mL的溶液，經(jīng)過葡聚糖凝膠Sephadex G-25柱層析分離，用雙蒸水進行洗脫，流速為1.0 mL/min，洗出溶液每3 min收集一管并于220 nm檢測，按峰合并試管內(nèi)溶液，比較各峰的羥基自由基的清除活性，選擇活性最強組分凍干，即為凝膠層析酶解物Fr.3(圖1);
④RP-HPLC純化:將上述凝膠層析酶解物用雙蒸水配成95 yg/mL的溶液，利用RP-HPLC進行純化(再優(yōu)選，所述RP-HPLC條件為:進樣量20 yL;色譜柱Zorbax SB- Cis(250 mmX4.6mm, 5 μπι);流動相:水-乙腈梯度洗脫(O?45min乙腈濃度由O勻速升至45%);洗脫速度0.8mL/min;紫外檢測波長220 nm)，根據(jù)對羥基自由基的清除活性得I個高抗氧化活性多肽(圖
2)0
[0023]⑤結(jié)構(gòu)檢測:收集羥自由基清除活性最高的多肽DCPE-B，經(jīng)RP-HPLC檢測為單一峰，利用蛋白/多肽序列分析儀測定氨基酸序列為Ile-1le-Gly-Leu-Val-Pro (IIGLVP)，ES1-MS測定分子量為610.77 Da。
[0024]自由基清除實驗:將制得的雙髻鯊魚肉抗氧化肽Ile-1le-Gly-Leu-Val-Pro(IIGLVP)進行自由基清除實驗。實驗結(jié)果表明= Ile-1le-Gly-Leu-Val-Pro (IIGLVP)對DPPH自由基(EC50 1.89 mg/mL)、輕基自由基(ECso 0.28 mg/mL)和超氧陰離子自由基(ECso
0.13 mg/mL)具有良好的清除作用。
[0025]抗氧化肽對激活Nrf2/ARE通路的作用:取對數(shù)生長期的人胚腎細(xì)胞株HEK293細(xì)胞接種于60mm皿24小時后，分別加入ΙΟμΜ的酶解液和11 e_I Ie-Gly-Leu-Val-Pro(IIGLVP)，繼續(xù)培養(yǎng)4小時。棄去上清，細(xì)胞用RIPA緩沖液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)裂解，BCA法測定蛋白濃度。每個樣品取20yg蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離，然后按常規(guī)免疫印跡方法檢測Nrf2的蛋白水平。結(jié)果表明Ile-1le-Gly-Leu-Val-Pro (IIGLVP)可促進Nrf2蛋白質(zhì)積累(圖3)，激活Nrf2-ARE通路，進而上調(diào)抗氧化酶和II相解毒酶清除有害物，保護機體免受毒物的損傷。因此，Ile-1le-Gly-Leu-Val-Pro (IIGLVP)可用作治療肝損傷、皮膚光老化、動脈硬化、中風(fēng)、糖尿病和肥胖等與Nrf2-ARE通路密切相關(guān)疾病治療的藥物或功能
τ?: 口廣PR ο
[0026]最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的一個具體實施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護范圍。
【主權(quán)項】
1.一種激活Nrf2-ARE通路的雙髻鯊魚肉抗氧化肽的用途，其特征在于:該抗氧化肽用于制備預(yù)防或治療肝損傷、皮膚光老化、動脈硬化、中風(fēng)、糖尿病和肥胖及與Nrf2-ARE通路引起的疾病的食品或保健食品的用途。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種激活Nrf2-ARE通路的雙髻鯊魚肉抗氧化肽的用途，其特征在于:該抗氧化肽為四肽化合物，氨基酸序列為IIe-1Ie-Gly-Leu-Val-Pro，ESI_MS測定分子量為610.77 Da。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種激活Nrf2-ARE通路的雙髻鯊魚肉抗氧化肽的用途。本發(fā)明以雙髻鯊魚肉為原料，通過雙酶酶解得酶解液，酶解液采用超濾、大孔樹脂純化、凝膠柱層析和反相高效液相色譜分離純化得到抗氧化肽Ile-Ile-Gly-Leu-Val-Pro？(IIGLVP)，ESI-MS測定分子量為610.77？Da；制備的高活性抗氧化肽對DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基具有良好的清除作用；同時亦可促進Nrf2蛋白質(zhì)積累，激活Nrf2-ARE通路，可用作治療肝損傷、皮膚光老化、動脈硬化、中風(fēng)、糖尿病和肥胖等與Nrf2-ARE通路密切相關(guān)疾病治療的藥物和功能產(chǎn)品。
【IPC分類】A61K38/08, A61P39/06, A61P1/16, A61P3/04, A61P17/00, A61P9/10, A23L33/18, A61P3/10, C07K7/06
【公開號】CN105622719
【申請?zhí)枴緾N201610098098
【發(fā)明人】王斌, 趙玉勤, 孫坤來
【申請人】浙江海洋學(xué)院
【公開日】2016年6月1日
【申請日】2016年2月23日