從五指毛桃果中提取喬松素-7-O-β-D-葡萄糖苷的方法及其用圖
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種從五指毛桃果中提取、分離一種黃酮類化合物—喬松素?7?O?β?D?葡萄糖苷的方法及其用途，屬于植物源農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域。具體是通過將五指毛桃果粗提物經(jīng)過大孔樹脂柱層析，Sephadex LH?20凝膠柱層析和重結(jié)晶的方法分離得到化合物，該化合物對(duì)柑橘采后病原菌—意大利青霉具有較好的抑菌活性，對(duì)柑橘青霉病有較好的抗病性，可用于開發(fā)成一種新型的植物源柑橘防腐保鮮劑。
【專利說明】
從五指毛桃果中提取喬松素-7-0-fH)-葡萄糖苷的方法及其 用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于植物源農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到一種從五指毛桃果中提取、分離一 種黃酮類化合物一喬松素m_D_匍萄糖苷的方法及其在柑橘米后保鮮中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 五指毛桃果(Ficus simplicissima Lour.)為?？茻o花果屬植物裂掌格的果實(shí)， 收載于歷年《中國藥典》和多種中藥學(xué)古書籍中。五指毛桃是廣東地區(qū)的道地中藥材，具有 很好的益氣健脾功效，有"廣東人參"之美譽(yù)。五指毛桃性平，味甘、辛，有健脾補(bǔ)肺、利濕舒 筋之功，可用于脾虛浮腫、食少無力、肺癆咳嗽、盜汗、風(fēng)濕痹痛、產(chǎn)后無乳等癥，在廣東民間 使用歷史悠久?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明五指毛桃可以保護(hù)胃黏膜、減輕肝損傷、提高機(jī)體免疫 力、減輕腦缺血缺氧的損害。動(dòng)物急性毒性實(shí)驗(yàn)研究表明小鼠灌服五指毛桃水提物后14d 內(nèi)，動(dòng)物均無死亡，各臟器均無異常。表明五指毛桃毒性極低，生物安全性好。關(guān)于五指毛桃 的抗菌活性研究，僅見五指毛桃水煎煮提取液對(duì)大腸桿菌、枯草芽胞桿菌、金黃色葡萄球菌 有抑制作用。
[0003] 由意大利青霉(Penicillium italicum)引起的青霉病和指狀青霉(Penicillium digitatum)引起的綠霉病，是造成柑橘采后腐爛發(fā)生的最主要的兩種病害，腐爛率一般為 10%~30%，嚴(yán)重時(shí)可高達(dá)40%~50%以上，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。長期以來，主要采用化 學(xué)合成藥劑作為保鮮劑對(duì)柑橘進(jìn)行保鮮，這些化學(xué)殺菌劑能殺死或抑制病原微生物的生 長，有較好的防腐保鮮效果，但同樣會(huì)造成藥劑殘留、污染環(huán)境，抗藥性等弊端。另外，一些 化學(xué)防腐劑有潛在的致癌、致突變、致畸的可能性。
[0004] 近年來，人們開始轉(zhuǎn)向從天然植物中尋找安全環(huán)保的柑橘植物源保鮮劑。天然植 物源保鮮劑具有高效、低毒、低殘留、無污染、使用安全等優(yōu)點(diǎn)，在應(yīng)用上易受消費(fèi)者歡迎。 另外，植物源藥劑不易產(chǎn)生抗藥性和不會(huì)造成環(huán)境污染問題。因此，有必要從天然植物中尋 找、開發(fā)天然植物源防腐劑對(duì)柑橘進(jìn)行保鮮以減少對(duì)化學(xué)藥劑的依賴。
[0005] 喬松素-7-O-0-D-葡萄糖苷是一種黃酮類化合物，目前從植物中分離到此化合物 的報(bào)道較少，主要存在于羽葉金合歡、扯根菜、扁枝槲寄生、南酸棗、老鷹茶、玫瑰花、青皮 木、荔枝核、光果甘草和青錢柳等植物中。尚未見五指毛桃果中喬松素-7-O-0-D-葡萄糖苷 的報(bào)道，本發(fā)明為首次從五指毛桃果中分離得到喬松素-7-O-0-D-葡萄糖苷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種從五指毛桃果中分離得到一種黃酮類化合物一喬松素-7-0-P-D-葡萄糖苷的方法。
[0007] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供喬松素-7-O-0-D-葡萄糖苷在柑橘采后保鮮劑中的應(yīng) 用。
[0008] 本發(fā)明提供的黃酮化合物的結(jié)構(gòu)如下：
[0010]本發(fā)明的上述目的是通過下面的技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的：
[0011] (1)五指毛桃果于鼓風(fēng)干燥箱中40-50°C烘干2h，粉碎機(jī)粉碎后過40目篩，取篩下 藥材粉末，以體積分?jǐn)?shù)為90%的乙醇溶液為提取溶劑，按照料液比(kg: L) = 1: (10-40)超聲 波輔助提取30_90min，超聲波輔助提取的溫度為50-80°C，重復(fù)提取3次，合并提取液并過 濾，回收乙醇，濾液濃縮至無醇味，即得五指毛桃果提取物浸膏；
[0012] (2)將步驟（1)中的五指毛桃果提取物浸膏懸浮于10-20倍浸膏重量的蒸餾水中， 經(jīng)D101大孔樹脂柱層析，先用純水洗脫至流出液無顏色、再分別依次用5倍柱體積30%乙 醇、5倍柱體積50 %乙醇和5倍柱體積95 %乙醇梯度洗脫，收集95 %乙醇洗脫液，濃縮至無醇 味，即得95 %乙醇洗脫濃縮物；
[0013] (3)將步驟(2)中95 %乙醇洗脫濃縮物溶解于甲醇中，95%乙醇洗脫濃縮物與甲醇 的質(zhì)量體積比（g:mL)為（1.0-5.0): 10,將該溶液于離心機(jī)上5000-8000r/min離心3-10min， 取上清液用Sephadex LH-20凝膠柱層析分離，用甲醇洗脫，收集8-10個(gè)柱體積洗脫液，薄層 層析合并目標(biāo)化合物流分，減壓濃縮，向得到的濃縮物中加入甲醇并加熱至濃縮物剛好能 全部溶解為止，放入4 °C冰箱中，析出淡黃色沉淀物即為目標(biāo)化合物。
[0014] 其中步驟(2)采用的大孔樹脂還可為除D101型之外的其他弱極性和低極性大孔樹 脂。
[0015] 本發(fā)明制得的目標(biāo)化合物喬松素-7-O-0-D-葡萄糖苷可添加常規(guī)輔料制成防治柑 橘采后病原菌的藥物組合物，用于柑橘采后防腐保鮮，防治由意大利青霉（Penicillium italicum)引起的青霉病和指狀青霉(Penicillium digitatum)引起的綠霉病。
[0016]王靜等通過系統(tǒng)溶劑萃取老鷹茶提取物，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、水 飽和正丁醇溶劑萃取，再通過大孔樹脂柱分離正丁醇萃取部位，用乙醇-水系統(tǒng)梯度洗脫， 分為10%、30%、50%、95 % 4個(gè)部分，對(duì)95 %部分用硅膠柱進(jìn)行反復(fù)分離，并結(jié)合0DS、 Sephadex LH-20和制備型HPLC分離純化出喬松素-7-O-0-D-葡萄糖苷(王靜，陸維麗，張義 龍，唐敏芳，湯文建，李俊.老鷹茶的化學(xué)成分研究[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2014,49 (4): 479-483.)。付明等通過系統(tǒng)溶劑萃取扯根菜提取物，依次用石油醚、醋酸乙酯、正丁醇萃 取，醋酸乙酯部位反復(fù)經(jīng)硅膠柱色譜、Sephadex LH-20柱色譜和薄層色譜等，最終從醋酸乙 酯部分分離得到喬松素-7-O-0-D-葡萄糖苷(付明，魏麟，余娟，胡朝暾.扯根菜的化學(xué)成分 研究[J].中國藥學(xué)雜志，2013,48(22): 1911-1914)。劉紅燕通過系統(tǒng)溶劑萃取玫瑰花提取 物，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，乙酸乙酯部位反復(fù)經(jīng)硅膠柱色譜、 Sephadex LH-20柱色譜，最終從醋酸乙酯部分分離得到喬松素-7-O-0-D-葡萄糖苷（劉紅 燕.玫瑰花的化學(xué)成分研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2013，25(1): 47-49.)。上述方法都使 用了大量的有機(jī)溶劑，硅膠柱層析，甚至是制備高效液相色譜技術(shù)，需要的成本高，不利于 大樣品量的制備。
[0017]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于有機(jī)溶劑使用量少，操作步驟簡單，適合規(guī)?；a(chǎn)制備喬松 素-7-O-0-D-匍萄糖昔。
【附圖說明】
[0018 ]圖1為實(shí)施例1制得的喬松素m_D_匍萄糖苷的結(jié)構(gòu)式；
[0019]圖2為實(shí)施例1制得的喬松素-7-O-0-D-葡萄糖苷的核磁共振氫譜；
[0020 ]圖3為實(shí)施例1制得的喬松素_7 -O-0-D-葡萄糖苷的核磁共振碳譜；
[0021 ]圖4為喬松素-7-O-0-D-葡萄糖苷對(duì)意大利青霉菌的抑制效果圖；
[0022]圖5為喬松素-7-O-0-D-葡萄糖苷對(duì)意大利青霉菌絲顯微形態(tài)的影響圖；
[0023] 圖6為喬松素-7-O-0-D-葡萄糖苷對(duì)意大利青霉菌絲生長量的影響圖；
[0024] 圖7為喬松素-7-O-0-D-葡萄糖苷對(duì)意大利青霉菌絲相對(duì)電導(dǎo)率的影響圖；
[0025] 圖8為喬松素-7-O-0-D-葡萄糖苷對(duì)意大利青霉菌幾丁質(zhì)酶活性的影響圖；
[0026] 圖9為喬松素-7-O-0-D-葡萄糖苷對(duì)意大利青霉菌0-1，3-葡聚糖酶活性的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0027]實(shí)施例1:化合物的制備方法
[0028]五指毛桃果于鼓風(fēng)干燥箱中45°C烘干2h，粉碎機(jī)粉碎后過40目篩，取篩下的五指 毛桃果粉末5. OKg，用50L體積分?jǐn)?shù)為90 %的乙醇溶液浸泡，超聲波輔助提取60min，提取溫 度為60°C，重復(fù)三次至提取液顏色變淡為止，合并提取液并過濾，濾液在45°C條件下濃縮至 無醇味，共得浸膏350g。將浸膏懸浮于4L蒸餾水中，經(jīng)D101大孔樹脂柱層析，先用純水洗脫 至流出液無顏色、再分別依次用5倍柱體積30 %乙醇、5倍柱體積50 %乙醇和5倍柱體積95 % 乙醇梯度洗脫，水洗脫組分棄用，其他洗脫組分濃縮干燥得干膏，備用。95 %乙醇洗脫物經(jīng) 干燥得到7.5g粉末。將7.5g 95 %乙醇洗脫部位干燥粉末溶解于20mL甲醇中，5000-8000r/ min離心6min，取上清液經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱層析，甲醇洗脫，收集8-10個(gè)柱體積洗脫 液，薄層層析檢測(cè)合并相同流分，得到A~I共8個(gè)流分。經(jīng)檢測(cè)流分E為目標(biāo)化合物流分，取 250mg流分E溶解于3.0-5. OmL甲醇中并加熱使其全部溶解，然后放入4°C冰箱中，經(jīng)甲醇重 結(jié)晶析出淡黃色沉淀物21.5mg。
[0029] 化合物的結(jié)構(gòu)確證JH-匪R(600MHz，DMS0-d6)顯示一個(gè)1-取代苯環(huán)信號(hào)SH 7.55 (211，(1，了 = 7.6泡，11-2'，6'），7.44(311，111，11-3'，4'，5'），以及一對(duì)間位耦合質(zhì)子信號(hào)6.21 (lH，d，J= 1.5Hz，H-8)，6.16(lH，d，J= 1.5Hz，H-6)，還有一個(gè)酚羥基質(zhì)子信號(hào)12.05(5_ 〇11)，5.66(111，(1，了=12.9，11-2)，4.99(111，(1，了 = 7.4泡，11-1"）為糖的端基質(zhì)子，確定其為0-構(gòu)型，13C-NMR(150MHz，DMS0-d6)數(shù)據(jù)顯示該化合物有21個(gè)C，結(jié)合H譜確定化合物為一個(gè)黃 酮糖苷類化合物，ESI-MS給出準(zhǔn)分子離子峰m/z 417.00[M-Hr，其他H信號(hào)如下：3.66(1H， d，J = 9.4Hz，H-6"a)，3.15~3.45(6H，H-3a，2"，3"，4"，5"，6"b)，2.85(lH，d，J=16.7Hz，H-3b) </3C-NMR( 150MHz，DMS0-d6)，79 ? 1 (C-2)，42.6(C-3)，197.3(04)，163.4(C-5)，97.1(C-6)，165.8(C-7)，96.0(C-8)，163.0(C-9)，103.7(C-10)，138.9(C-1'），127.2(02'，6'）， 129.1(03'，4'，5'），100.0(C-l"），73.5(C-2"），76.8(C-3"），69.9(C-4"），77.6(C-5"）， 61.0(C_6"）。鑒定該黃色沉淀物為喬松素-7-0-0-D-匍萄糖昔。
[0030] 實(shí)施例2:化合物抑制柑橘采后意大利青霉菌活性
[0031 ] 1材料意大利青霉(Penicillium italicum，ACCC 30399)購于中國農(nóng)業(yè)微生物菌 種保藏中心。培養(yǎng)基:PDA和(不含瓊脂粉的PDA)培養(yǎng)基;細(xì)胞壁降解酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基(KN03 2.0g，K2HP〇4 1.0g，MgS〇4.7H20 0.5g，KCl 0.5g，F(xiàn)eS〇4 O.Olg，維生素出 0.1g，L-天門冬酰 胺 0.5g，幾丁質(zhì)或葡聚糖、CMC 10.0g，H2〇 1000mL)，pH 調(diào)至 5.0,分裝后 121°C 滅菌 20min。 [0032] 2實(shí)驗(yàn)方法
[0033] ①喬松素 -7-O-0-D-葡萄糖苷對(duì)意大利青霉菌的抑制效果
[0034] 采用生長速率法測(cè)定喬松素-7-O-0-D-葡萄糖苷對(duì)意大利青霉菌絲生長的抑制毒 力。從已活化的意大利青霉菌落邊緣用滅菌的打孔器打取菌餅（〇 =5mm)，菌絲面朝下放置 于已經(jīng)凝固的含藥培養(yǎng)基中央，27°C培養(yǎng)。每個(gè)處理4次重復(fù)，試驗(yàn)重復(fù)2次。培養(yǎng)7d后十字 交叉法測(cè)量菌落直徑，與空白對(duì)照比較，采用下面公式計(jì)算各濃度藥物處理對(duì)菌絲生長的 抑制率。根據(jù)生物統(tǒng)計(jì)幾率值換算表，將抑制百分率換算成幾率值，采用DPS 7.05軟件以試 驗(yàn)中設(shè)定的濃度為橫坐標(biāo)，抑制幾率值為縱坐標(biāo)，得到藥劑的毒力回歸方程和有效濃度EC50 和 EC95。
[0036]②喬松素-7-O-0-D-葡萄糖苷對(duì)意大利青霉菌絲形態(tài)的影響 [0037] 將喬松素溶液加入50mL PDB培養(yǎng)基的三角瓶中，使其終濃度達(dá)到0.2528mg ? mL一1 (EC5Q與EC95之和的一半），不加喬松素-7-CH3-D-葡萄糖苷溶液作為對(duì)照組，向每個(gè)三角瓶 中加入200yL意大利青霉菌懸液，置于27°C，180rpm振蕩培養(yǎng)24和48h后，在10x40倍電子顯 微鏡下觀察。
[0038] ③喬松素 -7-O-0-D-葡萄糖苷對(duì)意大利青霉菌孢子萌發(fā)的影響
[0039] 無菌條件下，配制意大利青霉孢子懸浮液，用移液器按9:1比例將菌懸液與不同濃 度的喬松素-7-O-0-D-葡萄糖苷溶液滴入凹玻片凹槽中，使喬松素-7-O-0-D-葡萄糖苷作用 的終濃度為0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025mg ? mL-1，每個(gè)處理重復(fù)3次。將玻片置于27°C培 養(yǎng)，24h后進(jìn)行鏡檢，觀察各處理和對(duì)照組的意大利青霉孢子的萌發(fā)情況，在顯微鏡下統(tǒng)計(jì) 100-150個(gè)孢子的萌發(fā)數(shù)，計(jì)算孢子萌發(fā)率和抑制率。
[0042]④喬松素-7-O-0-D-葡萄糖苷對(duì)意大利青霉菌絲生長量的影響 [0043]在無菌的條件下，取l.OmL菌懸液加入裝有100mL PDB液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶 中，27°C、180rpm振蕩培養(yǎng)48h，待菌絲球生長良好時(shí)加入喬松素-7-O-0-D-葡萄糖苷處理 液，使終濃度為0.2528mg ? ml/1，對(duì)照加入等量的無菌水。分別在繼續(xù)培養(yǎng)的0、3、6、12、24h 取樣，用布氏漏斗抽濾收集菌絲，用蒸餾水對(duì)菌絲沖洗3次后，在真空冷凍干燥機(jī)中將菌絲 凍干至恒重，即為菌絲體的重量。每個(gè)處理重復(fù)5次，試驗(yàn)重復(fù)2次。
[0044]⑤喬松素 -7-O-0-D-葡萄糖苷對(duì)意大利青霉菌細(xì)胞膜透性影響
[0045]電導(dǎo)率法測(cè)定:取1 .OmL菌懸液加入裝有100mL PDB液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中， 27°C、180rpm振蕩培養(yǎng)48h。稱取等量的菌絲分別放入裝有100mL0.2528mg ? mL-1喬松素-7- O-0-D-葡萄糖苷溶液和lOOmL無菌水的250mL三角瓶中，在27°C、180rpm的搖床上繼續(xù)培養(yǎng)， 在處理0、1、2、4、6h取樣，在轉(zhuǎn)速為3000rpm離心10min，采用DDS-11A數(shù)顯電導(dǎo)率儀測(cè)定對(duì)照 組和喬松素-7-O-0-D-匍萄糖苷處理的溶劑空白電導(dǎo)率(Co)和上清液的電導(dǎo)率(Ct)，最后將 菌絲沸水浴保溫lOmin，待冷卻至室溫后，測(cè)定其電導(dǎo)率(Cd)。每個(gè)處理重復(fù)三次。用相對(duì)電 導(dǎo)率(relative electric conductivity，REC)來表示細(xì)胞膜透性，相對(duì)電導(dǎo)率（％ )的計(jì)算 公式如下：
[0047]⑥幾丁質(zhì)酶(Chitinase，CHI)活性的測(cè)定
[0048] 幾丁質(zhì)酶液的提取:取1.(^菌絲，加入511^乙酸-乙酸鈉緩沖液(含0.謂4115.2，含 5mM0-巰基乙醇；ImM聚乙二醇6000;lmM EDTA;4%PVP和0.05%Triton X-100)，冰浴下研磨 呈勻漿后離心(4°C、12 000rpm，20min)，收集上清液備用。
[0049] 幾丁質(zhì)酶活性的測(cè)定參考Boiler的方法并稍作改進(jìn)，以每毫克蛋白酶解膠狀幾丁 質(zhì)產(chǎn)生1 X 10-9moL N-乙酰葡萄糖胺為一個(gè)CHI活性單位(U ? mg-protein)。
[0050] ⑦0-1，3-葡聚糖酶(0-1，3飛111(^1^此，61〇])活性的測(cè)定
[0051] 0-1，3-葡聚糖酶液的提取方法與幾丁質(zhì)酶液的提取方法相同。0-1，3-葡聚糖酶活 性測(cè)定參考Abeles和Forrence的方法并稍作改進(jìn)，以菌絲中每毫克蛋白分解昆布多糖產(chǎn)生 lyg葡萄糖為1個(gè)GLU活性單位(U ? mg-iprotein)。
[0052]⑧數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 19.0和DPS 7.05數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分 析，用Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行顯著性差異分析，顯著性差異水平：顯著(P〈0.05);極顯著(P〈 0.01);采用Excel 2003軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及圖形制作。
[0053] 3實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0054] ①喬松素-7-O-0-D-葡萄糖苷對(duì)意大利青霉菌的抑制效果
[0055] 試驗(yàn)結(jié)果如說明書附圖中圖4所示，隨著化合物處理濃度的逐漸升高，其對(duì)意大利 青霉的抑菌效果也逐漸增強(qiáng)；當(dāng)處理濃度為〇.8mg ? ml/1時(shí)，對(duì)意大利青霉的抑菌率達(dá)到 100%，完全抑制了意大利青霉的生長。采用DPS v8.05軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得到以抑菌率幾 率值為Y，藥劑濃度(0 ? 025~0 ? 4mg ? mL-〇對(duì)數(shù)值為X的毒力回歸方程:Y = 7 ? 8219+3 ? 1150X， 相關(guān)系數(shù)r為0.9836,說明喬松素-7-O-0-D-葡萄糖苷的處理濃度與抑菌率呈顯著的線性關(guān) 系；同時(shí)也計(jì)算出EC 5q和EC95分別為0.0846和0.4209mg ? mL一、
[0056] ②喬松素-7-O-0-D-葡萄糖苷對(duì)意大利青霉菌絲形態(tài)的影響
[0057]試驗(yàn)結(jié)果如說明書附圖中圖5所示，對(duì)照組的意大利青霉菌絲細(xì)胞壁光滑、粗細(xì)一 致、分枝正常、內(nèi)部原生質(zhì)分布均勻（圖5A);喬松素-7-O-0-D-葡萄糖苷處理12h后，意大利 青霉菌絲頂端膨大，菌絲纏繞扭結(jié)、粗細(xì)不均（圖5B);處理24h后的菌絲細(xì)長、皺縮、分枝增 多，甚至出現(xiàn)內(nèi)含物消解、菌絲空腔和斷裂現(xiàn)象(圖5C)。
[0058]③喬松素-7-O-0-D-葡萄糖苷對(duì)意大利青霉菌孢子萌發(fā)的影響 [0059]由表1可看出，不同濃度的喬松素-7-O-0-D-葡萄糖苷處理對(duì)意大利青霉的孢子萌 發(fā)有顯著的抑制作用。隨著處理濃度的增加，意大利青霉菌的孢子萌發(fā)率均逐漸減少，抑制 效果增強(qiáng)，且各處理與對(duì)照組之間的差異極顯著(P〈〇. 01)。當(dāng)喬松素-7-O-0-D-葡萄糖苷處 理濃度為〇. 4mg ? ml/1時(shí)，該處理的孢子萌發(fā)率僅為3.5 %，抑制率高達(dá)96.3 %。綜上所述，喬 松素-7-O-0-D-葡萄糖苷對(duì)意大利青霉的孢子萌發(fā)具有顯著的抑制效果。
[0060]表1喬松素 -7-O-0-D-葡萄糖苷對(duì)意大利青霉孢子萌發(fā)的抑制作用
[0062]注:表中數(shù)據(jù)為三次重復(fù)的平均值土標(biāo)準(zhǔn)方差，同列有不同大小寫字母的表示經(jīng) 鄧肯氏多重檢驗(yàn)分別在0.01及0.05水平差異顯著。
[0063]④喬松素-7-O-0-D-葡萄糖苷對(duì)意大利青霉菌絲生長量的影響
[0064] 由說明書附圖中圖6可知，在整個(gè)培養(yǎng)期間，對(duì)照組的菌絲生長量呈上升趨勢(shì)，至 24h時(shí)，生長量達(dá)到最大值，菌絲干重為1.22±0.032g ? 100mL 1;而加入喬松素-7-O-0-D-葡 萄糖苷(0.2528mg ? ml/1)處理的培養(yǎng)基中菌絲生長明顯受到抑制，培養(yǎng)6h內(nèi)，菌絲的生長量 急劇下降，隨后下降較為平緩，至24h時(shí)菌絲的生長量達(dá)到最小值，干重為0.53±0.011g* 100ml/ 1，僅為同期對(duì)照組菌絲干重的43.4%。由此可見，喬松素對(duì)意大利青霉的菌絲生長具 有顯著的抑制效果。
[0065] ⑤喬松素 -7-O-0-D-葡萄糖苷對(duì)意大利青霉菌細(xì)胞膜透性的影響
[0066] 細(xì)胞膜遭到破壞時(shí)，菌體內(nèi)部電解質(zhì)會(huì)泄漏外滲到菌液中，從而使菌液的電導(dǎo)率 升高，菌絲相對(duì)電導(dǎo)率的大小可以間接反映細(xì)胞膜透性的完整性。由說明書附圖中圖7可 知，對(duì)照組的相對(duì)電導(dǎo)率呈緩慢上升的變化趨勢(shì);喬松素-7-O-0-D-葡萄糖苷處理組相對(duì)電 導(dǎo)率隨處理時(shí)間而逐漸升高，其上升幅度顯著高于對(duì)照組(P〈〇.05)，說明隨著時(shí)間的延長， 意大利青霉的細(xì)胞膜透性逐漸增加，細(xì)胞中大量的內(nèi)含物向外滲漏，使得菌液電導(dǎo)率快速 上升，破壞細(xì)胞膜透性的完整性。
[0067] ⑥喬松素-7-O-0-D-葡萄糖苷對(duì)意大利青霉細(xì)胞壁降解酶活性的影響
[0068] 喬松素-7-O-0-D-葡萄糖苷對(duì)意大利青霉細(xì)胞壁降解酶活性的影響結(jié)果見說明書 附圖中的圖8。從圖8可以看出，對(duì)照組的菌絲幾丁質(zhì)酶(CHI)活性呈緩慢下降趨勢(shì)，在整個(gè) 培養(yǎng)期間沒有顯著差異;而喬松素-7-O-0-D-葡萄糖苷處理的菌絲CHI活性先顯著上升，在 處理2h時(shí)達(dá)到最大值，隨后緩慢下降。在處理2、4、6h時(shí)的CHI活性分別為55.6、50.7和 52.2U ?mgiprotein，均比同期對(duì)照組的CHI活性高，由此可見喬松素顯著提高意大利青霉 細(xì)胞降解酶CHI活性。
[0069] 喬松素-7-O-0-D-葡萄糖苷同樣也會(huì)增加意大利青霉菌中另外一個(gè)細(xì)胞壁降解相 關(guān)酶0-1，3_葡聚糖酶(GLU)活性的變化，它是分解真菌細(xì)胞壁的一種溶菌酶。由說明書附圖 中圖9可知，對(duì)照組的菌絲0-1，3-葡聚糖酶(GLU)活性呈緩慢上升的變化趨勢(shì);而喬松素-7-O-0-D-葡萄糖苷處理的菌絲0-1，3-葡聚糖酶(6〇])活性呈急劇上升趨勢(shì)，且上升幅度顯著 大于對(duì)照組。在處理2、4、6h時(shí)的GLU活性分別為5 ? 59、5 ? 17和6 ? 23U ? mg-protein，均比同期 對(duì)照組的GLU活性高，可見GLU活性的增高會(huì)引起意大利青霉菌細(xì)胞壁發(fā)生自溶現(xiàn)象。
【主權(quán)項(xiàng)】
1 · 一種從五指毛桃果中提取喬松素_7-〇-β-?-匍萄糖苷的方法，其特征在于:所述喬松 素-7-0-?Η)_葡萄糖苷的結(jié)構(gòu)如下：2. 如權(quán)利要求1所述的一種從五指毛桃果中提取喬松素-7-〇-β-?-匍萄糖苷的方法，其 特征在于:包括以下步驟： (1) 五指毛桃果于鼓風(fēng)干燥箱中40-50°C烘干2h，粉碎機(jī)粉碎后過40目篩，取篩下藥材 粉末，以體積分?jǐn)?shù)為90%的乙醇溶液為提取溶劑，按照料液比(kg: L) = 1: (10-40)超聲波輔 助提取30_90min，超聲波輔助提取的溫度為50-80°C，重復(fù)提取3次，合并提取液并過濾，回 收乙醇，濾液濃縮至無醇味，即得五指毛桃果提取物浸膏； (2) 將步驟（1)中的五指毛桃果提取物浸膏懸浮于10-20倍浸膏重量的蒸餾水中，經(jīng) D101大孔樹脂柱層析，先用純水洗脫至流出液無顏色、再分別依次用5倍柱體積30%乙醇、5 倍柱體積50 %乙醇和5倍柱體積95 %乙醇梯度洗脫，收集95 %乙醇洗脫液，濃縮至無醇味， 即得95%乙醇洗脫濃縮物； (3) 將步驟(2)中95 %乙醇洗脫濃縮物溶解于甲醇中，95 %乙醇洗脫濃縮物與甲醇的質(zhì) 量體積比（g:mL)為（1 · 0-5 ·0): 10，將該溶液于離心機(jī)上5000-8000r/min離心3-10min，取上 清液用Sephadex LH-20凝膠柱層析分離，用甲醇洗脫，收集8-10個(gè)柱體積洗脫液，薄層層析 合并目標(biāo)化合物流分，減壓濃縮，向得到的濃縮物中加入甲醇并加熱至濃縮物剛好能全部 溶解為止，放入4 °C冰箱中，析出淡黃色沉淀物即為目標(biāo)化合物。3. 如權(quán)利要求2所述的一種從五指毛桃果中提取喬松素-7-〇-β-?-匍萄糖苷的方法，其 特征在于：包括以下步驟：五指毛桃果于鼓風(fēng)干燥箱中45°C烘干2h，粉碎機(jī)粉碎后過40目 篩，取篩下的五指毛桃果粉末5. OKg，用50L 90 %乙醇浸泡，超聲波輔助提取60min，提取溫 度為60°C，重復(fù)三次至提取液顏色變淡為止，合并提取液并過濾，濾液在45°C條件下濃縮至 無醇味，共得浸膏350g;將浸膏懸浮于4L蒸餾水中，經(jīng)D101大孔樹脂柱層析，先用純水洗脫 至流出液無顏色、再分別依次用5倍柱體積30 %乙醇、5倍柱體積50 %乙醇和5倍柱體積95 % 乙醇梯度洗脫，水洗脫組分棄用，其他洗脫組分濃縮干燥得干膏，備用；95 %乙醇洗脫物經(jīng) 干燥得到7.5g粉末，將7.5g 95 %乙醇洗脫部位干燥粉末溶解于20mL甲醇中，5000-8000r/ min離心6min，取上清液經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱層析，甲醇洗脫，收集8-10個(gè)柱體積洗脫 液，薄層層析檢測(cè)合并相同流分，得到A~I共8個(gè)流分;經(jīng)檢測(cè)流分E為目標(biāo)化合物流分，取 250mg流分E溶解于3.0-5. OmL甲醇中并加熱使其全部溶解，然后放入4°C冰箱中，經(jīng)甲醇重 結(jié)晶析出淡黃色沉淀物21.5mg。4. 權(quán)利要求1所述化合物在制備柑橘采后防腐保鮮劑中的應(yīng)用，其特征在于:所述柑橘 采后病原菌選自意大利青霉和指狀青霉。5. -種防治柑橘采后病原菌的藥物組合物，其特征在于：包括權(quán)利要求1所述的化合 物。
【文檔編號(hào)】C07H1/08GK105820201SQ201610322974
【公開日】2016年8月3日
【申請(qǐng)日】2016年5月13日
【發(fā)明人】萬春鵬, 陳楚英, 陳明, 陳金印
【申請(qǐng)人】江西農(nóng)業(yè)大學(xué)