一種人干性記憶t細(xì)胞庫的構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種人干性記憶T細(xì)胞庫的構(gòu)建方法，包括以下步驟：(1)人外周血的采集；(2)外周血單個核細(xì)胞的分離；(3)初始T細(xì)胞的分選；(4)干性記憶T細(xì)胞的制備；(5)細(xì)胞凍存；(6)編碼入庫。本發(fā)明通過采用體外定向誘導(dǎo)的方法，可在短時間內(nèi)獲得足量的干性記憶T細(xì)胞(TSCM)并對其進(jìn)行建庫，該方法所需外周血體量小，具有成本低、實(shí)驗(yàn)室條件要求不高，操作簡單等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】
一種人干性記憶T細(xì)胞庫的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種人外周血免疫細(xì)胞庫的構(gòu)建方法，尤其涉及一種人干性記憶T細(xì)胞庫的構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002]人外周血中含有多種免疫細(xì)胞，其中淋巴細(xì)胞是人體主要的免疫細(xì)胞類型，包括T細(xì)胞、B細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞等，目前臨床研究及應(yīng)用上進(jìn)行的免疫細(xì)胞治療以T細(xì)胞為主，如TCR或CAR-T技術(shù)。自體來源的T細(xì)胞由于沒有免疫原性可直接用于回輸進(jìn)行腫瘤等疾病治療，同時其具有的記憶性特征在一定程度上還可以抑制疾病的復(fù)發(fā)。T細(xì)胞可從人外周血單個核細(xì)胞(PBMC)中分離獲得，但由于外周血通常采自腫瘤或病毒感染的患者，體質(zhì)虛弱，增加了采集的難度，同時其免疫細(xì)胞的增殖和抗疾病能力已經(jīng)大大下降；而且已有研究表明，隨著年齡的增長免疫細(xì)胞的生理功能也會逐漸下降，因此儲存人體健康和年輕時期的免疫細(xì)胞，以便在出現(xiàn)疾病的時候進(jìn)行治療或年老時進(jìn)行回輸增強(qiáng)免疫力方面意義重大。
[0003]近期，在人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)一種T細(xì)胞亞群，命名為干性記憶T細(xì)胞(stem memory Tcells,TSCM)，該細(xì)胞不僅具有很強(qiáng)的存活能力和抗腫瘤功能，而且具有干細(xì)胞的特性，能分化為中樞性記憶性T細(xì)胞(central memory T cel I s，TCM)、效應(yīng)性記憶性T細(xì)胞(effector memory T cells，TEM)和效應(yīng)性T細(xì)胞(effector T cells，TE)，保證機(jī)體具有持續(xù)不斷的抗腫瘤和抗感染能力；同時又能進(jìn)行自我更新，維持體內(nèi)的TSCM數(shù)量。
[0004]在表型上，TSCM和初始T細(xì)胞具有共同的表型特征CD45RA+、CD45R0-、CCR7+和CD27+，區(qū)別是其能高表達(dá)⑶95和⑶122，而其他記憶T細(xì)胞亞群也高表達(dá)⑶95和⑶122。在功能上，和其他類型T細(xì)胞相比，TSCM過繼性回輸后在體內(nèi)的存活更具持久性，可以產(chǎn)生更持續(xù)的免疫應(yīng)答，顯示更好的抗腫瘤響應(yīng)。同時TSCM具有干細(xì)胞的特性，在治療的制備和量的需求上相對于其他細(xì)胞會小很多，可以大大縮短制備的時間和體外擴(kuò)增所需要的費(fèi)用。因此，TSCM細(xì)胞庫的建立在免疫治療中具有巨大的應(yīng)用前景。
[0005]由于TSCM在人循環(huán)外周血中所占的比例較低，約占T細(xì)胞的2-4%，而即使采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分離，大約每250個PBMC細(xì)胞才能分離I個CD4+TSCM細(xì)胞，而每500-1000個PBMC細(xì)胞才能分離I個CD8+TSCM細(xì)胞，對于規(guī)?；募?xì)胞庫構(gòu)建來說，這種方法顯然效率低下，對外周血的需求量大，制備費(fèi)用昂貴。
[0006]因此，如何研發(fā)一種對外周血的需求量小、制作成本低并且操作簡單的人干性記憶T細(xì)胞庫的構(gòu)建方法已成為目前研究的重點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]鑒于現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種人干性記憶T細(xì)胞庫的構(gòu)建方法，本發(fā)明通過體外定向分化的方法進(jìn)行TSCM細(xì)胞庫的構(gòu)建，所需外周血體量小，具有成本低、實(shí)驗(yàn)室條件要求不高，操作簡單，應(yīng)用廣等優(yōu)點(diǎn)，從而推動TSCM細(xì)胞庫的建設(shè)。
[0008]為達(dá)此目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:[0009 ] 一種人干性記憶T細(xì)胞庫的構(gòu)建方法，該方法包括以下步驟:
[0010](I)人外周血的采集；
[0011](2)外周血單個核細(xì)胞的分離；
[0012](3)初始T細(xì)胞的分選:采用免疫磁珠法對分離所得外周血單個核細(xì)胞進(jìn)行初始T細(xì)胞的分選，抗體選用CD45RA和CD45R0的組合或CD45RA、CD45R0和CD95的組合；
[0013](4)干性記憶T細(xì)胞的制備;
[0014](5)細(xì)胞凍存；
[0015](6)編碼入庫。
[0016]本發(fā)明在進(jìn)行初始T細(xì)胞的分選時，采用免疫磁珠法對分離所得外周血單個核細(xì)胞進(jìn)行初始T細(xì)胞的分選，其抗體可以采用CD45RA和CD45R0的組合或CD45RA、CD45R0和CD95的組合形式，優(yōu)選采用⑶45RA、CD45R0和⑶95的組合。本發(fā)明通過采用上述抗體組合形式，尤其是采用CD45RA、CD45R0和CD95的組合，其能夠獲得純度更高的靶向細(xì)胞，對于細(xì)胞的質(zhì)量控制非常關(guān)鍵。
[0017]根據(jù)本發(fā)明，步驟(I)所述人外周血的采集可以采用如下方法進(jìn)行:采集外周血前，參與人應(yīng)簽署知情同意書，進(jìn)行體格檢查，需符合國家《血站基本標(biāo)準(zhǔn)》中有關(guān)血液采集的規(guī)定，利用人工或采血機(jī)進(jìn)行外周血的采集，并將其存放于采血袋中。
[0018]根據(jù)本發(fā)明，步驟(2)所述外周血單個核細(xì)胞的分離方法是:將采集的外周血進(jìn)行分裝和離心，取上清液得到自體血漿;分離下層血細(xì)胞，將其離心后得到外周血單個核細(xì)胞。
[0019]優(yōu)選地，所述外周血的離心是在室溫下進(jìn)行的；離心的轉(zhuǎn)速優(yōu)選為1500-2000rpm，例如 1500rpm、1600rpm、1650rpm、1700rpm、1800rpm、1900rpm、1950rpm 或2000rpm，離心的時間優(yōu)選為10-15min，例如 lOmin、10.5min、llmin、12min、12.5min、13min、14min 或 15min。
[0020]本發(fā)明中，將外周血離心后，取上清液得到自體血漿，通常是將其置于-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0021]優(yōu)選地，所述下層血細(xì)胞的分離是采用生理鹽水對其進(jìn)行稀釋，將稀釋后的血細(xì)胞加入淋巴細(xì)胞液液面上方進(jìn)行分離；其中生理鹽水與下層血細(xì)胞可以按1:1的比例進(jìn)行配制；另外，還需將稀釋后的下層血細(xì)胞加入到1-3倍體積的淋巴細(xì)胞分離液液面上方進(jìn)行離心。
[0022]優(yōu)選地，所述下層血細(xì)胞的離心是在室溫下進(jìn)行；離心的轉(zhuǎn)速優(yōu)選為1800-2000rpm，例如 1800rpm、1820rpm、1850rpm、1870rpm、1900rpm、1920rpm、1950rpm 或 2000rpm，離心的時間優(yōu)選為20_30min，例如20min、20.5min、21min、22min、22.5min、23min、24min、25min、28min、29min或30mino
[0023]本發(fā)明中，將下層血細(xì)胞進(jìn)行離心后，需將白膜層轉(zhuǎn)移至另一離心管，收集得到的成分即是外周血單個核細(xì)胞。
[0024]示例性地，步驟(2)所述外周血單個核細(xì)胞的分離過程具體如下:
[0025]將采集的外周血分裝到離心管中，1500-2000rpm室溫離心10-15min，取上清液得至IJ自體血漿，置于-20°C保存?zhèn)溆?分離自體血漿后，用生理鹽水按1:1的比例稀釋下層血細(xì)胞，將稀釋的血細(xì)胞加入到1-3倍體積的淋巴細(xì)胞分離液液面上方，1800-2000rpm室溫離心20-30min，離心后將白膜層轉(zhuǎn)移至另一離心管，收集得到的成分即是外周血單個核細(xì)胞。
[0026]根據(jù)本發(fā)明，步驟(3)所述抗體⑶45RA采用正分選法，CD45R0和⑶95采用負(fù)分選法。
[0027]優(yōu)選地，步驟(3)所述抗體選用CD45RA、CD45R0和CD95的組合形式，其中，抗體⑶45RA采用正分選法，CD45R0和⑶95采用負(fù)分選法。采用該組合形式的抗體能夠最大程度地提高靶向細(xì)胞的純度和質(zhì)量。
[0028]根據(jù)本發(fā)明，步驟(4)所述干性記憶T細(xì)胞的制備方法是:先對初始T細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，收集、洗滌誘導(dǎo)培養(yǎng)后的細(xì)胞，再對其進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。
[0029]本發(fā)明通過利用初始T細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)后擴(kuò)增，能夠使初始T細(xì)胞在外周血單個核細(xì)胞(PBMC)的含量達(dá)到約50%，在較少血液量的條件下，能夠誘導(dǎo)擴(kuò)增出滿足建庫所需的細(xì)胞數(shù)量，而且成本相對較低，操作也較為簡單。
[0030]優(yōu)選地，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)采用誘導(dǎo)培養(yǎng)液對初始T細(xì)胞進(jìn)行懸浮，并調(diào)整細(xì)胞終濃度至0.5-1.5 X 16個/mL，放置于37 °C、5 % CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)7_12天。
[0031]優(yōu)選地，所述擴(kuò)增培養(yǎng)采用擴(kuò)增培養(yǎng)液進(jìn)行細(xì)胞懸浮，并調(diào)整細(xì)胞終濃度至0.5-
1.5X 106^/mL，放置于37 °C、5 % CO2培養(yǎng)箱擴(kuò)增。
[0032]優(yōu)選地，所述擴(kuò)增培養(yǎng)還包括當(dāng)細(xì)胞濃度超過2.5-5X16個/mL時進(jìn)行分流培養(yǎng)。
[0033]根據(jù)本發(fā)明，步驟(4)所述誘導(dǎo)培養(yǎng)液的組成為:以RPMI1640液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加5-20 %的血清替代物、1.5-2.5mM L-谷氨酰胺、100單位的青霉素、10yg的鏈霉素、1-4父106個磁珠/11^抗0)3/0)28磁珠、3-1(^]\1 113119、0-20即/1^的重組人白介素2、20-30即/mL重組人白介素7和20-30ng/mL重組人白介素15。
[0034]優(yōu)選地，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)液的組成為:以RPMI1640液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加10%的血清替代物、2.0mM L-谷氨酰胺、100單位的青霉素、10yg的鏈霉素，2 X 16個磁珠/mL抗CD3/CD28磁珠、7μΜ TWSl 19、5ng/mL的重組人白介素2、25ng/mL重組人白介素7和25ng/mL重組人白介素15。
[0035]本發(fā)明中所述誘導(dǎo)培養(yǎng)液對于⑶4+和⑶8+T細(xì)胞類型都能夠較好地適用，滿足對該類T細(xì)胞充分誘導(dǎo)培養(yǎng)的要求。
[0036]根據(jù)本發(fā)明，步驟(4)所述擴(kuò)增培養(yǎng)液的組成為:以RPMI1640液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加5-20 %的血清替代物、1.5-2.5mM L-谷氨酰胺、100單位的青霉素、10yg的鏈霉素、1-4X 16個磁珠/mL抗⑶3/⑶28磁珠、0-15ng/mL的重組人白介素2、3-8ng/mL重組人白介素7和3-8呢/11^重組人白介素15。
[0037]優(yōu)選地，所述擴(kuò)增培養(yǎng)液的組成為:以RPMI1640液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加15%的血清替代物、2.0mM L-谷氨酰胺、100單位的青霉素、10yg的鏈霉素、I X 16個磁珠/mL抗⑶3/⑶28磁珠、5ng/mL重組人白介素7和5ng/mL重組人白介素15。
[0038]本發(fā)明中所述擴(kuò)增培養(yǎng)液對于⑶4+和⑶8+T細(xì)胞類型也都能較好地適用，滿足對該類T細(xì)胞充分?jǐn)U增培養(yǎng)的要求，并使其在較少血液量的條件下，能夠誘導(dǎo)擴(kuò)增出滿足建庫所需的細(xì)胞數(shù)量，而且成本相對較低，操作也較為簡單。
[0039]根據(jù)本發(fā)明，步驟(5)所述細(xì)胞凍存的方法包括:采用細(xì)胞凍存液在_196°C?-165°(:的溫度下進(jìn)行凍存，例如在-196°(:、-190°(:、-185°(:、-180°(:、-175°(:或-165°(:的溫度下進(jìn)行凍存。
[0040]優(yōu)選地，所述細(xì)胞凍存液由10% DMSO和90%自體血漿組成。
[0041]優(yōu)選地，所述細(xì)胞凍存前還包括對細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞無菌性、細(xì)胞純度和細(xì)胞身份進(jìn)行檢測和鑒定。
[0042]優(yōu)選地，所述細(xì)胞無菌性采用全自動細(xì)菌/分枝桿菌培養(yǎng)監(jiān)測系統(tǒng)進(jìn)行。
[0043]優(yōu)選地，所述細(xì)胞純度采用鱟試劑法進(jìn)行。
[0044]優(yōu)選地，所述細(xì)胞身份采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行。
[0045]本發(fā)明中，當(dāng)擴(kuò)增培養(yǎng)的干性記憶T細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)量達(dá)到1-5X 18時，達(dá)到凍存要求，此時需對其進(jìn)行細(xì)胞數(shù)量與活率的檢測，通常是采用全自動細(xì)菌/分枝桿菌培養(yǎng)監(jiān)測系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)胞無菌性檢測，采用PCR法進(jìn)行支原體檢測，采用鱟試劑法進(jìn)行細(xì)胞純度檢測，采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞身份鑒定。當(dāng)檢測結(jié)果符合要求時，以1-5 X 17個/mL凍存細(xì)胞放置于細(xì)胞凍存液中，使細(xì)胞最終在_196°C?_165°C溫度下長期儲存，其中儲存的裝置可以采用液氮罐，或者采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的儲存裝置。
[0046]示例性地，步驟(5)所述細(xì)胞凍存的方法具體包括如下操作:
[0047]當(dāng)擴(kuò)增培養(yǎng)的干性記憶T細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)量達(dá)到1-5X 18時，達(dá)到凍存要求，進(jìn)行細(xì)胞數(shù)量與活率檢測，全自動細(xì)菌/分枝桿菌培養(yǎng)監(jiān)測系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)胞無菌性檢測，PCR法進(jìn)行支原體檢測，鱟試劑法進(jìn)行細(xì)胞純度檢測，流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞身份鑒定，當(dāng)檢測結(jié)果符合要求時，以1-5 X 17個/mL凍存細(xì)胞，細(xì)胞凍存液由10 % DMSO和90 %自體血漿組成，細(xì)胞最終在-196°C?_165°C液氮罐中長期儲存。
[0048]根據(jù)本發(fā)明，步驟(6)所述編碼入庫的方法是:對凍存的細(xì)胞進(jìn)行編碼，貼上二維碼，并將個人信息、儲存位置及編號錄入信息系統(tǒng)中，用于檢索和管理；
[0049]優(yōu)選地，所述二維碼包含區(qū)域代碼、類型代碼、年份、流水號和分管號。
[0050]本發(fā)明中所述人干性記憶T細(xì)胞庫的構(gòu)建方法，其具有所需外周血體量小及費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)主要是針對從外周血中直接提取TSCM而言的，由于TSCM在人循環(huán)外周血中所占的比例較低，約占T細(xì)胞的2-4%，使用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分離，大約每250個PBMC細(xì)胞才能分離I個CD4+TSCM細(xì)胞，而每500-1000個PBMC細(xì)胞才能分離I個CD8+TSCM細(xì)胞，采用磁珠法分離獲得的數(shù)量就更低了，就本發(fā)明所進(jìn)行的PBMC分離方法來看，最好的10mL血液能提取大約IX 18個PBMC O
[0051]而對于細(xì)胞庫的構(gòu)建來說，其實(shí)針對個人所需要的細(xì)胞量是很大的，一般凍存濃度為17個/mL，每管凍存lmL，至少需要凍存10管，所需要的TSCM的數(shù)量至少為I X 18個，這樣的細(xì)胞量如果直接從外周血中分離即使⑶4+TSCM細(xì)胞大約也需要25000mL血液的量，這是不切合實(shí)際的；或者人們會考慮首先從10ml提取TSCM后再在體外進(jìn)行擴(kuò)增，10mL最大理論來算含CD4+TSCM也只有4X 15個，由于其本身在PBMC中含量就低，流式或磁珠法分離的效果并不理想，操作相對也繁瑣，同時加大了后續(xù)的擴(kuò)增工作量，所需耗材和人工成本增加，效率低下。而本發(fā)明利用初始T細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)后擴(kuò)增，初始細(xì)胞在PBMC達(dá)到約50 %的含量，在較少血液量的條件下，能夠誘導(dǎo)擴(kuò)增出滿足建庫所需的細(xì)胞數(shù)量，成本相對較低，操作也較為簡單。
[0052 ]示例性地，本發(fā)明所述人干性記憶T細(xì)胞庫的構(gòu)建方法，具體可以包括以下步驟:
[0053](I)外周血的采集:供體應(yīng)查體符合獻(xiàn)血標(biāo)準(zhǔn)；
[0054](2)外周血單個核細(xì)胞的分離:將采集的外周血分裝到離心管中，1500-2000rpm室溫離心10-15min，取上清液得到自體血漿，置于-20°C保存?zhèn)溆茫环蛛x自體血漿后，用生理鹽水按I: I的比例稀釋下層血細(xì)胞，將稀釋的血細(xì)胞加入到1-3倍體積的淋巴細(xì)胞分離液液面上方，1800-2000rpm室溫離心20-30min，離心后將白膜層轉(zhuǎn)移至另一離心管，收集得到的成分即是外周血單個核細(xì)胞；
[0055](3)初始T細(xì)胞的分選:采用免疫磁珠法對分離所得外周血單個核細(xì)胞進(jìn)行初始T細(xì)胞的分選，抗體選用⑶45RA、CD45R0和⑶95組合，其中⑶45RA采用正分選法，CD45R0和⑶95采用負(fù)分選法；
[0056](4)干性記憶T細(xì)胞的制備:用生理鹽水或PBS對所得初始T細(xì)胞進(jìn)行洗滌，300-400g室溫離心3-5min，并用誘導(dǎo)培養(yǎng)液對細(xì)胞進(jìn)行懸浮，調(diào)整細(xì)胞終濃度至0.5-1.5 X 16個/mL，放置于37 °C,5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)7_12天，對細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo);收集、洗滌誘導(dǎo)后的細(xì)胞，300-400g室溫離心3-5min，加入擴(kuò)增培養(yǎng)液進(jìn)行細(xì)胞懸浮、計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞終濃度至0.5-
1.5X 1fMVmL，放置于37°C、5 %⑶2培養(yǎng)箱擴(kuò)增，當(dāng)細(xì)胞濃度超過2.5-5 X 16個/mL時進(jìn)行分流培養(yǎng)；
[0057]所述誘導(dǎo)培養(yǎng)液的組成為:以RPMI1640液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加5-20%的血清替代物、1.5-2.5mM L-谷氨酰胺、100單位的青霉素、10yg的鏈霉素、1-4 X 16個磁珠/mL抗CD3/CD28磁珠、3-1 ΟμΜ TWSl 19、0_20ng/mL的重組人白介素2、20_30ng/mL重組人白介素7和20-30呢/11^重組人白介素15;
[0058]所述擴(kuò)增培養(yǎng)液的組成為:以RPMI1640液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加5-20%的血清替代物、1.5-2.5mM L-谷氨酰胺、100單位的青霉素、10yg的鏈霉素、1-4 X 16個磁珠/mL抗CD3/CD28磁珠、0-15ng/mL的重組人白介素2、3_8ng/mL重組人白介素7和3_8ng/mL重組人白介素15;
[0059](5)細(xì)胞凍存:當(dāng)擴(kuò)增培養(yǎng)的干性記憶T細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)量達(dá)到1-5X 18時，達(dá)到凍存要求，進(jìn)行細(xì)胞數(shù)量與活率檢測，全自動細(xì)菌/分枝桿菌培養(yǎng)監(jiān)測系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)胞無菌性檢測，PCR法進(jìn)行支原體檢測，鱟試劑法進(jìn)行細(xì)胞純度檢測，流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞身份鑒定，當(dāng)檢測結(jié)果符合要求時，以1-5 X 17個/mL凍存細(xì)胞，細(xì)胞凍存液由10 % DMSO和90%自體血漿組成，細(xì)胞最終在_196°C?_165°C液氮罐中長期儲存；
[0060](6)編碼入庫:對凍存的細(xì)胞進(jìn)行編碼，貼上唯一的二維碼，二維碼包含區(qū)域代碼、類型代碼、年份、流水號和分管號，并將個人信息、儲存位置及編號錄入信息系統(tǒng)中，用于檢索和管理。
[0061]與現(xiàn)有技術(shù)方案相比，本發(fā)明至少具有以下有益效果:
[0062](I)本發(fā)明通過體外定向分化的方法進(jìn)行TSCM細(xì)胞庫的構(gòu)建，所需外周血體量小，具有成本低、實(shí)驗(yàn)室條件要求不高，操作簡單，應(yīng)用廣等優(yōu)點(diǎn)，從而推動TSCM細(xì)胞庫的建設(shè)；
[0063](2)本發(fā)明通過采用抗體組合形式，尤其是采用⑶45RA、CD45R0和⑶95的組合，其能夠獲得純度更高的靶向細(xì)胞，對于細(xì)胞的質(zhì)量控制非常關(guān)鍵；
[0064](3)本發(fā)明通過利用初始T細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)后擴(kuò)增，能夠使初始T細(xì)胞在外周血單個核細(xì)胞(PBMC)的含量達(dá)到約50%，在較少血液量的條件下，能夠誘導(dǎo)擴(kuò)增出滿足建庫所需的細(xì)胞數(shù)量，而且成本相對較低，操作也較為簡單；
[0065](4)本發(fā)明中所述誘導(dǎo)培養(yǎng)液和擴(kuò)增培養(yǎng)液對于CD4+和CD8+T細(xì)胞類型都能夠較好地適用，滿足對該類T細(xì)胞充分誘導(dǎo)培養(yǎng)的要求。
【附圖說明】
[0066]圖1是本發(fā)明所述人干性記憶T細(xì)胞庫的構(gòu)建方法流程圖。
[0067]圖2是細(xì)胞儲存參與者健康信息采集表。
[0068]圖3是入庫細(xì)胞樣本編碼不意圖。
[0069]下面對本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明。但下述的實(shí)例僅僅是本發(fā)明的簡易例子，并不代表或限制本發(fā)明的權(quán)利保護(hù)范圍，本發(fā)明的保護(hù)范圍以權(quán)利要求書為準(zhǔn)。
【具體實(shí)施方式】
[0070]下面結(jié)合附圖并通過【具體實(shí)施方式】來進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。
[0071 ]圖1示出了本發(fā)明所述人干性記憶T細(xì)胞庫的構(gòu)建方法流程圖，其具體流程如下:
[0072](I)人外周血的米集；
[0073](2)單個核細(xì)胞的分離；
[0074](3)初始T細(xì)胞的分選；
[0075](4)經(jīng)定向誘導(dǎo)進(jìn)行干性記憶T細(xì)胞的制備；
[0076](5)細(xì)胞凍存；
[0077](6)統(tǒng)一編碼入庫。
[0078]圖2示出了細(xì)胞儲存參與者健康信息采集表，其具體采集信息包括:參與者姓名、年齡/出生日期、血型、血常規(guī)情況等信息。
[0079]圖3示出了入庫細(xì)胞樣本編碼示意圖，其包含區(qū)域代碼、類型代碼、年份、流水號和分管號等信息。
[0080]為更好地說明本發(fā)明，便于理解本發(fā)明的技術(shù)方案，本發(fā)明的典型但非限制性的實(shí)施例如下:
[0081 ] 實(shí)施例1
[0082 ] 一種人干性記憶T細(xì)胞庫的構(gòu)建方法，其包括以下步驟:
[0083](I)人外周血的采集
[0084]細(xì)胞儲存參與者簽署知情同意書，體檢結(jié)果顯示其血常規(guī)和乙肝、丙肝、梅毒、艾滋病、谷丙轉(zhuǎn)氨酶的檢測均符合國家《血站基本標(biāo)準(zhǔn)》中有關(guān)血液采集的規(guī)定；手動采集60mL外周血于含有抗凝劑的采血袋中，4°C保存，并盡快送到細(xì)胞制備室。
[0085](2)分離和凍存血漿
[0086]在潔凈臺把采血袋中的血液轉(zhuǎn)移到離心管，使用經(jīng)滅菌消毒的剪刀剪斷塑料管，小心把袋中的外周血傾倒入離心管，1800rpm室溫離心12min，離心完畢后吸取上層血漿到新離心管，放置于_20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0087](3)分離PBMC
[0088]將采集的外周血分裝到離心管中，1500rpm室溫離心lOmin，取上清液得到自體血漿，置于-20°C保存?zhèn)溆?；分離自體血漿后，用生理鹽水按1:1的比例稀釋下層血細(xì)胞，將稀釋的血細(xì)胞懸液緩慢勻速地加入到Ficoll-Paque?淋巴細(xì)胞分離液上方，2000rpm室溫離心25min，離心完畢后，離心管內(nèi)出現(xiàn)分層，小心將白膜層轉(zhuǎn)移至另一離心管，收集得到的成分即可獲得PBMC。
[0089](4)初始T細(xì)胞的分選
[0090]采用免疫磁珠法對分離所得PBMC進(jìn)行初始T細(xì)胞的分選，抗體選用CD45RA和⑶45R0組合，其采用先進(jìn)行⑶45RA正分選，然后對所得細(xì)胞再進(jìn)行⑶45R0負(fù)分選，所得細(xì)胞即為初始T細(xì)胞。
[0091](5)TSCM 的制備
[0092]用生理鹽水對所得初始T細(xì)胞進(jìn)行洗滌，400g室溫離心4min，并用誘導(dǎo)培養(yǎng)液對細(xì)胞進(jìn)行懸浮，調(diào)整細(xì)胞終濃度至I X 1MVmL，放置于37 °C、5 % CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)10天，對細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo);收集、洗滌誘導(dǎo)后的細(xì)胞，400g室溫離心4min，加入擴(kuò)增培養(yǎng)液進(jìn)行細(xì)胞懸浮、計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞終濃度至I X 16個/mL，放置于37 °C,5% CO2培養(yǎng)箱擴(kuò)增，當(dāng)細(xì)胞濃度超過2.5 X16個/ mL時進(jìn)行分流培養(yǎng)；
[0093]誘導(dǎo)培養(yǎng)液的組成為:以RPMI1640液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加10%的血清替代物、2.0mM L-谷氨酰胺、100單位的青霉素和10yg的鏈霉素、2 X 16個磁珠/mL抗⑶3/⑶28磁珠、7μΜ TWSl 19、5ng/mL的重組人白介素2(IL-2)、25ng/mL重組人白介素7(IL-7)和25ng/mL重組人白介素15(IL-15)。
[0094]擴(kuò)增培養(yǎng)液的組成為:以RPMI1640液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加10%的血清替代物、2.0mM L-谷氨酰胺、100單位的青霉素和10yg的鏈霉素、I X 16個磁珠/mL抗⑶3/⑶28磁珠、Ong/mL的重組人白介素2(IL-2)、5ng/mL重組人白介素7(IL-7)和5ng/mL重組人白介素15(IL-15)0
[0095](6)細(xì)胞凍存
[0096]當(dāng)TSCM擴(kuò)增達(dá)到足夠數(shù)量時進(jìn)行質(zhì)量檢測，具體操作按相關(guān)試劑盒說明書進(jìn)行，其中細(xì)胞活率達(dá)到95%以上，無菌、支原體和內(nèi)毒素檢測結(jié)果均符合《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)，細(xì)胞表面抗原流式檢測結(jié)果為CCR7+、CD62L+、CD95+、CD45R0—，當(dāng)細(xì)胞質(zhì)量檢測合格后，對細(xì)胞進(jìn)行冷凍儲存，細(xì)胞濃度為17個/mL，細(xì)胞凍存液的組成為10 % DMS0+90 %自體血漿，并最終把細(xì)胞轉(zhuǎn)移到-176 V液氮罐中長期儲存。
[0097](7)細(xì)胞編碼入庫
[0098]凍存入庫的細(xì)胞按照唯一性原則進(jìn)行編碼，貼上相應(yīng)的二維碼，并將個人信息、編碼和保存位置等信息錄入系統(tǒng)中進(jìn)行管理。
[0099]實(shí)施例2
[0100]與實(shí)施例1相比，其區(qū)別僅在于步驟(3)，具體操作如下，其它與實(shí)施例1相同。
[0101](3)將采集的外周血分裝到離心管中，1600rpm室溫離心12min，取上清液得到自體血漿，置于_20°C保存?zhèn)溆?；分離自體血漿后，用生理鹽水按1:1的比例稀釋下層血細(xì)胞，將稀釋的血細(xì)胞懸液緩慢勾速地加入到Ficoll-Paque?淋巴細(xì)胞分離液上方，1800rpm室溫離心20min，離心完畢后，離心管內(nèi)出現(xiàn)分層，小心將白膜層轉(zhuǎn)移至另一離心管，收集得到的成分即可獲得PBMC。
[0102]實(shí)施例3
[0103]與實(shí)施例1相比，其區(qū)別僅在于步驟(3)，具體操作如下，其它與實(shí)施例1相同。
[0104](3)將采集的外周血分裝到離心管中，1800rpm室溫離心14min，取上清液得到自體血漿，置于_20°C保存?zhèn)溆?；分離自體血漿后，用生理鹽水按1:1的比例稀釋下層血細(xì)胞，將稀釋的血細(xì)胞懸液緩慢勾速地加入到Ficoll-Paque?淋巴細(xì)胞分離液上方，1900rpm室溫離心22min，離心完畢后，離心管內(nèi)出現(xiàn)分層，小心將白膜層轉(zhuǎn)移至另一離心管，收集得到的成分即可獲得PBMC。
[0105]實(shí)施例4
[0106]與實(shí)施例1相比，其區(qū)別僅在于步驟(3)，具體操作如下，其它與實(shí)施例1相同。
[0107](3)將采集的外周血分裝到離心管中，2000rpm室溫離心15min，取上清液得到自體血漿，置于_20°C保存?zhèn)溆?；分離自體血漿后，用生理鹽水按1:1的比例稀釋下層血細(xì)胞，將稀釋的血細(xì)胞懸液緩慢勻速地加入到Ficoll-Paque?淋巴細(xì)胞分離液上方，2000rpm室溫離心30min，離心完畢后，離心管內(nèi)出現(xiàn)分層，小心將白膜層轉(zhuǎn)移至另一離心管，收集得到的成分即可獲得PBMC。
[0108]實(shí)施例5
[0109]與實(shí)施例1相比，其區(qū)別僅在于步驟(3)，具體操作如下，其它與實(shí)施例1相同。
[0110](3)將采集的外周血分裝到離心管中，1600rpm室溫離心15min，取上清液得到自體血漿，置于_20°C保存?zhèn)溆?；分離自體血漿后，用生理鹽水按1:1的比例稀釋下層血細(xì)胞，將稀釋的血細(xì)胞懸液緩慢勻速地加入到Ficoll-Paque?淋巴細(xì)胞分離液上方，1950rpm室溫離心20min，離心完畢后，離心管內(nèi)出現(xiàn)分層，小心將白膜層轉(zhuǎn)移至另一離心管，收集得到的成分即可獲得PBMC。
[0111]實(shí)施例6
[0112]與實(shí)施例1相比，其區(qū)別僅在于步驟(4)，具體操作如下，其它與實(shí)施例1相同。
[0113](4)初始T細(xì)胞的分選:采用免疫磁珠法對分離所得PBMC進(jìn)行初始T細(xì)胞的分選，抗體選用⑶45RA、CD45R0和⑶95組合，其中⑶45RA采用正分選法，⑶45R0和⑶95采用負(fù)分選法，所得細(xì)胞即為初始T細(xì)胞。
[0114]實(shí)施例7
[0115]與實(shí)施例1相比，其區(qū)別僅在于步驟(5)，具體操作如下，其它與實(shí)施例1相同。
[0116](5)TSCM 的制備
[0117]用生理鹽水對所得初始T細(xì)胞進(jìn)行洗滌，300g室溫離心5min，并用誘導(dǎo)培養(yǎng)液對細(xì)胞進(jìn)行懸浮，調(diào)整細(xì)胞終濃度至1.2 X 16個/mL，放置于37°C、5 % CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)8天，對細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo);收集、洗滌誘導(dǎo)后的細(xì)胞，300g室溫離心5min，加入擴(kuò)增培養(yǎng)液進(jìn)行細(xì)胞懸浮、計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞終濃度至1.2 X 106f/mL，放置于37 °C,5% CO2培養(yǎng)箱擴(kuò)增，當(dāng)細(xì)胞濃度超過3 X16個/mL時進(jìn)行分流培養(yǎng);其中誘導(dǎo)培養(yǎng)液和擴(kuò)增培養(yǎng)液組分及其含量同實(shí)施例1。
[0118]實(shí)施例8
[0119]與實(shí)施例1相比，其區(qū)別僅在于步驟(5)，具體操作如下，其它與實(shí)施例1相同。
[0120](5)TSCM的制備
[0121]用生理鹽水對所得初始T細(xì)胞進(jìn)行洗滌，350g室溫離心3min，并用誘導(dǎo)培養(yǎng)液對細(xì)胞進(jìn)行懸浮，調(diào)整細(xì)胞終濃度至1.5 X 16個/mL，放置于37°C、5 % CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)7天，對細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)；收集、洗滌誘導(dǎo)后的細(xì)胞，350g室溫離心3min，加入擴(kuò)增培養(yǎng)液進(jìn)行細(xì)胞懸浮、計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞終濃度至1.5 X 106f/mL，放置于37 °C,5% CO2培養(yǎng)箱擴(kuò)增，當(dāng)細(xì)胞濃度超過5 X16個/mL時進(jìn)行分流培養(yǎng);其中誘導(dǎo)培養(yǎng)液和擴(kuò)增培養(yǎng)液組分及其含量同實(shí)施例1。
[0122]實(shí)施例9
[0123]與實(shí)施例1相比，其區(qū)別僅在于步驟(5)中用到的誘導(dǎo)培養(yǎng)液，其它與實(shí)施例1相同。
[0124]誘導(dǎo)培養(yǎng)液的組成為:以RPMI1640液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加5%的血清替代物、
1.5mM L-谷氨酰胺、100單位的青霉素、10yg的鏈霉素、I X 16個磁珠/mL抗⑶3/⑶28磁珠、3μΜ TWSl 19、2ng/mL的重組人白介素2、20ng/mL重組人白介素7和30ng/mL重組人白介素15。
[0125]實(shí)施例10
[0126]與實(shí)施例1相比，其區(qū)別僅在于步驟(5)中用到的誘導(dǎo)培養(yǎng)液，其它與實(shí)施例1相同。
[0127]誘導(dǎo)培養(yǎng)液的組成為:以RPMI1640液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加20%的血清替代物、2.5mM L-谷氨酰胺、100單位的青霉素、10yg的鏈霉素、4X 16個磁珠/mL抗⑶3/⑶28磁珠、
IΟμΜ TWSl 19、20ng/mL的重組人白介素2、25ng/mL重組人白介素7和25ng/mL重組人白介素15ο
[0128]實(shí)施例11
[0129]與實(shí)施例1相比，其區(qū)別僅在于步驟(5)中用到的擴(kuò)增培養(yǎng)液，其它與實(shí)施例1相同。
[0130]擴(kuò)增培養(yǎng)液的組成為:以RPMI1640液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加5%的血清替代物、1.5mM L-谷氨酰胺、100單位的青霉素、10yg的鏈霉素、2 X 16個磁珠/mL抗⑶3/⑶28磁珠、10ng/mL的重組人白介素2、3ng/mL重組人白介素7和3ng/mL重組人白介素15。
[0131]實(shí)施例12
[0132]與實(shí)施例1相比，其區(qū)別僅在于步驟(5)中用到的擴(kuò)增培養(yǎng)液，其它與實(shí)施例1相同。
[0133]擴(kuò)增培養(yǎng)液的組成為:以RPMI1640液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加15%的血清替代物、2.2mM L-谷氨酰胺、100單位的青霉素、10yg的鏈霉素、2 X 16個磁珠/mL抗⑶3/⑶28磁珠、I Ing/mL的重組人白介素2、4ng/mL重組人白介素7和6ng/mL重組人白介素15。
[0134]實(shí)施例13
[0135]與實(shí)施例1相比，其區(qū)別僅在于步驟(5)中用到的擴(kuò)增培養(yǎng)液，其它與實(shí)施例1相同。
[0136]擴(kuò)增培養(yǎng)液的組成為:以RPMI1640液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加20%的血清替代物、2.5mM L-谷氨酰胺、100單位的青霉素、10yg的鏈霉素、4X 16個磁珠/mL抗⑶3/⑶28磁珠、15ng/mL的重組人白介素2、8ng/mL重組人白介素7和8ng/mL重組人白介素15。
[0137]通過上述實(shí)施例1-13所構(gòu)建的人干性記憶T細(xì)胞庫，其能夠提高靶細(xì)胞，尤其是CD4+和CD8+T細(xì)胞的純度和細(xì)胞質(zhì)量，通過利用初始T細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)后擴(kuò)增，能夠使初始T細(xì)胞在外周血單個核細(xì)胞(PBMC)的含量達(dá)到約50%，在較少血液量的條件下，能夠誘導(dǎo)擴(kuò)增出滿足建庫所需的細(xì)胞數(shù)量，而且成本相對較低，操作也較為簡單，滿足了對CD4+和CD8+等類型的T細(xì)胞充分誘導(dǎo)培養(yǎng)的要求。
[0138]
【申請人】聲明，本發(fā)明通過上述實(shí)施例來說明本發(fā)明的詳細(xì)結(jié)構(gòu)特征，但本發(fā)明并不局限于上述詳細(xì)結(jié)構(gòu)特征，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述詳細(xì)結(jié)構(gòu)特征才能實(shí)施。所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對本發(fā)明的任何改進(jìn)，對本發(fā)明所選用部件的等效替換以及輔助部件的增加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍和公開范圍之內(nèi)。
[0139]以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，但是，本發(fā)明并不限于上述實(shí)施方式中的具體細(xì)節(jié)，在本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思范圍內(nèi)，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行多種簡單變型，這些簡單變型均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0140]另外需要說明的是，在上述【具體實(shí)施方式】中所描述的各個具體技術(shù)特征，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進(jìn)行組合，為了避免不必要的重復(fù)，本發(fā)明對各種可能的組合方式不再另行說明。
[0141]此外，本發(fā)明的各種不同的實(shí)施方式之間也可以進(jìn)行任意組合，只要其不違背本發(fā)明的思想，其同樣應(yīng)當(dāng)視為本發(fā)明所公開的內(nèi)容。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種人干性記憶T細(xì)胞庫的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)人外周血的采集； (2)外周血單個核細(xì)胞的分離； (3)初始T細(xì)胞的分選:采用免疫磁珠法對分離所得外周血單個核細(xì)胞進(jìn)行初始T細(xì)胞的分選，抗體選用CD45RA和CD45R0的組合或CD45RA、CD45R0和CD95的組合； (4)干性記憶T細(xì)胞的制備； (5)細(xì)胞凍存; (6)編碼入庫。2.如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(2)所述外周血單個核細(xì)胞的分離方法是:將采集的外周血進(jìn)行分裝和離心，取上清液得到自體血漿;分離下層血細(xì)胞，將其離心后得到外周血單個核細(xì)胞； 優(yōu)選地，所述外周血的離心是在室溫下進(jìn)行；離心的轉(zhuǎn)速優(yōu)選為1500-2000rpm，離心的時間優(yōu)選為10_15min; 優(yōu)選地，所述下層血細(xì)胞的分離是采用生理鹽水對其進(jìn)行稀釋，將稀釋后的血細(xì)胞加入淋巴細(xì)胞液液面上方進(jìn)行分離； 優(yōu)選地，所述下層血細(xì)胞的離心是在室溫下進(jìn)行；離心的轉(zhuǎn)速優(yōu)選為1800-2000rpm，離心的時間優(yōu)選為20-30min。3.如權(quán)利要求1或2所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(3)所述抗體CD45RA采用正分選法，⑶45R0和⑶95采用負(fù)分選法； 優(yōu)選地，所述抗體選用⑶45RA、⑶45R0和⑶95的組合。4.如權(quán)利要求1-3之一所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(4)所述干性記憶T細(xì)胞的制備方法是:先對初始T細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，收集、洗滌誘導(dǎo)培養(yǎng)后的細(xì)胞，再對其進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)； 優(yōu)選地，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)采用誘導(dǎo)培養(yǎng)液對初始T細(xì)胞進(jìn)行懸浮，調(diào)整細(xì)胞終濃度至0.5-1.5X 16個/mL，放置于37 °C、5 % CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)7-12天； 優(yōu)選地，所述擴(kuò)增培養(yǎng)采用擴(kuò)增培養(yǎng)液進(jìn)行細(xì)胞懸浮，調(diào)整細(xì)胞終濃度至0.5-1.5 X 16個/mL，放置于37 °C、5 % CO2培養(yǎng)箱擴(kuò)增； 優(yōu)選地，所述擴(kuò)增培養(yǎng)還包括當(dāng)細(xì)胞濃度超過2.5-5 X 16個/mL時進(jìn)行分流培養(yǎng)。5.如權(quán)利要求4所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)液的組成為:以RPMI1640液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加5-20 %的血清替代物、1.5-2.5mM L-谷氨酰胺、100單位的青霉素、10yg的鏈霉素、1-4 X 16個磁珠/mL抗CD3/CD28磁珠、3-1ΟμΜ TffSl 19,0-20ng/mL的重組人白介素2、20-30ng/mL重組人白介素7和20-30ng/mL重組人白介素15; 優(yōu)選地，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)液的組成為:以RPMI 1640液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加10%的血清替代物、2.0mM L-谷氨酰胺、100單位的青霉素、10yg的鏈霉素，2 X 16個磁珠/mL抗⑶3/CD28磁珠、7μΜ TWSl 19、5ng/mL的重組人白介素2、25ng/mL重組人白介素7和25ng/mL重組人白介素15。6.如權(quán)利要求4或5所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述擴(kuò)增培養(yǎng)液的組成為:以RPMI1640液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加5-20 %的血清替代物、1.5-2.5mM L-谷氨酰胺、100單位的青霉素、10yg的鏈霉素、1-4\106個磁珠/11^抗0)3/0)28磁珠、0-151^/1^的重組人白介素2、3-8ng/mL重組人白介素7和3_8ng/mL重組人白介素15; 優(yōu)選地，所述擴(kuò)增培養(yǎng)液的組成為:以RPMI 1640液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加15%的血清替代物、2.0mM L-谷氨酰胺、100單位的青霉素、10yg的鏈霉素、I X 16個磁珠/mL抗CD3/⑶28磁珠、5ng/mL重組人白介素7和5ng/mL重組人白介素15。7.如權(quán)利要求1-6之一所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(5)所述細(xì)胞凍存的方法包括:采用細(xì)胞凍存液在_196°C?_165°C的溫度下進(jìn)行凍存； 優(yōu)選地，所述細(xì)胞凍存液由10 % DMSO和90 %自體血漿組成； 優(yōu)選地，所述細(xì)胞凍存前還包括對細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞無菌性、細(xì)胞純度和細(xì)胞身份進(jìn)行檢測和鑒定； 優(yōu)選地，所述細(xì)胞無菌性采用全自動細(xì)菌/分枝桿菌培養(yǎng)監(jiān)測系統(tǒng)進(jìn)行； 優(yōu)選地，所述細(xì)胞純度采用鱟試劑法進(jìn)行； 優(yōu)選地，所述細(xì)胞身份采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行。8.如權(quán)利要求1-7之一所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(6)所述編碼入庫的方法是:對凍存的細(xì)胞進(jìn)行編碼，貼上二維碼，并將個人信息、儲存位置及編號錄入信息系統(tǒng)中，用于檢索和管理； 優(yōu)選地，所述二維碼包含區(qū)域代碼、類型代碼、年份、流水號和分管號。9.如權(quán)利要求1-8之一所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述構(gòu)建方法包括以下步驟: (1)外周血的采集:供體應(yīng)查體符合獻(xiàn)血標(biāo)準(zhǔn)； (2)外周血單個核細(xì)胞的分離:將采集的外周血進(jìn)行分裝，1500-2000rpm室溫離心10-15min，取上清液得到自體血漿，置于-20°C保存?zhèn)溆?分離自體血漿后，用生理鹽水按1:1的比例稀釋下層血細(xì)胞，將稀釋的血細(xì)胞加入到1-3倍體積的淋巴細(xì)胞分離液液面上方，1800-2000rpm室溫離心20-30min，離心后將白膜層轉(zhuǎn)移至另一離心管，收集得到的成分即是外周血單個核細(xì)胞； (3)初始T細(xì)胞的分選:采用免疫磁珠法對分離所得外周血單個核細(xì)胞進(jìn)行初始T細(xì)胞的分選，抗體選用⑶45RA、CD45R0和⑶95的組合，其中⑶45RA采用正分選法，CD45R0和⑶95采用負(fù)分選法； (4)干性記憶T細(xì)胞的制備:用生理鹽水或I3BS對所得初始T細(xì)胞進(jìn)行洗滌，300-400g室溫離心3-5min，并用誘導(dǎo)培養(yǎng)液對細(xì)胞進(jìn)行懸浮，調(diào)整細(xì)胞終濃度至0.5-1.5 X 16個/mL，放置于37°C、5%⑶2培養(yǎng)箱培養(yǎng)7-12天，對細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)；收集、洗滌誘導(dǎo)后的細(xì)胞，300-400g室溫離心3-5min，加入擴(kuò)增培養(yǎng)液進(jìn)行細(xì)胞懸浮、計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞終濃度至0.5-1.5 X10’/mL，放置于37 °C,5% CO2培養(yǎng)箱擴(kuò)增，當(dāng)細(xì)胞濃度超過2.5-5 X 16個/mL時進(jìn)行分流培養(yǎng)； 所述誘導(dǎo)培養(yǎng)液的組成為:以RPMI 1640液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加5-20%的血清替代物、1.5-2.5mM L-谷氨酰胺、100單位的青霉素、10yg的鏈霉素、1-4X 16個磁珠/mL抗CD3/CD28磁珠、3-10μΜ TWSl 19、0-20ng/mL的重組人白介素2、20_30ng/mL重組人白介素7和20-30呢/11^重組人白介素15; 所述擴(kuò)增培養(yǎng)液的組成為:以RPMI 1640液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加5-20%的血清替代物、1.5-2.5mM L-谷氨酰胺、100單位的青霉素、10yg的鏈霉素、1-4X 16個磁珠/mL抗CD3/⑶28磁珠、0-15ng/mL的重組人白介素2、3_8ng/mL重組人白介素7和3_8ng/mL重組人白介素 15； (5)細(xì)胞凍存:當(dāng)擴(kuò)增培養(yǎng)的干性記憶T細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)量達(dá)到1-5X 18時，達(dá)到凍存要求，進(jìn)行細(xì)胞數(shù)量與活率檢測，全自動細(xì)菌/分枝桿菌培養(yǎng)監(jiān)測系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)胞無菌性檢測，PCR法進(jìn)行支原體檢測，鱟試劑法進(jìn)行細(xì)胞純度檢測，流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞身份鑒定，當(dāng)檢測結(jié)果符合要求時，以1-5 X 17個/mL凍存細(xì)胞，細(xì)胞凍存液由10 %DMSO和90 %自體血漿組成，細(xì)胞最終在_196°C?_165°C液氮罐中長期儲存； (6)編碼入庫:對凍存的細(xì)胞進(jìn)行編碼，貼上唯一的二維碼，二維碼包含區(qū)域代碼、類型代碼、年份、流水號和分管號，并將個人信息、儲存位置及編號錄入信息系統(tǒng)中，用于檢索和管理。
【文檔編號】C40B50/06GK105821483SQ201610281300
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年4月29日
【發(fā)明人】孫長斌, 張曦, 張家文, 周欣
【申請人】深圳華大基因研究院