一種木聚糖酶熱敏突變體及其制備方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明是一種木聚糖酶熱敏突變體，該突變體序列如SEQ ID No.1所示，制備方法包括：1)將突變序列s02b12和表達載體相連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，獲得包含s02b12的重組菌株；2)培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組突變木聚糖酶表達；3)回收并純化所表達的突變木聚糖酶S02B12；4)木聚糖酶S02B12的活力測定。本發(fā)明突變酶S02B12最適pH為5.5、溫度為50℃，經(jīng)胰蛋白酶和蛋白酶K在37℃下處理1h，酶活幾乎無損失，與野生酶相比，突變木聚糖酶S02B12的熱性質(zhì)發(fā)生了改變，其在60℃時活性更低，在37℃失活更迅速，其在37℃下的半衰期小于5min，可應(yīng)用于低溫生物技術(shù)等領(lǐng)域，特別是食品行業(yè)。
【專利說明】
一種木聚糖酶熱敏突變體及其制備方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程及蛋白質(zhì)改造技術(shù)領(lǐng)域，具體來說是一種木聚糖酶熱敏突變 體及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 植物細胞壁是地球上含量豐富的生物質(zhì)，主要由木質(zhì)素、纖維素和半纖維素組成。 木聚糖是半纖維素中最豐富的一種多糖，其降解依賴木聚糖酶。木聚糖酶將木聚糖降解為 木寡糖和/或木糖，因此木聚糖酶可調(diào)節(jié)植物細胞生長，并可應(yīng)用于飼料、食品、釀酒、紡織 及造紙等領(lǐng)域。
[0003] 熱敏感的酶熱穩(wěn)定性差，容易熱失活。該特性使酶的催化反應(yīng)得以簡易控制，在低 溫生物技術(shù)等領(lǐng)域具有應(yīng)用的價值，特別是當(dāng)催化底物中存在熱敏感的物質(zhì)時，該特性使 酶更具應(yīng)用優(yōu)勢。例如，木聚糖酶可輔助果汁澄清，但果汁里的維生素C和B族屬于熱敏感物 質(zhì)，不宜加熱;利用熱敏感的木聚糖酶，可在低溫處理果汁，然后在較低的溫度下使酶失活， 既避免果汁中的營養(yǎng)流失及風(fēng)味改變，又易于控制果汁的澄清度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是針對上述技術(shù)存在的問題，提供一種木聚糖酶熱敏突變體及其制 備方法。
[0005] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:一種木聚糖酶突變體S02B12，所述突 變體S02B12的氨基酸序列如SEQ ID No.l所示。
[0006] 本發(fā)明的第二目的是提供一種木聚糖酶突變體S02B12編碼基因，其核苷酸序列如 SEQIDNo.2**。
[0007] 本發(fā)明的第三目的是提供一種包含有突變木聚糖酶基因s02bl2的重組載體。
[0008] 本發(fā)明的第四目的是提供一種包含有突變木聚糖酶基因 S〇2bl2的重組菌。
[0009] 本發(fā)明的第五目的是提供一種木聚糖酶突變體S02B12在食品加工的中應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明根據(jù)GenBank記錄的節(jié)桿菌（Arthrobacter sp .)木聚糖酶核苷酸序列 JQ863105(SEQ ID No.3)和列舍瓦里爾菌（Lechevalieria sp.)JF745868(SEQ ID No.4)， 利用易錯PCR和DNA Family shuffling PCR的方法，以70°C為條件，篩選獲得突變體 S02B12。突變體S02B12的氨基酸序列如SEQ ID No.l所示，其是JQ863105和JF745868編碼氨 基酸序列的雜合序列。
[0011]本發(fā)明制備突變木聚糖酶S02B12的方法按以下步驟進行：
[0012] 1)將s02bl2和表達載體pEasy-E2相連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21-Gold (DE3)，獲得包含S〇2bl2的重組菌株；
[0013] 2)培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組突變木聚糖酶表達；
[0014] 3)回收并純化所表達的突變木聚糖酶S02B12;
[0015] 4)木聚糖酶S02B12的活性測定。
[0016]與野生酶相比，突變木聚糖酶S02B12的熱性質(zhì)發(fā)生了改變，其對熱更敏感，純化的 突變酶S02B12、野生純化酶rXynAGN16L和rXynAHJ3的最適溫度分別為50 °C、50 °C和75 °C，在 l〇°C分別具有25.4%、38.3%和13.5%的酶活，在60°(：分別具有61.8%、85.9%和92.7%的 酶活;rXynAHJ3在37°C下穩(wěn)定，rXynAGN16L在37°C時半衰期約為60min，而S02B12在37°C迅 速失活，其半衰期小于5min。
[0017]本發(fā)明的有益技術(shù)效果是:本發(fā)明突變酶S02B12最適pH為5.5，最適溫度為50°C， 經(jīng)胰蛋白酶和蛋白酶K在37°C下處理lh，S02B12的酶活幾乎無損失，與野生酶相比，突變木 聚糖酶S02B12的熱性質(zhì)發(fā)生了改變，其在60°C時活性更低，在37 °C失活更迅速，其在37 °C下 的半衰期小于5min，可應(yīng)用于低溫生物技術(shù)等領(lǐng)域，特別是食品行業(yè)。
【附圖說明】
[0018]為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn) 有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本 發(fā)明的一些實施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動性的前提下，還可 以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。
[0019] 圖1:在大腸桿菌中表達的重組木聚糖酶rXynAGN16L、rXynAHJ3及其突變體S02B12 的SDS-PAGE分析，其中，CK:蛋白質(zhì)Marker;
[0020] 圖2:重組木聚糖酶rXynAGN16L、rXynAHJ3及其突變體S02B12的pH活性；
[0021] 圖3:重組木聚糖酶rXynAGN16L、rXynAHJ3及其突變體S02B12的pH穩(wěn)定性；
[0022] 圖4:重組木聚糖酶rXynAGN16L、rXynAHJ3及其突變體S02B12的熱活性；
[0023] 圖5:重組木聚糖酶rXynAGN16L、rXynAHJ3及其突變體S02B12的熱穩(wěn)定性；
【具體實施方式】
[0024]下面將結(jié)合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完 整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于 本發(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他 實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。
[0025] 試驗材料和試劑
[0026] 1、菌株及載體:大腸桿菌Escherichia coli BL21_Gold(DE3)和表達載體pEasy- E2購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；節(jié)桿菌（Art hr obac ter sp.)和列舍瓦里爾菌 (Lechevalieria sp.)由云南師范大學(xué)提供。
[0027] 2、酶類及其它生化試劑:DNA聚合酶及dNTP購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，山 毛櫸木聚糖購自Sigma公司，易錯PCR試劑盒購自北京天恩澤基因科技有限公司，細菌基因 組提取試劑盒購自GENE STAR公司，PopCulture?細胞裂解液購自德國默克集團有限公司， 其它都為國產(chǎn)試劑(均可從普通生化試劑公司購買得到）。
[0028] 3、培養(yǎng)基：
[0029] LB培養(yǎng)基：Peptone 10g，Yeast extract 5g，NaCl 10g，加蒸饋水至 1000ml，pH自 然(約為7)。固體培養(yǎng)基在此基礎(chǔ)上加2.0% (w/v)瓊脂。
[0030] 說明：以下實施例中未作具體說明的分子生物學(xué)實驗方法，均參照《分子克隆實驗 指南》(第三版)J.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說明書 進行。
[0031] 實施例1:突變文庫的構(gòu)建
[0032] 按照GENE STAR公司細菌基因組提取試劑盒說明書提取節(jié)桿菌(Arthrobacter sp ?)和列舍瓦里爾菌(Lechevalieria sp.)基因組。根據(jù)GenBank木聚糖酶序列JQ863105和 JF745868,設(shè)計引物5'GTCTCGGCCCCGCCGGACGT 3'和5'GGCTCGCTTCGCCAGCGTGG 3'，以列舍 瓦里爾菌(Lechevalieria sp.)基因組為模板進行PCR擴增，獲得木聚糖酶基因xynAHJ3,另 設(shè)計引物5'GTGCAGCCGGAGGAAAAACG 3'和5'GATGAAGGCAGGATCCGGGGT 3'，以節(jié)桿菌 (Arthrobacter sp.)基因組為模板進行PCR擴增，獲得木聚糖酶基因xynAGN16L。
[0033] PCR反應(yīng)參數(shù)為：94°C變性5min;然后94°C變性30sec，55°C退火30sec，72°C延伸 lmin 30sec，30個循環(huán)后72°C保溫lOmin。
[0034]以上述PCR產(chǎn)物為模板，利用易錯PCR試劑盒，按照試劑盒說明書進行基因突變。用 超聲打斷儀8;1〇1'1^丨61'對易錯?0?產(chǎn)物進行超聲隨機打斷，打斷產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳 后切膠純化。
[0035] 純化后的小片段DNA自身互為引物和模板進行DNA Family shuffling PCR，PCR反 應(yīng)參數(shù)為：96°C變性lmin 30sec;然后94°C變性30sec，依次65°C退火90sec、62°C退火 90sec、59°C 退火 90sec、56°C 退火 90sec、53°C 退火 90sec、5(TC 退火 90sec、47°C 退火 90sec、 44°C退火90sec、41°C退火90sec，72°C延伸lmin 30sec，35個循環(huán)后72°C保溫7min。
[0036] 以純化的DNA Family shuffling PCR產(chǎn)物為模板，用木聚糖酶基因xynAHJ3和 xynAGN16L擴增引物和反應(yīng)條件進行序列全長擴增，含突變序列和未突變序列。將序列全長 擴增產(chǎn)物和表達載體pEasy-E2相連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21-G 〇ld(DE3)，經(jīng)過 夜培養(yǎng)，從轉(zhuǎn)化平板中挑取單菌落于含有150yL液體LB培養(yǎng)液(含100yg mdmp)的96孔細 胞培養(yǎng)板中，于37°C，快速振蕩培養(yǎng)約16h后，每孔加入40% (w/w)的甘油50此，混勻后于-70 °C保存。
[0037]實施例2:突變體的篩選
[0038]從保存突變文庫的96孔細胞培養(yǎng)板中取2yL菌液，接種于含200yL/孔液體LB培養(yǎng) 液(含l〇〇yg mL-Imp)的96深孔板中，于37°C，200rpm振蕩培養(yǎng)至0D_>1.0(約20h)，加入含 2mM IPTG和100yg mL-Imp的200yL液體LB培養(yǎng)液，于20°C，160rpm過夜誘導(dǎo)。誘導(dǎo)結(jié)束后加 入40yL/孔的PopCulture?細胞裂解液，在25 °C下，震蕩裂解細胞30min。取50yL含1.0 % (w/ v)山毛櫸木聚糖的Mcllvaine緩沖液(pH=7.0)及50yL細胞裂解產(chǎn)物，在96深孔板中于70°C 恒溫箱中反應(yīng)2h。反應(yīng)結(jié)束后加入150yL DNS試劑終止反應(yīng)，于140°C恒溫箱中保溫20min以 上并冷卻至室溫，使用酶標儀讀取ODw?的值，以只含有PEASY-E2空載體的E.coli BL21-Gold(DE3)菌株裂解液反應(yīng)組作為對照。比較突變體與野生重組酶rXynAGN16L和rXynAHJ3 的酶活大小，獲得熱穩(wěn)定性降低的1個突變體，編號為S02B12,該突變體氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示，該突變體核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0039] 實施例3:突變體S02B12及野生酶rXynAGN16L和rXynAHJ3的酶制備
[0040] 將突變體S02B12、野生酶rXynAGN16L和rXynAHJ3以0.1%的接種量分別接種于1^ (含100yg mPAmp)培養(yǎng)液中，37°C快速振蕩16h。然后將此活化的菌液以1 %接種量接種到 新鮮的LB (含100yg mPAmp)培養(yǎng)液中，快速振蕩培養(yǎng)約2-3h (0D6QQ達到0.6-1.0)后，加入終 濃度0.1 mM的IPTG進行誘導(dǎo)，于20°C繼續(xù)振蕩培養(yǎng)約20h。12000rpm離心5min，收集菌體。用 適量的pH=7.0Tris-HCl緩沖液懸浮菌體后，于低溫水浴下超聲波破碎菌體。以上胞內(nèi)濃縮 的粗酶液經(jīng)13000rpm離心10min后，吸取上清并用Nickel-NTA Agarose和0-500mM的咪唑分 別親和和純化目的蛋白。SD S -PAGE結(jié)果（圖1)表明，突變酶SO 2 B12、野生酶r Xy n AGN16 L和 rXynAHJ3都獲得了純化，產(chǎn)物為單一條帶。
[0041 ] 實施例4:突變體S02B12及野生酶rXynAGN16L和rXynAHJ3的純化酶的性質(zhì)測定 [0042] (1)、突變體S02B12及野生酶rXynAGN16L和rXynAHJ3的純化酶的活性分析
[0043]活性測定方法采用3，5 -二硝基水楊酸(DNS)法:將底物溶于緩沖液中，使其終濃 度為0.5% (w/v);反應(yīng)體系含100此適量酶液，900yL底物;底物在反應(yīng)溫度下預(yù)熱5min后， 加入酶液后再反應(yīng)l〇min，然后加1.5mL DNS終止反應(yīng)，沸水煮5min，冷卻至室溫后在540nm 波長下測定0D值；1個酶活單位(U)定義為在給定的條件下每分鐘分解底物產(chǎn)生lymol還原 糖（以木糖計)所需的酶量。
[0044] (2)、突變體S02B12及野生酶rXynAGN16L和rXynAHJ3的純化酶的pH活性和pH穩(wěn)定 性測定：
[0045] 酶的最適pH測定:將酶液置于37°C下和pH = 4.0-12.0的緩沖液中進行酶促反應(yīng)。 酶的pH穩(wěn)定性測定：將酶液置于pH= 3.0-12.0的緩沖液中，在37°C下處理lh，然后在pH = 7.0及37°C下進行酶促反應(yīng)，以未處理的酶液作為對照。緩沖液為:Mcllvaine buffer(pH= 3.0-8.0)和0.1]?817(^116-恥011(口11=9.0-12.0)。以山毛櫸木聚糖為底物，反應(yīng)10111111，測定 純化的木聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)。結(jié)果表明：S02B12和rXynAGN16L的最適pH均為5.5，rXynAHJ3 的最適pH為6.0(圖2);在pH=7.0和pH=8.0時，S02B12的穩(wěn)定性與野生酶rXynAGN16L相似， 而在pH=6 ? 0和pH=9 ? 0-11 ? 0，S02B12的穩(wěn)定性差，其酶活低于rXynAGN16L和rXynAHJ3的酶 活20%以上（圖3)。
[0046] (3)、突變體S02B12及野生酶rXynAGN16L和rXynAHJ3的純化酶的熱活性及熱穩(wěn)定 性測定：
[0047]酶的熱活性測定:在pH = 7.0的緩沖液中，于0-90°C下進行酶促反應(yīng)。酶的熱穩(wěn)定 性測定:將同樣酶量的酶液置于37°C處理0-60min后，在pH = 7.0及37°C下進行酶促反應(yīng)，以 未處理的酶液作為對照。以山毛櫸木聚糖為底物，反應(yīng)lOmin，測定純化的木聚糖酶的酶學(xué) 性質(zhì)。結(jié)果表明：S02B12、rXynAGN16L和rXynAHJ3的最適溫度分別為50°C、50°C和75°C，在10 °(：分別具有25.4%、38.3%和13.5%的酶活，在60°(：分別具有61.8%、85.9%和92.7%的酶 活（圖4);rXynAHJ3 在 37°C 下穩(wěn)定，rXynAGN16L 在 37°C 時半衰期約為 60min，而 S02B12 在 37°C 迅速失活，其半衰期小于5min(圖5)。
[0048] (4)、蛋白酶抗性測定：
[0049] 酶的蛋白酶抗性：用相當(dāng)于重組酶10倍(w/w)的胰蛋白酶(pH=7.5)和蛋白酶K(pH =7.5)在37 °C對重組酶處理lh，然后在pH=7.0及37 °C下進行酶促反應(yīng)，以置于蛋白酶對應(yīng) pH緩沖液中但未加蛋白酶的酶液作為對照。結(jié)果表明：經(jīng)胰蛋白酶和蛋白酶K在37 °C下處理 lh，S02B12、rXynAGN16L 和 rXynAHJ3 的酶活幾乎無損失。
[0050] 本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，除非另外定義，這里使用的所有術(shù)語(包括技術(shù)術(shù) 語和科學(xué)術(shù)語)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員的一般理解相同的意義。還應(yīng)該 理解的是，諸如通用字典中定義的那些術(shù)語應(yīng)該被理解為具有與現(xiàn)有技術(shù)的上下文中的意 義一致的意義，并且除非像這里一樣定義，不會用理想化或過于正式的含義來解釋。
[0051]最后所應(yīng)說明的是：以上實施例僅用以說明而非限制本發(fā)明的技術(shù)方案，盡管參 照上述實施例對本發(fā)明進行了詳細說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)該理解:依然可以對本 發(fā)明進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明的精神和范圍的任何修改或局部替換，其均 應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。
【主權(quán)項】
1. 一種木聚糖酶突變體S02B12,其特征在于，所述突變體S02B12的氨基酸序列如SEQ ID No. 1 所示。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述木聚糖酶突變體S02B12，其特征在于，所述突變體S02B12編碼基 因 s02bl2的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述包含有突變木聚糖酶基因 S〇2bl2的重組載體。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述包含有突變木聚糖酶基因 S〇2bl2的重組菌。5. 根據(jù)權(quán)利要求1~4任一項所述木聚糖酶突變體S02B12在食品加工中的應(yīng)用。6. 根據(jù)權(quán)利要求1~4任一項所述木聚糖酶突變體S02B12的制備方法，其特征在于，步 驟包括： 1) 將S〇2bl2和表達載體pEasy-E2相連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21-Gold (DE3)，獲得包含S〇2bl2的重組菌株； 2) 培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組突變木聚糖酶表達； 3) 回收并純化所表達的突變木聚糖酶S02B12; 4) 木聚糖酶S02B12的活性測定。
【文檔編號】C12N15/56GK105821022SQ201610334847
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年5月19日
【發(fā)明人】周峻沛, 張蕊, 黃遵錫, 沈驥冬, 唐湘華, 李俊俊, 吳倩, 慕躍林
【申請人】云南師范大學(xué)