一種快速誘導金黃色葡萄球菌進入活的不可培養(yǎng)狀態(tài)的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種快速誘導金黃色葡萄球菌進入活的不可培養(yǎng)狀態(tài)的方法，包括如下步驟：將金黃色葡萄球菌經超聲處理，使其進入活的不可培養(yǎng)狀態(tài)，所述超聲處理的條件為：處理頻率為10～30kHz,處理功率為200?400W，處理時間為15～25min，處理溫度為15～25℃。本發(fā)明提供的方法，是將金黃色葡萄球菌經超聲處理，使其進入活的不可培養(yǎng)狀態(tài)。本發(fā)明的實驗證明，利用超聲波技術處理細菌，可促使細菌在20min快速進入活的不可培養(yǎng)狀態(tài)；本發(fā)明的方法使金黃色葡萄球菌進入活的不可培養(yǎng)狀態(tài)的誘導時間大大縮短，節(jié)約了科研成本，推動了有關活的不可培養(yǎng)狀態(tài)細菌的研究進度。
【專利說明】
一種快速誘導金黃色葡萄球菌進入活的不可培養(yǎng)狀態(tài)的方法
技術領域
[0001]本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種快速誘導金黃色葡萄球菌進入活的不可培養(yǎng)狀態(tài)(VBNC)的方法。
【背景技術】
[0002]金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，S.aureus )隸屬于葡萄球菌屬(Staphylococcus)，是引起細菌性食物中毒的主要病原菌之一，據(jù)統(tǒng)計有50-75%的金黃色葡萄球菌菌株在合適的生長條件下能夠產生對惡劣環(huán)境耐受性很強的腸毒素(Staphylococcusal Enterotoxin)，對人類健康威脅很大。并且研究發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌會在外界不利環(huán)境的脅迫下會進入一種活的不可培養(yǎng)(viable but nonculturable,VBNC)狀態(tài)。處于活的不可培養(yǎng)狀態(tài)的細菌無法在常用的培養(yǎng)基上正常生長繁殖，能夠逃避常規(guī)檢測而造成假陰性的結果，但活的不可培養(yǎng)狀態(tài)細菌仍然具有生命體征和代謝活性，在適宜的條件下可復蘇再生長，重新獲得感染能力，成為危害食品安全的“隱性污染源”。
[0003]開展活的不可培養(yǎng)狀態(tài)的金黃色葡萄球菌在形態(tài)、代謝活性、蛋白表達、基因表達等生物學特性以及形成機制等方面的研究，對于食品安全檢測、有效殺滅活的不可培養(yǎng)狀態(tài)的細菌具有重要的實際意義。然而現(xiàn)有的研究結果表明，獲得活的不可培養(yǎng)狀態(tài)的金黃色葡萄球菌細菌需要很長的時間，目前常用的低溫結合寡營養(yǎng)的條件通常需要一個月以上的誘導時間才能使正常的金黃色葡萄球菌進入活的不可培養(yǎng)狀態(tài)，大大增加了科研成本、限制了其科研進度。例如，公開號為CN 103525736A的中國發(fā)明專利申請文獻公開了兩種誘導啤酒易感乳酸菌進入“活的但不可培養(yǎng)” (viable but non-culturable，VBNC)狀態(tài)的方法，兩種誘導方法分別為，一是通過O?4°C低溫儲藏;二是通過啤酒環(huán)境下連續(xù)傳代馴化培養(yǎng)。
[0004]公開號為CN105200034A的中國發(fā)明專利申請公開了一種VBNC狀態(tài)沙門氏菌的誘導形成方法，其包括，將沙門氏菌懸浮于液體中，混合均勻，使其菌液濃度為17?18CFU/mL，將菌液在42°C?55°C恒溫條件下超聲波190?570W處理5?25min，檢測是否誘導沙門氏菌進入VBNC狀態(tài)。但是該方法的誘導對象為革蘭氏陰性菌沙門氏菌，并不適用于金黃色葡萄球菌。
[0005 ]因此，發(fā)明一種快速誘導金黃色葡萄球菌進入活的不可培養(yǎng)狀態(tài)的方法對于對該狀態(tài)細菌的研究起到重要的推動作用。

【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明提供一種快速誘導金黃色葡萄球菌進入活的不可培養(yǎng)狀態(tài)的方法，解決了現(xiàn)有技術中誘導時間長的技術問題。
[0007]—種快速誘導金黃色葡萄球菌進入活的不可培養(yǎng)狀態(tài)的方法，包括如下步驟:將金黃色葡萄球菌經超聲處理，使其進入活的不可培養(yǎng)狀態(tài)，所述超聲處理的條件為:處理頻率為10?30kHz，處理功率為200-400W，處理時間為15?25min，處理溫度為15?25°C。
[0008]本發(fā)明提供的方法，是將金黃色葡萄球菌經超聲處理，使其進入活的不可培養(yǎng)狀態(tài)。本發(fā)明的實驗證明，利用超聲波技術處理細菌，可促使細菌在20min快速進入活的不可培養(yǎng)狀態(tài);本發(fā)明的方法使金黃色葡萄球菌進入活的不可培養(yǎng)狀態(tài)的誘導時間大大縮短，節(jié)約了科研成本，推動了有關活的不可培養(yǎng)狀態(tài)細菌的研究進度。
[0009]本發(fā)明的誘導對象是金黃色葡萄球菌，屬于革蘭氏陽性菌，目前的對活的不可培養(yǎng)狀態(tài)細菌的研究大多集中在大腸桿菌、沙門氏菌等陰性菌，革蘭氏陽性菌的細胞壁，是一層厚而致密的肽聚糖和磷壁酸組成，肽聚糖的肽鏈之間通過5個甘氨酸交聯(lián)著。革蘭氏陰性菌的細胞壁則是多層結構，從內到外依次是:薄薄的肽聚糖層，脂蛋白層/周質層，磷脂層和脂多糖層;革蘭氏陰性菌的肽聚糖結構也和革蘭氏陽性菌的有所不同，肽鏈是直接交聯(lián)在一起的，革蘭氏陰性菌與革蘭氏陽性菌的結構不同，形成VBNC狀態(tài)的機理不同。目前對于陽性菌的研究還較少，誘導方法也較單一，現(xiàn)有的陽性菌一般仍采用傳統(tǒng)的低溫、寡營養(yǎng)的誘導條件，至少需要一個月的誘導時間。
[0010]優(yōu)選地，所述超聲處理的條件為:處理頻率為15?25kHz，處理功率為200?400W，處理時間為20?25min，處理溫度為20?25°C。
[0011 ] 一種優(yōu)選的技術方案，所述超聲處理的條件為:處理頻率為20kHz，處理功率為200W，處理時間為20min，處理溫度為20°C。
[0012]另一種優(yōu)選的技術方案，所述超聲處理的條件為:處理頻率為20kHz，處理功率為400W，處理時間為20min，處理溫度為20°C。
[0013]優(yōu)選地:將金黃色葡萄球菌洗滌、懸浮，得到待誘導細菌懸浮液。
[0014]進一步優(yōu)選地，洗滌和懸浮均采用無菌生理鹽水。
[0015]更進一步優(yōu)選地，所述無菌生理鹽水為質量百分含量為0.85%的NaCl水溶液。
[0016]優(yōu)選地，所述金黃色葡萄球菌為處于對數(shù)期的目的細菌。
[0017]上述方法中，在超聲處理后，還包括以下步驟:檢測經過超聲誘導處理后的金黃色葡萄球菌的活菌數(shù)和可培養(yǎng)菌數(shù);其中，檢測經過超聲誘導處理后的金黃色葡萄球菌活菌數(shù)采用pi/croA雙染法，檢測經過誘導處理后的金黃色葡萄球菌可培養(yǎng)菌數(shù)采用平板計數(shù)法。
[0018]本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明開發(fā)了一種快速誘導金黃色葡萄球菌進入活的不可培養(yǎng)狀態(tài)的方法，利用超聲波技術處理細菌，可促使細菌在20min快速進入活的不可培養(yǎng)狀態(tài);本發(fā)明的方法使金黃色葡萄球菌進入活的不可培養(yǎng)狀態(tài)的誘導時間大大縮短，節(jié)約了科研成本，推動了有關活的不可培養(yǎng)狀態(tài)細菌的研究進度。
【具體實施方式】
[0019]下面結合實施例對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
[0020 ]實施例1金黃色葡萄球菌活的不可培養(yǎng)狀態(tài)的快速誘導
[0021]一超聲誘導
[0022](I)細菌懸浮液制備
[0023]將金黃色葡萄球菌標準菌株ATCC25923接種于普通肉湯培養(yǎng)基中，37°C搖床培養(yǎng)至對數(shù)生長期。采用0.85% (質量百分含量)無菌生理鹽水洗滌對數(shù)生長期的菌體兩次，重懸，使菌體濃度約為18CFUAiL，作為待誘導菌液(細菌懸浮液)；
[0024](2)超聲處理
[0025]實驗組:用超聲波SCIENTZ-1ID型殺菌裝置對金黃色葡萄球菌懸浮液進行處理，具體步驟:將30mL細菌懸浮液裝入玻璃超聲管中，直徑為1mm的超聲探頭深入液面2cm，將超聲管放入20 °C水浴鍋中，對菌液進行超聲處理，處理頻率為20kHz，處理功率為100W，處理時間為20min，得到誘導后菌液。
[0026]對照組:待誘導菌液不進行超聲處理，只在20°C水浴鍋中放置20min。
[0027]二檢測
[0028](I)活菌數(shù)測定方法
[0029]采用PI/cFDA雙染法:具體步驟:實驗組和對照組的金黃色葡萄球菌與30mmol/L的PI 在冰浴中孵育 lOmin，然后與 50mmol/L 的 cFDA 在 37°C 孵育 10111丨11，4°(:、6000\8離心1011^11，用無菌生理鹽水洗滌去除過量的染料，孵育完成后用流式細胞儀結合絕對計數(shù)熒光微球進行定量分析，每個樣品收集20000個細菌檢測。
[0030](2)可培養(yǎng)菌數(shù)測定方法
[0031 ] 采用平板計數(shù)法:具體步驟:參照GB 4789.2-2010方法，將誘導后菌液用0.85%無菌生理鹽水進行梯度稀釋，取稀釋樣ImL于滅菌平皿中，倒入約20mL PCA培養(yǎng)基搖勻，待培養(yǎng)基凝固后倒置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，然后記錄菌落數(shù)。
[0032](3)活的不可培養(yǎng)狀態(tài)細菌
[0033]采用上述的方法分別測定實驗組和對照組的活菌數(shù)和可培養(yǎng)菌數(shù)，從而計算活的不培養(yǎng)狀態(tài)菌數(shù)(活菌數(shù)一可培養(yǎng)菌數(shù))。
[0034]結果如下:超聲誘導后菌液的活菌數(shù)為7.831ogCFU/mL;誘導后菌液的可培養(yǎng)菌數(shù)為7.501og CFU/mL;進入了活的不可培養(yǎng)狀態(tài)菌數(shù)為0.331og CFU/mL。對照組的活菌數(shù)與可培養(yǎng)菌數(shù)仍約為Slog CFU/mL，基本認為沒有活的不可培養(yǎng)狀態(tài)的菌。由此可見，本發(fā)明的方法在超聲誘導20min時獲得了一定比例的活的不可培養(yǎng)狀態(tài)的金黃色葡萄球菌。
[0035]實施例2快速誘導較大比例金黃色葡萄球菌進入活的不可培養(yǎng)狀態(tài)
[0036]一高壓二氧化碳誘導
[0037](I)細菌懸浮液制備
[0038]與實施例1中的一的步驟(I)的方法相同。
[0039](2)超聲誘導
[0040]與實施例1中的一的步驟(2)的方法基本相同，僅將處理功率變400W后得到誘導后菌液。
[0041 ] 二檢測
[0042]與實施例1中的二的方法相同。
[0043]結果如下:超聲誘導后菌液的活菌數(shù)為7.481ogCFU/mL;誘導后菌液的可培養(yǎng)菌數(shù)為6.961og CFU/mL;進入了活的不可培養(yǎng)狀態(tài)菌數(shù)為0.521og CFU/mL。對照組的活菌數(shù)與可培養(yǎng)菌數(shù)仍約為Slog CFU/mL，基本認為沒有活的不可培養(yǎng)狀態(tài)的菌。由此可見，本發(fā)明的方法在超聲誘導20min時獲得了較大比例的活的不可培養(yǎng)狀態(tài)的金黃色葡萄球菌。
[0044]本實施例同實施例1相比，獲得的活的不用可培養(yǎng)狀態(tài)的菌數(shù)更多。
[0045]對比例
[0046]按照CN105200034A中的條件進行金黃色葡萄球菌的誘導，菌液的活菌數(shù)為從81ogCFU/mL降到2.061og CFU/mL，可培養(yǎng)菌數(shù)將為2.041og CFU/mL;進入了活的不可培養(yǎng)狀態(tài)菌數(shù)為0.021og CFU/mL。該處理條件在誘導過程中使活菌與可培養(yǎng)菌都大大降低，溶液中大部分菌的狀態(tài)為死菌，違背了活的不可培養(yǎng)狀態(tài)細菌誘導時要將活菌量維持在較高的比例。
[0047]上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內。
【主權項】
1.一種快速誘導金黃色葡萄球菌進入活的不可培養(yǎng)狀態(tài)的方法，其特征在于，包括如下步驟:將金黃色葡萄球菌經超聲處理，使其進入活的不可培養(yǎng)狀態(tài)，所述超聲處理的條件為:處理頻率為1?30kHz，處理功率為200-400W，處理時間為15?25min，處理溫度為15?25。。。2.根據(jù)權利要求1所述方法，其特征在于，所述超聲處理的條件為:處理頻率為15?25kHz，處理功率為200?400W，處理時間為20?25min，處理溫度為20?25°C。3.根據(jù)權利要求1所述方法，其特征在于，所述超聲處理的條件為:處理頻率為20kHz，處理功率為200W，處理時間為20min，處理溫度為20°C。4.根據(jù)權利要求1所述方法，其特征在于，所述超聲處理的條件為:處理頻率為20kHz，處理功率為400W，處理時間為20min，處理溫度為20°C。5.根據(jù)權利要求1所述方法，其特征在于，在所述超聲處理前還包括以下步驟:將金黃色葡萄球菌洗滌、懸浮，得到待誘導細菌懸浮液。6.根據(jù)權利要求5所述方法，其特征在于，洗滌和懸浮均采用無菌生理鹽水。7.根據(jù)權利要求6所述方法，其特征在于，所述無菌生理鹽水為質量百分含量為0.85%的NaCl水溶液。8.根據(jù)權利要求1所述方法，其特征在于，所述金黃色葡萄球菌為處于對數(shù)期的目的細菌。
【文檔編號】C12N13/00GK105838705SQ201610368998
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年5月27日
【發(fā)明人】丁甜, 李嬌, 廖新浴, 劉東紅, 葉興乾, 陳健初, 胡亞芹, 陳士國
【申請人】浙江大學