一種高效分泌表達(dá)溶解性多糖單加氧酶cbp21的重組菌及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高效分泌表達(dá)溶解性多糖單加氧酶CBP21的重組菌及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的高效分泌表達(dá)CBP21蛋白的重組菌為在枯草芽胞桿菌中表達(dá)信號(hào)肽編碼基因和溶解性多糖單加氧酶CBP21編碼基因；所述信號(hào)肽為枯草芽胞桿菌信號(hào)肽；所述枯草芽胞桿菌信號(hào)肽為信號(hào)肽YlqB或信號(hào)肽Pel。通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明：本發(fā)明的重組菌發(fā)酵獲得的CBP21蛋白對(duì)不同酶家族的幾丁質(zhì)酶均有明顯促酶活作用，在幾丁質(zhì)酶的選擇上具有一定普適性。
【專利說(shuō)明】
一種高效分泌表達(dá)溶解性多糖單加氧酶CBP21的重組菌及其 應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種高效分泌表達(dá)溶解性多糖單加氧酶 CBP21的重組菌及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 幾丁質(zhì)又名甲殼素、幾丁聚糖，是一種類似于植物纖維的六糖聚合體，其在自然界 中分布廣泛，是僅此于纖維素的第二大天然生物有機(jī)資源，年生物合成量達(dá)100億噸。幾丁 質(zhì)酶(EC. 3.2.14)能將幾丁質(zhì)水解為N-乙酰氨基葡萄糖，溶解性多糖單加氧酶能協(xié)同幾丁 質(zhì)酶降解幾丁質(zhì)，是一種對(duì)幾丁質(zhì)的降解至關(guān)重要的蛋白，作為"幾丁質(zhì)氧化水解酶"分類 到輔助酶AAlO家族中。
[0003] 枯草芽孢桿菌是一種安全、高效分泌且經(jīng)濟(jì)的表達(dá)宿主，其培養(yǎng)簡(jiǎn)單快速，具有較 強(qiáng)的分泌表達(dá)能力、無(wú)致病性及良好的發(fā)酵基礎(chǔ)和生產(chǎn)技術(shù)，是飼料行業(yè)酶制劑的首選表 達(dá)系統(tǒng)。在外源蛋白表達(dá)分泌過(guò)程中，信號(hào)肽影響著外源蛋白的分泌效率。篩選最優(yōu)信號(hào)肽 以提高外源蛋白的分泌量，是外源蛋白高效表達(dá)的關(guān)鍵因素之一，決定著工業(yè)生產(chǎn)蛋白的 大規(guī)模生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種重組菌。
[0005] 本發(fā)明的重組菌為在枯草芽胞桿菌中通過(guò)源于枯草芽胞桿菌的信號(hào)肽引導(dǎo)溶解 性多糖單加氧酶CBP21的表達(dá)。
[0006] 上述重組菌中，所述源于枯草芽胞桿菌的信號(hào)肽為信號(hào)肽HqB或信號(hào)肽Pel;
[0007] 所述信號(hào)肽HqB的氨基酸序列為序列9;
[0008] 所述信號(hào)肽Pel的氨基酸序列為序列11。
[0009] 上述重組菌中，
[0010]所述信號(hào)肽HqB的編碼基因序列為序列22的第1-81位核苷酸分子；
[0011]所述信號(hào)肽Pel的編碼基因序列為序列24的第1-63位核苷酸分子。
[0012] 上述重組菌中，所述在枯草芽胞桿菌中通過(guò)源于枯草芽胞桿菌的信號(hào)肽引導(dǎo)溶解 性多糖單加氧酶CBP21的表達(dá)的方法為如下1)或2):
[0013] 1)將含有信號(hào)肽HqB編碼基因和溶解性多糖單加氧酶CBP21編碼基因的片段導(dǎo)入 枯草芽胞桿菌中；
[0014] 2)將含有信號(hào)肽Pel編碼基因和溶解性多糖單加氧酶CBP21編碼基因的片段導(dǎo)入 枯草芽胞桿菌中。
[0015] 上述重組菌中，1)中，所述含有信號(hào)肽HqB編碼基因和溶解性多糖單加氧酶CBP21 編碼基因的片段通過(guò)pYl qB_CBP21導(dǎo)入枯草芽胞桿菌中；所述pYl qB_CBP21為將序列22所示 的DNA片段插入pWB980載體的Hind III和Xho I酶切位點(diǎn)之間，且保持pWB980載體的其他序 列不變得到的載體；
[0016] 2)中，所述含有信號(hào)肽Pel編碼基因和溶解性多糖單加氧酶CBP21編碼基因的片段 通過(guò)pPel-CBP21導(dǎo)入枯草芽胞桿菌中；所述pPel-CBP21為將序列24所示的DNA片段插入 PWB980載體的Hind III和Xho I酶切位點(diǎn)之間，且保持pWB980載體的其他序列不變得到的 載體。
[0017] 上述重組菌中，所述含有信號(hào)肽HqB編碼基因和溶解性多糖單加氧酶CBP21編碼 基因的片段的核苷酸序列為序列22;
[0018] 所述含有信號(hào)肽Pel編碼基因和溶解性多糖單加氧酶CBP21編碼基因的片段的核 苷酸序列為序列24。
[0019] 上述重組菌中，所述枯草芽胞桿菌為枯草芽胞桿菌168。
[0020]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述含有信號(hào)肽HqB編碼基因和溶解性多糖單加氧 酶CBP21編碼基因的片段或上述含有信號(hào)肽Pel編碼基因和溶解性多糖單加氧酶CBP21編碼 基因的片段。
[0021]本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供上述重組菌或上述信號(hào)肽HqB或上述信號(hào)肽Pel的新 用途。
[0022]本發(fā)明提供了上述重組菌或上述信號(hào)肽YlqB或上述信號(hào)肽Pel在促進(jìn)和/或提高 幾丁質(zhì)酶活性中的應(yīng)用。
[0023]本發(fā)明還提供了上述重組菌或上述信號(hào)肽HqB或上述信號(hào)肽Pel在在提高溶解性 多糖單加氧酶CBP21的分泌量中的應(yīng)用。
[0024]本發(fā)明還提供了上述重組菌或上述信號(hào)肽HqB或上述信號(hào)肽Pel在生產(chǎn)溶解性多 糖單加氧酶CBP21中的應(yīng)用。
[0025]本發(fā)明的最后一個(gè)目的是提供一種生產(chǎn)溶解性多糖單加氧酶CBP21的方法。
[0026]本發(fā)明提供的生產(chǎn)溶解性多糖單加氧酶CBP21的方法包括如下步驟:發(fā)酵培養(yǎng)上 述重組菌，得到所述溶解性多糖單加氧酶CBP21。
[0027]上述方法中，培養(yǎng)的條件為30°C培養(yǎng)1天。
[0028] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明產(chǎn)生如下有益效果：
[0029] 1、本發(fā)明是關(guān)于CBP21在枯草芽胞桿菌中的高效表達(dá)，為CBP21蛋白工業(yè)化生產(chǎn)提 供了新的方法。
[0030] 2、在枯草芽孢桿菌中表達(dá)CBP21蛋白具有如下優(yōu)勢(shì)：
[0031] (1)枯草芽孢桿菌屬于國(guó)際公認(rèn)的安全微生物(GRAS)，不含LPS，純化相對(duì)簡(jiǎn)單； (2)枯草芽孢桿菌只具有單層的細(xì)胞外膜，且有一套高效的分泌信號(hào)肽和分子伴侶系統(tǒng)，有 利于胞外蛋白的分泌；（3)遺傳背景清晰，Kunst F等1997年測(cè)序獲得了枯草芽孢桿菌168菌 株全基因組序列，并且有許多質(zhì)粒和噬菌體都可以作為克隆載體；（4)培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，且生 長(zhǎng)速度較快，可顯著降低生產(chǎn)成本。
[0032] 3、本發(fā)明對(duì)引導(dǎo)CBP21分泌的信號(hào)肽進(jìn)行了篩選，提供的Pel和HqB較其他信號(hào)肽 能顯著提高CBP21分泌量。
[0033] 4、本發(fā)明在前人基礎(chǔ)上進(jìn)一步完善了CBP21的應(yīng)用研究。
[0034] 本發(fā)明提供了一種高效分泌表達(dá)CBP21蛋白的重組菌。通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明：該重組菌發(fā) 酵獲得的CBP21蛋白對(duì)不同酶家族的幾丁質(zhì)酶均有明顯促酶活作用，具有一定普適性。
【附圖說(shuō)明】
[0035]圖1為成功轉(zhuǎn)化pWB980-signal-CBP21重組質(zhì)粒的重組枯草芽胞桿菌的鑒定結(jié)果 圖。其中，1_13:鑒定菌株，依次為含信號(hào)肽 Bpr、AspB、BglC、AmyE、AbnA、CccA、SacB、YolA、 YlqB、Pel、AprE、Epr、NprE; 14:含空載體 168 菌株。
[0036]圖2為由不同信號(hào)肽引導(dǎo)分泌的CBP21的SDS-PAGE圖。
[0037]圖3為總蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線圖及曲線方程。
[0038] 圖4為由不同信號(hào)肽引導(dǎo)分泌的CBP21發(fā)酵液上清的幾丁質(zhì)結(jié)合率測(cè)定。
[0039] 圖5為CBP21純化后的SDS-PAGE圖。
[0040]圖6為N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖及曲線方程。
[0041 ]圖7為CBP21純品對(duì)兩種幾丁質(zhì)酶酶促活性測(cè)定。
【具體實(shí)施方式】
[0042] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0043] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0044] 下述實(shí)施例中的枯草芽胞桿菌(Baci IIus subti Iis) 168在文獻(xiàn)"Mul Ier，J · P · and C· R· Harwood(1998) ·''Protein secretion in phosphate-limited cultures of Bacillus subtilis 168."Appl Microbiol Biotechnol，49(3):321_327."中公開過(guò)，公眾 可從中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所獲得。
[0045] 下述實(shí)施例中的pWB980載體在文獻(xiàn)"Wu，S.C.and S.L.Wong( 1999) · "Development of improved pUBllO-based vectors for expression and secretion studies in Bacillus subtilis. "Journal of Biotechnology，72(3) :185-195." 中公開過(guò)，公眾可從 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所獲得。
[0046] 下述實(shí)施例中的幾丁質(zhì)酶Chi92在文獻(xiàn)"Wu M.L,Chuang Y.C. ,Chen J.P.，et aI. Identification and Characterization of the Three Chitin-Binding Domains within the Multidomain Chitinase Chi92from Aeromonas hydrophila JP101.Applied and Environmental Microbiology，2001,67(11) :5100-5106." 中公開過(guò)，公眾可從中國(guó)農(nóng) 業(yè)科學(xué)院飼料研究所獲得。
[0047] 下述實(shí)施例中的LB培養(yǎng)基為：I %NaCl，0 · 5%yeast extract，1 % tryptone。
[0048] 下述實(shí)施例中的 SR培養(yǎng)基為：2 · 5 % tryptone，2 % yeast extract，0 · 3 %K2HP〇4。
[0049] 下述實(shí)施例中的各種抗性培養(yǎng)基中抗生素濃度為:氨芐青霉素(Amp)100mg/L，卡 那霉素(Kana)50mg/L。
[0050] 下述實(shí)施例中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.1 %的膠體幾丁質(zhì)的制備方法如下:準(zhǔn)確稱取IOg幾 丁質(zhì)粉末置于燒杯中，緩慢加入預(yù)冷的濃HCl 400mL，攪拌使其呈糊狀，4°C靜置24h;將其緩 慢加入到盛有2000mL乙醇:水（I: I，v/v)溶液的燒杯中，邊加邊使用磁力攪拌器攪拌，4°C靜 置24h;將攪拌后的溶液于4°C、12000rpm離心10min，棄上清，取沉淀即膠體幾丁質(zhì)；將沉淀 用蒸餾水沖洗、離心、沖洗至pH 7.0,最后用蒸餾水定容至1000mL。置于4°C冰箱保存。
[0051 ]實(shí)施例1、溶解性多糖單加氧酶CBP21分泌表達(dá)載體
[0052] 一、溶解性多糖單加氧酶CBP21分泌表達(dá)載體的構(gòu)建
[0053] 1、CBP21表達(dá)載體構(gòu)建
[0054] 將溶解性多糖單加氧酶CBP21的編碼基因序列插入pWB980載體的Hind III和Xho 頂每切位點(diǎn)之間，且保持PWB980載體的其他序列不變，得到表達(dá)載體pWB980-CBP21。
[0055] 2、信號(hào)肽片段的擴(kuò)增
[0056] 以枯草芽胞桿菌168基因組為模板，分別采用如下引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別得到如 下13個(gè)信號(hào)肽片段= AbnA(氨基酸序列為序列l(wèi))、AmyE(氨基酸序列為序列2)、AspB(氨基酸 序列為序列3)、BglC(氨基酸序列為序列4)、Bpr(氨基酸序列為序列5)、CccA(氨基酸序列為 序列6)、5 &(^(氨基酸序列為序列7)、￥〇14(氨基酸序列為序列8)、￥1邱(氨基酸序列為序列 9)、恥也(氨基酸序列為序列10)、卩 61(氨基酸序列為序列11)^?也(氨基酸序列為序列12) 和Epr(氨基酸序列為序列13) ICR引物序列如下：
[0057] abnA-F：GTACATAAAAAAGGAGACATGAACGATGAAAAAGAAAAAAACATGG；
[0058] abnA-R：CATATGTGCACCGGCCGCTGCCTCTGCGGGAGCAGCAG；
[0059] amyE-F：GTACATAAAAAAGGAGACATGAACGATGTTTGCAAAACGATTCAAAAC；
[0060] amyE-R：CATATGTGCACCGGCCGCAGCACTCGCAGCCGCCGGTCCTGC；
[0061 ] aspB-F：GTACATAAAAAAGGAGACATGAACGATGAAACTGGCAAAAAGAGTATCC；
[0062] aspB-R：CATATGTGCACCGGCCGCCGCTTTCGCTGTGATTGCCAG；
[0063] bglC-F：GTACATAAAAAAGGAGACATGAACGATGAAACGGTCAATCTCTATTTTTATTACG；
[0064] bglC-R：CATATGTGCACCGGCCGCTGCTGATGCCGGCGAAGCTAT；
[0065] bpr-F：GTACATAAAAAAGGAGACATGAACGATGAGGAAAAAAACGAAAAACAGA；
[0066] bpr-R：CATATGTGCACCGGCCGCTGCCCCGGCTGCTCCCGGAAAC；
[0067] cccA-F：GTACATAAAAAAGGAGACATGAACGATGAAATGGAACCCGCTTATTCCA；
[0068] cccA-R：CATATGTGCACCGGCCGCTCCTTTTACTGATAAAAAGAAAG；
[0069] sacB-F：GTACATAAAAAAGGAGACATGAACATCAAAAAGTTTGCAAAACAAG；
[0070] sacB-R：CATATGTGCACCGGCCGCTTCTTTGGCAAAAGCTTGAGTTGC；
[0071 ] y〇IA-F：GTACATAAAAAAGGAGACATGAAGAGAATTACATATTCACTGCTTG；
[0072] y〇lA-R：CATATGTGCACCGGCCGCCGCTTTTGCTTTTGATGAATCAGTG；
[0073] ylqB-F：GTACATAAAAAAGGAGACATGAAAAAAATCGGTTTATTGTTTATG；
[0074] yIqB-R：CATATGTGCACCGGCCGCAGCGTCTGCTTGCTGTGCCGGG；
[0075] peI-F：GTACATAAAAAAGGAGACATGAAAAAAGTGATGTTAGCTACGGC；
[0076] peI-R：CATATGTGCACCGGCCGCTGCGTTCGCGCCAGCTGGAG；
[0077] aprE-F：GTACATAAAAAAGGAGACATGAGAAGCAAAAAATTGTGGATC；
[0078] aprE-R：CATATGTGCACCGGCCGCGTTCAGCAACATGTCTGTGCAGGCT；
[0079] epr-F：GTACATAAAAAAGGAGACATGAAAAACATGTCTTGCAAAC；
[0080] epr-R:CATATGTGCACCGGCCGCCATAGGCCCTCTCGCTCATGCG。
[0081] 3、分泌表達(dá)載體的獲得
[0082] 將步驟2獲得的13個(gè)信號(hào)肽片段通過(guò)無(wú)縫克隆分別插入步驟1獲得的pWB980-CBP21載體中，分別得到如下13個(gè)溶解性多糖單加氧酶分泌表達(dá)載體:？41^-08?21、?411^-CBP21、pAspB-CBP21、pBglC-CBP21、pBpr-CBP21、pCccA-CBP21、pSacB-CBP21、pYolA-CBP21、 pYlqB-CBP21、pNprE-CBP21、pPel-CBP21、pEpr-CBP21和pAprE-CBP21;
[0083] pAbnA-CBP21為將序列14所示的DNA片段插入pWB980載體的Hind III和Xho I酶切 位點(diǎn)之間，且保持PWB980載體的其他序列不變得到的載體；
[0084] pAmyE-CBP21為將序列15為將序列14所示的DNA片段插入pWB980載體的Hind III 和Xho頂每切位點(diǎn)之間，且保持pWB980載體的其他序列不變得到的載體；
[0085] pAspB-CBP21為將序列16所示的DNA片段插入pWB980載體的Hind III和Xho I酶切 位點(diǎn)之間，且保持PWB980載體的其他序列不變得到的載體；
[0086] pBglC-CBP21為將序列17所示的DNA片段插入pWB980載體的Hind III和Xho I酶切 位點(diǎn)之間，且保持PWB980載體的其他序列不變得到的載體；
[0087] pBpr-CBP21為將序列18所示的DNA片段插入pWB980載體的Hind III和Xho頂每切 位點(diǎn)之間，且保持PWB980載體的其他序列不變得到的載體；
[0088] pCccA-CBP21為將序列19所示的DNA片段插入pWB980載體的Hind III和Xho I酶切 位點(diǎn)之間，且保持PWB980載體的其他序列不變得到的載體；
[0089] pSacB-CBP21為將序列20所示的DNA片段插入pWB980載體的Hind III和Xho I酶切 位點(diǎn)之間，且保持PWB980載體的其他序列不變得到的載體；
[0090] pYolA-CBP21為將序列21所示的DNA片段插入PWB980載體的Hind III和Xho I酶切 位點(diǎn)之間，且保持PWB980載體的其他序列不變得到的載體；
[0091] pHqB-CBP21為將序列22所示的DNA片段插入pWB980載體的Hind III和Xho I酶切 位點(diǎn)之間，且保持PWB980載體的其他序列不變得到的載體；
[0092] pNprE-CBP21為將序列23所示的DNA片段插入pWB980載體的Hind III和Xho I酶切 位點(diǎn)之間，且保持PWB980載體的其他序列不變得到的載體；
[0093] pPel-CBP21為將序列24所示的DNA片段插入pWB980載體的Hind III和Xho頂每切 位點(diǎn)之間，且保持PWB980載體的其他序列不變得到的載體；
[0094] pAprE-CBP21為將序列25所示的DNA片段插入pWB980載體的Hind III和Xho I酶切 位點(diǎn)之間，且保持PWB980載體的其他序列不變得到的載體；
[0095] pEpr-CBP21為將序列26所示的DNA片段插入pWB980載體的Hind III和Xho頂每切 位點(diǎn)之間，且保持PWB980載體的其他序列不變得到的載體。
[0096] 二、重組菌的獲得
[0097]分別將步驟一獲得的無(wú)縫連接產(chǎn)物 pAbnA-CBP21、pAmyE-CBP21、pAspB-CBP21、 pBglC-CBP21、pBpr-CBP21、pCccA-CBP21、pSacB-CBP21、pYolA-CBP21、pnqB-CBP21、pNprE-CBP21、pPeI-CBP21、pEpr-CBP21、pAprE-CBP21 和載體pWB980 (對(duì)照菌）導(dǎo)入枯草芽胞桿菌 168中，分別得到如下重組芽胞桿菌：pAbnA-CBP21/168、pAmyE-CBP21/168、pAspB-CBP21 / 168、pBglC-CBP21/168、pBpr-CBP21/168、pCccA-CBP21/168、pSacB-CBP21/168、pYolA-CBP21/168、pYlqB-CBP21/168、pNprE-CBP21/168、pPel-CBP21/168、pEpr-CBP21/168、 pAprE-CBP21/168和pWB980載體/168,將上述重組菌30°C搖菌3h，并將菌液涂于卡那霉素抗 性平板。次日挑取單克隆，進(jìn)行PCR驗(yàn)證，擴(kuò)大培養(yǎng)后-80°C保存菌株。PCR驗(yàn)證引物：
[0098] PWB980-F：ATACTACCTTGCTG；
[0099] PWBgSOKATTCCCTATCTCGACTTC^PCR 驗(yàn)證結(jié)果如圖 1 所示。其中，1-13:鑒定菌株 依次為含信號(hào)肽 Bpr、AspB、BglC、AmyE、AbnA、CccA、SacB、YolA、YlqB、Pel、AprE、Epr、NprE的 菌株;14:含空載體168菌株。
[0100] 三、CBP21蛋白在不同信號(hào)肽的重組芽胞桿菌的表達(dá)分析
[0101] 1、分別將經(jīng) PCR 驗(yàn)證正確的 pAbnA-CBP21 /168、pAmyE-CBP21 /168、pAspB-CBP21 / 168、pBglC-CBP21/168、pBpr-CBP21/168、pCccA-CBP21/168、pSacB-CBP21/168、pYolA-CBP21/168、pYlqB-CBP21/168、pNprE-CBP21/168、pPel-CBP21/168、pEpr-CBP21/168、 pAprE-CBP21/168和pWB980載體/168接種（接種量為1%)在SR培養(yǎng)基中，200rpm，30°C發(fā)酵 培養(yǎng)24h后，分別得到發(fā)酵液。并用丙酮沉淀發(fā)酵液，獲得的蛋白質(zhì)沉淀。丙酮沉淀蛋白質(zhì)的 具體步驟如下：
[0102] (1)使用分光光度儀在波長(zhǎng)0D600下，測(cè)發(fā)酵液濃度，取100D菌液12000rpm離心 5min，取上清，等體積加入丙酮，-20 °C沉淀20min;
[0103] (2) 12000rpm 離心 5min，棄上清，80yL PBS 重懸沉淀，再加入 20yL SDS Ioadingbuffer，100°C 沸水浴 5min。
[0104] 2、分別將蛋白質(zhì)沉淀制成蛋白樣品進(jìn)行蛋白電泳，電泳結(jié)果如2所示，從圖中可以 看出，在20KD處對(duì)應(yīng)的蛋白條帶為CBP21，13條泳道中，信號(hào)肽YlqB和Pel對(duì)應(yīng)的CBP21的蛋 白量要顯著高于其他信號(hào)肽對(duì)應(yīng)的信號(hào)肽。說(shuō)明由HqB和Pel引導(dǎo)的CBP21分泌量最高。
[0105] 四、CBP21與膠體幾丁質(zhì)結(jié)合實(shí)驗(yàn)
[0106] 取步驟三獲得的發(fā)酵液上清進(jìn)行CBP21蛋白與膠體幾丁質(zhì)結(jié)合實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)步驟如 下：
[0107] (1)取發(fā)酵液上清，測(cè)總蛋白濃度，再用PBS(pH7 · 4，是將0 · 24g磷酸二氫鉀、1 · 44g 磷酸氫二鈉、8. Og氯化鈉和0.2g氯化鉀加水至1000 mL混勻得到的）把總蛋白濃度調(diào)到100μ g/ml；
[0108] (2)將20(^1發(fā)酵液與20(^1的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.1%的膠體幾丁質(zhì)混勻，得到反應(yīng)體 系，反應(yīng)體系中總蛋白濃度為50yg/m 1，膠體幾丁質(zhì)的濃度是5mg/m 1;
[0109] (3)將反應(yīng)體系在37°C水浴鍋靜置，16h后取樣，13000rpm離心3min，取上清；
[0110] (4)檢測(cè)上清中剩余蛋白含量；
[0111] (5)每組設(shè)置3個(gè)平行，并設(shè)置空白對(duì)照組(PBS+0.5mg/ml膠體幾丁質(zhì)）、膠體幾丁 質(zhì)+空載上清、對(duì)照組(buffer+總蛋白定量后上清）。
[0112] (6)計(jì)算每個(gè)實(shí)驗(yàn)組結(jié)合蛋白的量。公式為:結(jié)合蛋白=總蛋白-游離蛋白-空載體 (空載總蛋白-空載游離蛋白）?？偟鞍讟?biāo)準(zhǔn)曲線的制定方法如下：用PBS緩沖液將胎牛血清 蛋白BSA(lmg/mL)稀釋成不同濃度的溶液，將45yL各個(gè)溶液(BSA濃度分別為：20yg/mL、40y g/mL、60yg/mL、80yg/mL、IOOyg/mL、120yg/mL、140yg/mL、160yg/mL、180yg/mL、200yg/mL)分 別與855yL考馬斯亮藍(lán)溶液混勻，將試管室溫靜置lOmin，使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定595nm波 長(zhǎng)處吸光度。以吸光度值為橫坐標(biāo)，BSA的濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3)。
[0113]各信號(hào)肽對(duì)應(yīng)的結(jié)合蛋白量的檢測(cè)結(jié)果如圖4所示，從圖中可以看出，和其他信號(hào) 肽相比，信號(hào)肽YlqB和Pel引導(dǎo)分泌的溶解性多糖單加氧酶CBP21的量明顯高于其他信號(hào) 肽。其中，信號(hào)肽HqB引導(dǎo)分泌的溶解性多糖單加氧酶CBP21的量是最高。
[0114] 實(shí)施例2、溶解性多糖單加氧酶CBP21在提高幾丁質(zhì)酶活性中的應(yīng)用
[0115] 本發(fā)明測(cè)定了溶解性多糖單加氧酶CBP21對(duì)幾丁質(zhì)酶Chi92和一種來(lái)自于 Serratia marcescens的幾丁質(zhì)酶(購(gòu)自sigma)，這兩種酶分別來(lái)自于幾丁質(zhì)酶家族19和幾 丁質(zhì)酶家族18。
[0116] I、溶解性多糖單加氧酶CBP21的純化
[0117]將實(shí)施例1中的信號(hào)肽YlqB引導(dǎo)分泌的溶解性多糖單加氧酶CBP21發(fā)酵液上清經(jīng) 截流量為IOkDa的膜包50倍濃縮、脫鹽和利用HiTrap Q XL陰離子柱純化后，得到純化后的 溶解性多糖單加氧酶CBP21。
[0118] 純化具體步驟如下：
[0119] (1)溶液配制：
[0120] Tris-HCl溶液:0·5mol Tris-HCl溶于IL去離子水中。
[0121] 結(jié)合液:20mmol Tris_HCl，0.5mol NaCl，20mmol咪唑溶于IL去離子水中。
[0122] 洗脫液：20mmol Tris-HCl，0.5mol NaCl，0.5mol咪唑溶于IL去離子水中。
[0123] (2)超濾濃縮:20mL上清液過(guò)0.22um濾器轉(zhuǎn)移至超濾柱，4 °C，4000rpm超濾上清液 Ih，得到ImL濃縮液；
[0124] (3) 5mL結(jié)合液注射進(jìn)鎳柱，以平衡柱內(nèi)pH;
[0125] (4) ImL濃縮液注射器緩慢流進(jìn)鎳柱；
[0126] (5) IOmL結(jié)合液洗鎳柱；
[0127] (6) ImL洗脫液洗脫，收集洗脫液；
[0128] (7) 20 %乙醇I OmL洗柱子，封柱，4 °C保存；
[0129] (8)洗脫液置于透析袋里，過(guò)夜4 °C透析；
[0130] 結(jié)果如圖5所示，純化后帶His標(biāo)簽的CBP21蛋白的大小在20-21kDa之間。
[0131] 2、溶解性多糖單加氧酶促進(jìn)幾丁質(zhì)酶活性
[0132] 溶解性多糖單加氧酶促進(jìn)幾丁質(zhì)酶活性的測(cè)定采用DNS法，具體步驟如下：
[0133] (I)N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定
[0134] 用pH7.0、0.1mol/L的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液將N-乙?；咸烟桥渲贸刹煌瑵?度的溶液，將〇 · 5mL各個(gè)溶液(N-乙酰氨基葡萄糖含量分別為:5 · 5μπι〇1、7 · Ιμπιο?、8 · 3μπι〇1、 10. Ομπιο?、12.5μL?〇1、16.7μL?〇1)分別與Iml的DNS溶液混勾，沸水浴5min后顯色，然后用蒸餾 水補(bǔ)齊至2.5mL，冷卻至室溫后，在波長(zhǎng)540nm吸收光測(cè)定OD值，繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線 及曲線方程(圖6)。
[0135] (2)實(shí)驗(yàn)分組及方法
[0136] 按照是否加入溶解性多糖單加氧酶CBP21分成如下實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組：
[0137] 實(shí)驗(yàn)組（Chitinase from Serratia marcescens):將250yL 1 ·0%底物與250yL IOOnM的CBP21純品（步驟1中純化后的溶解性多糖單加氧酶CBP21)，于37°C分別孵育0h、2h、 6h、12h、24h、48h、96h后，加入250yL 42nM酶液（Chitinase from Serratia marcescens)， 進(jìn)行反應(yīng)(3個(gè)平行），于37°C準(zhǔn)確孵育Ih后，加入2mL DNS終止反應(yīng)。100°C水浴5min，流水冷 卻至室溫;室溫12000rpm離心5min，測(cè)定上清的0D540值。
[0138] 實(shí)驗(yàn)組(Chi92):將250yL 1.0%底物與250yL IOOnM的CBP21純品（步驟1中純化后 的溶解性多糖單加氧酶CBP21)，于37°C分別孵育他、211、611、1211、2411、4811、9611后，加入25(^1^ 42nM酶液(Chi92)，進(jìn)行反應(yīng)(3個(gè)平行），于37°C準(zhǔn)確孵育Ih后，加入2mL DNS終止反應(yīng)。100 °C水浴5min，流水冷卻至室溫;室溫12000rpm離心5min，測(cè)定上清的0D540值。
[0139] 對(duì)照組：將250yL 1.0%底物與250yL PBS(不含CBP21)，于37°C分別孵育0h、2h、 6h、12h、24h、48h、96h后，加入250yL 42nM酶液，進(jìn)行反應(yīng)(3個(gè)平行），于37°C準(zhǔn)確孵育Ih后， 加入2mL DNS終止反應(yīng)。100°C水浴5min，流水冷卻至室溫；室溫12000rpm離心5min，測(cè)定上 清的0D540值。
[0140]上述底物:質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 %的膠體幾丁質(zhì)。具體制備方法:準(zhǔn)確稱取IOg幾丁質(zhì)粉末 置于燒杯中，緩慢加入預(yù)冷的濃HCl 400mL，攪拌使其呈糊狀，4°C靜置24h;將其緩慢加入到 盛有2000mL乙醇:水（l:l，v/v)溶液的燒杯中，邊加邊使用磁力攪拌器攪拌，4°C靜置24h;溶 液于4°C、12000rpm離心10min，棄上清；沉淀即膠體幾丁質(zhì)用蒸餾水沖洗、離心、沖洗至pH 7.0，最后用蒸餾水定容至1000 mL。置于4 °C冰箱保存。
[0141 ] 上述酶液:幾丁質(zhì)酶Chi92和來(lái)自于Serratia marcescens的幾丁質(zhì)酶。
[0142] 酶活定義:單位幾丁質(zhì)酶對(duì)底物作用單位時(shí)間，所產(chǎn)生的N-乙酰氨基葡萄糖的量 (mol);相對(duì)酶活:在相同時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組(加 CBP21)和對(duì)照組(不加 CBP21)產(chǎn)生N-乙酰氨基葡 萄糖的比值。
[0143] 結(jié)果表明如圖7所示:和不加入溶解性多糖單加氧酶CBP21的對(duì)照組相比，加入溶 解性多糖單加氧酶CBP21的實(shí)驗(yàn)組對(duì)幾丁質(zhì)酶Chi92和一種來(lái)自于Serratia marcescens的 幾丁質(zhì)酶的酶活均能產(chǎn)生極顯著的促進(jìn)作用，說(shuō)明CBP21對(duì)幾丁質(zhì)酶酶促作用具有普適性。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種重組菌，為在枯草芽胞桿菌中通過(guò)源于枯草芽胞桿菌的信號(hào)肽引導(dǎo)溶解性多糖 單加氧酶CBP21的表達(dá)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組菌，其特征在于:所述源于枯草芽胞桿菌的信號(hào)肽為信號(hào) 肽HqB或信號(hào)肽Pel; 所述信號(hào)肽HqB的氨基酸序列為序列9; 所述信號(hào)肽Pel的氨基酸序列為序列11。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的重組菌，其特征在于： 所述信號(hào)肽HqB的編碼基因序列為序列22的第1-81位核苷酸分子； 所述信號(hào)肽Pel的編碼基因序列為序列24的第1-63位核苷酸分子。4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的重組菌，其特征在于:所述在枯草芽胞桿菌中通過(guò)源 于枯草芽胞桿菌的信號(hào)肽引導(dǎo)溶解性多糖單加氧酶CBP21的表達(dá)的方法為如下1)或2): 1) 將含有信號(hào)肽YlqB編碼基因和溶解性多糖單加氧酶CBP21編碼基因的片段導(dǎo)入枯草 牙胞桿囷中； 2) 將含有信號(hào)肽Pel編碼基因和溶解性多糖單加氧酶CBP21編碼基因的片段導(dǎo)入枯草 芽胞桿菌中。5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的重組菌，其特征在于： 所述含有信號(hào)肽HqB編碼基因和溶解性多糖單加氧酶CBP21編碼基因的片段的核苷酸 序列為序列22; 所述含有信號(hào)肽Pel編碼基因和溶解性多糖單加氧酶CBP21編碼基因的片段的核苷酸 序列為序列24。6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5中所述的重組菌，其特征在于:所述枯草芽胞桿菌為枯草芽胞桿菌 168〇7. 權(quán)利要求1-6中任一所述的含有信號(hào)肽YlqB編碼基因和溶解性多糖單加氧酶CBP21 編碼基因的片段或權(quán)利要求1-6中任一所述的含有信號(hào)肽Pel編碼基因和溶解性多糖單加 氧酶CBP21編碼基因的片段。8. 權(quán)利要求1-6中任一所述的重組菌或權(quán)利要求1-6中任一所述的信號(hào)肽YlqB或權(quán)利 要求1-6中任一所述的信號(hào)肽Pel在促進(jìn)和/或提高幾丁質(zhì)酶活性中的應(yīng)用。9. 權(quán)利要求1-6中任一所述的重組菌或權(quán)利要求1-6中任一所述的信號(hào)肽YlqB或權(quán)利 要求1-6中任一所述的信號(hào)肽Pel在提高溶解性多糖單加氧酶CBP21的分泌量中的應(yīng)用； 或權(quán)利要求1 -6中任一所述的重組菌或權(quán)利要求1 -6中任一所述的信號(hào)肽Y1 qB或權(quán)利 要求1-6中任一所述的信號(hào)肽Pel在生產(chǎn)溶解性多糖單加氧酶CBP21中的應(yīng)用。10. -種生產(chǎn)溶解性多糖單加氧酶CBP21的方法，包括如下步驟:發(fā)酵培養(yǎng)權(quán)利要求1-6 中任一所述的重組菌，得到所述溶解性多糖單加氧酶CBP21。
【文檔編號(hào)】C12N1/21GK105861403SQ201610236250
【公開日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年4月15日
【發(fā)明人】周志剛, 李志敏, 潘興亮, 楊雅麟, 柳學(xué)偉, 李娟 , 劉智, 徐俐
【申請(qǐng)人】中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所