KE修飾的1-乙酰基-β-咔啉酰-色氨酸,其制備,納米結(jié)構(gòu),活性及應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了下面結(jié)構(gòu)的Lys-Glu(KE)修飾的1-乙?；?β-咔啉酰-色氨酸，公開了它的制備方法，公開了它的納米結(jié)構(gòu)，公開了它抗腫瘤細(xì)胞粘附的作用，公開了它抗腫瘤細(xì)胞侵襲的作用，公開了它抗腫瘤細(xì)胞遷移的作用，公開了它的抗腫瘤作用，進(jìn)一步公開了它抑制腫瘤向肺轉(zhuǎn)移的作用。因而本發(fā)明公開了它在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用。
【專利說明】
KE修飾的1-乙酰基-β -卩卡啉酰-色氨酸，其制備，納米 結(jié)構(gòu)，活性及應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及Lys-Glu修飾的1-乙酰基-β -咔啉酰-色氨酸，涉及它的制備方法， 涉及它的納米結(jié)構(gòu)，涉及它抗腫瘤細(xì)胞粘附的作用，涉及它抗腫瘤細(xì)胞侵襲的作用，涉及它 抗腫瘤細(xì)胞迀移的作用，涉及它的抗腫瘤作用，進(jìn)一步涉及它抑制腫瘤向肺轉(zhuǎn)移的作用。因 而本發(fā)明涉及它在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用。本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 惡性腫瘤嚴(yán)重威脅人類的健康。除了自身對腫瘤患者的預(yù)后惡劣之外，惡性腫瘤 并發(fā)的炎癥、血栓和轉(zhuǎn)移進(jìn)一步惡化患者的預(yù)后。例如，超過90%以上的惡性腫瘤患者都是 死于腫瘤轉(zhuǎn)移。腫瘤轉(zhuǎn)移依賴于4個因素：1)腫瘤細(xì)胞表面形成微血栓，逃避巨噬細(xì)胞吞 噬，通過血液循環(huán)迀移到遠(yuǎn)端；2)迀移到遠(yuǎn)端的腫瘤細(xì)胞粘附到血管壁；3)細(xì)胞粘附到血 管壁的腫瘤細(xì)胞通過侵襲出血管而進(jìn)入正常組織。
[0003] 由于現(xiàn)有抗腫瘤藥物不具備抗轉(zhuǎn)移作用，所以療效不理想。發(fā)明同時具有抗腫瘤 和抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用的藥物是臨床的迫切需求。
[0004] RGD四肽，即RGDS，RGDF和RGDV是整合素 α ν β 3的阻斷劑，具有抗血栓和抗細(xì)胞粘 附活性。RGDS則具備抗腫瘤細(xì)胞迀移作用。
【申請人】曾經(jīng)把RGD四肽與雌激素偶聯(lián)，制備沒 有凝血副作用的抗骨質(zhì)疏松劑。
【申請人】曾經(jīng)把RGD四肽與四氫-β -咔啉-3-羧酸偶聯(lián)制備 高效的抗血栓劑。
【申請人】也曾經(jīng)用氨基酸修飾四氫-β -咔啉-3-羧酸、β -咔啉-3-羧酸 及1-位取代的β -咔啉-3-羧酸，包括1-位取代的四氫-β -咔啉-3-羧酸或1-位取代 的β-咔啉-3-羧酸制備高效的抗血栓劑或抗腫瘤劑。盡管發(fā)明人付出了大量研究精力， 篩選了數(shù)百種化合物，一直沒有得到同時具有抗腫瘤和抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用的化合物。
[0005] 發(fā)明人在分析數(shù)百種化合物的結(jié)構(gòu)及活性變化的基礎(chǔ)上，認(rèn)識到用Lys-Glu修飾 的1-乙?；?β -咔啉酰-色氨酸，形成的化合物會同時具有抗腫瘤和抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用。基 于這個認(rèn)識，發(fā)明人提出了本發(fā)明。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的第一個內(nèi)容是提供Lys-Glu修飾的1-乙?；?β -咔啉酰-色氨酸。
[0007]
[0008] 本發(fā)明的第二個內(nèi)容是提供Lys-Glu修飾的1-乙酰基-β -咔啉酰-色氨酸的制 備方法，該方法由以下步驟構(gòu)成：
[0009] (1)室溫下，L-Trp-OMe與1，3-二羥基丙酮在稀鹽酸條件下反應(yīng)48h，過濾得到濾 餅。濾餅溶解于二氧六環(huán)，得到的溶液在冰鹽浴下用2N的NaOH水溶液調(diào)節(jié)pH至12,反應(yīng) l〇h，得到1-乙?；?β -咔啉酰-3-羧酸；
[0010] (2) 1-乙?；?β -咔啉酰-3-羧酸與L-Trp-〇BZ 1反應(yīng)并皂化制備1-乙酰 基-β-咔啉酰-3-色氨酸；
[0011] (3)將Lys (Fmoc) -Glu (OBzl) -OBzl與1-乙?；?β -咔啉酰-3-色氨酸偶聯(lián)制備 卜乙酰基-β - Ρ專啉酰-色氨酰-Lys (Fmoc) -Glu (OBzl) -〇Bzl ;
[0012] (4)將1-乙?；?β -咔啉酰-色氨酰-Lys (Fmoc) -Glu (OBzl) -OBzl脫保護(hù)制備 l-乙?；?β -味啉酰-色氨酰-Lys-Glu。
[0013] 本發(fā)明的第三個內(nèi)容是評價1-乙?；?β -咔啉酰-色氨酰-Lys-Glu的抗細(xì)胞 增殖活性。
[0014] 本發(fā)明的第四個內(nèi)容是評價1-乙酰基-β -咔啉酰-色氨酰-Lys-Glu抗腫瘤細(xì) 胞粘附，侵襲和迀移的作用。
[0015] 本發(fā)明的第五個內(nèi)容是評價1-乙?；?β -咔啉酰-色氨酰-Lys-Glu的抗腫瘤 轉(zhuǎn)移作用。
[0016] 本發(fā)明的第六個內(nèi)容是評價1-乙?；?β -咔啉酰-色氨酰-Lys-Glu的抗腫瘤 作用。
【附圖說明】
[0017] 圖1、· 1-乙?；?β_咔啉酰-色氨酰-Lys-Glu的合成路線· i)CH30H，S0Cl2;ii) DHA，HC1 ;iii)2N NaOH，二氧六環(huán)；iv)Trp-〇Bzl，DCC，HOBt，NMM ;v)2N NaOH，THF ;vi)DCC， HOBt，NMM ;TFA/TFSA。
[0018] 圖2、1-乙酰基-β -咔啉酰-色氨酰-Lys-Glu在水溶液中1 X 10 9M濃度下的透 射電鏡照片。
【具體實施方式】
[0019] 為了進(jìn)一步闡述本發(fā)明，下面給出一系列實施例。這些實施例完全是例證性的，它 們僅用來對本發(fā)明進(jìn)行具體描述，不應(yīng)當(dāng)理解為對本發(fā)明的限制。
[0020] 實施例1制備1-乙?；?β -咔啉-3-羧酸甲酯
[0021] 稱取5g L-Trp-〇Me于100ml茄瓶中，加入10ml 37°C溫水?dāng)嚢枞芙?，加?. 3g 1， 3-二羥基丙酮。室溫反應(yīng)36h，離心，棄去水層，沉淀晾干，得到lg(收率20% )標(biāo)題化合 物，為棕色固體，待用。ESI-MS(m/e) :257[M+H]+。
[0022] 實施例2制備1-乙?；?β -咔啉-3-羧酸
[0023] 稱取5gl-乙酰基-β -咔啉-3-羧酸甲酯于250ml茄瓶中，加入二氧六環(huán)溶解，冰 浴緩慢加入2N NaOH水溶液調(diào)節(jié)pHl2，反應(yīng)13h。反應(yīng)液用飽和KHS04水溶液調(diào)節(jié)pH8，減壓 濃縮。殘留物用飽和KHS0 4調(diào)節(jié)pH2,有機(jī)層用乙酸乙酯萃取3次，減壓濃縮，得到4g (80% ) 標(biāo)題化合物，為棕黃色固體。ESI-MS(m/e) :241[M-H]。
[0024] 實施例3制備1-乙-?；?β -咔啉酰-色氨酸芐酯
[0025] 稱取2gl-乙?；?β -咔啉-3-羧酸，用10ml無水THF溶解，冰浴下加入2g DCC， 1. 2gH0Bt，攪拌30min，得溶液A。3. 2g Trp-OBzl溶于15ml無水THF，緩慢加入N-甲基嗎 啉調(diào)節(jié)溶液pH9,得溶液B。冰浴下將B液緩慢加入A液當(dāng)中，用N-甲基嗎啉調(diào)節(jié)pH9,反 應(yīng)12h，TLC顯示原料消失（石油醚：丙酮=4 : 1)。反應(yīng)混合物過濾，濾液減壓濃縮，殘留 物用乙酸乙酯萃取3次，減壓濃縮，得到的4. 38g糖漿狀產(chǎn)物用石油醚/丙酮體系干柱層析 純化（石油醚/丙酮=4/1)得到2g(46% )標(biāo)題化合物，為黃色固體產(chǎn)率。ESI-MS(m/e): 531[M+H]+〇
[0026] 實施例4制備1-乙?；?β -咔啉酰-色氨酸
[0027] 稱取2gl-乙?；?β -咔啉-3-?；?Trp-OBzl，無水THF溶解。冰浴下加入2Ν NaOH水溶液，調(diào)節(jié)pH12,反應(yīng)1. 5h。TLC顯示原料點消失（石油醚/丙酮=2/1)，反應(yīng)液用 飽和KHS04水溶液調(diào)節(jié)pH8,減壓濃縮，殘留物用飽和KHS0 4調(diào)節(jié)pH2,有機(jī)層用乙酸乙酯萃 取3次，減壓濃縮，得到1. 5g(90% ) 1化合物，為黃色固體。ESI-MS(m/e) :529[M-H]。
[0028] 實施例 5 制備 Boc-Lys (Fmoc) -Glu (OBzl) -〇Bzl
[0029] 按照實施例 3 的方法由 3g (6. 4mmol) Boc-Lys (Fmoc)和 3. 35g (6. 7mmol) (TosH)2*Glu(0Bzl)-0Bzl，反應(yīng)12h。用二氯甲烷-甲醇（二氯甲烷：甲醇=120 : 1)純 化得 3. 35g(67% )標(biāo)題化合物，ESI-MS(m/e) :777. 5[M+H]+。
[0030] 實施例 6 制備 HC1 · Lys (Fmoc) -Glu (OBzl) -OBzl
[0031] 稱取3. 35g(4. 3mmol) 1-乙?；?β -咔啉-3-酰基-Trp-〇Bzl，無水THF溶解。冰浴 下加入2N NaOH水溶液，調(diào)節(jié)pH12,反應(yīng)1. 5h。TLC顯示原料點消失（石油醚/丙酮=2/1)， 反應(yīng)液用飽和KHS04水溶液調(diào)節(jié)pH8,減壓濃縮，殘留物用飽和KHS0 4調(diào)節(jié)pH2,有機(jī)層用乙 酸乙酯萃取3次，減壓濃縮，得到2. 7g(88% )目標(biāo)化合物，ESI-MS(m/e) :678. 5[M+H]+。
[0032] 實施例7制備1-乙?；?β -咔啉酰-色氨酰-Lys (Fmoc) -Glu (OBzl) -OBzl
[0033] 按照實施例3的方法由0· 580g(l. 32mmol) 1-乙?；?β -咔啉-3-?；?Trp和 lg(1. 4mmol)HC1 · Lys (Fmoc)-Glu (OBzl)-〇Bzl，反應(yīng) 18h 得到 350mg 標(biāo)題化合物（24% )， ESI-MS(m/e) :1099[M+H]+〇
[0034] 實施例8制備制備1-乙?；?β -咔啉酰-色氨酰-Lys-Glu (2)
[0035] 稱取 lOOmgl-乙酰基-β -味啉-3-?；?色氨酸-Lys (Fmoc) -Glu (OBzl) -OBzl 于 250ml茄瓶中，冰浴攪拌下依次加入4ml三氟甲磺酸和lml三氟乙酸，冰浴攪拌1小時，反 應(yīng)結(jié)束。冰浴攪拌下加入50ml無水乙醚，析出黃色絮狀固體，離心，乙醚洗3次，得黃色固 體，冰浴下將其溶于2ml蒸餾水，滴加1 %氨水調(diào)至pH = 5,減壓過濾除去不溶物，濾液減壓 濃縮，殘留物經(jīng)C18柱層析純化（甲醇：水=8 : 1)，得15mg(24%)標(biāo)題化合物，為淡黃 色固體。ESI-MS (m/e) :696 [M-H] ;Mp :215. 3-217. %~ ; [ a ] D25= -21. 3 (c = 0· 08, CH 30H); ^ΝΜ?ΚδΟΟΜΗζ，DMS0-d6) : δ/ppm = 12. 15(s，lH)，11.01(s，lH)，9.02(s，lH)，8.53(m，2H)， 8.42(d，J = 7.5Hz，lH)，8.31(d，J = 7.5Hz，lH)，8.20(s，2H)，7.80(d，J = 8.0Hz，lH)， 7. 65 (d，J = 8. 0Hz，1H)，7. 59 (m，1H)，7. 30 (m，3H)，6. 99 (m，1H)，6. 85 (m，1H)，4. 84 (m，1H)， 4. 37 (m，1H)，4. 22 (m，1H)，3. 33 (m，2H)，2. 71 (m，2H)，2. 48 (s，3H)，2. 30 (m，2H)，1. 99 (m，1H)， 1. 84 (m，1H)，1. 73 (m，1H)，1. 62 (m，1H)，1. 60 (m，2H)，1. 59 (m，2H) ;HPLC 純度 95. 2 %，乙腈： 水=7 : 3。波長 280nm，流速 0.75ml/min。
[0036] 實驗例1測定化合物2的透射電鏡照片
[0037] 將化合物2按照1 X 10 9M的濃度配置化合物的水溶液，均勻的鋪在銅網(wǎng)上，在透射 電鏡（TEM，JEM-1230, JE0L)下觀察化合物的自組裝性質(zhì)。得到的照片如圖2。結(jié)果表明， 化合物2在水中均可形成納米顆粒，直徑在25-125nm。
[0038] 實驗例2測定化合物2的細(xì)胞毒作用
[0039] 1)本發(fā)明的化合物2用含0. 1 % DMS0的培養(yǎng)基配制成所需濃度；
[0040] 2)實驗用的腫瘤細(xì)胞為SH-SY5Y (人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞），HL60 (人早幼粒細(xì)胞白 血病細(xì)胞），HeLa (人宮頸癌細(xì)胞），S180 (鼠腹水瘤細(xì)胞），HeCaT (人永生化表皮細(xì)胞）；
[0041] 3)HL60 和 S180 細(xì)胞株采用 RPMI-1640 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。HeLa、SH-SY5Y、HeCaT 三 株細(xì)胞采用DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)基中均含10 %經(jīng)滅活的胎牛血清和1 X 105U/L青 霉素和100mg/L鏈霉素。
[0042] 4)貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)方法：分別將處于對數(shù)生長期且生長狀態(tài)良好的HeLa、 3^￥5￥、他031'細(xì)胞以5\10 4個/11^的密度接種于96孔板，每孔10(^1^37.5°(：、5%〇)2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8-10h，按預(yù)設(shè)的濃度梯度加入受試樣品（受試樣品經(jīng)過預(yù)先滅菌），對照組 加入等體積的溶解樣品的溶劑。繼續(xù)培養(yǎng)48h (24h觀察細(xì)胞狀態(tài)），每孔加25 μ L濃度為 5mg/mL的ΜΤΤ溶液，置于37. 5。。孵育四個小時，排槍小心吸去上清液后每孔加入100 μ L的 二甲基亞砜（DMS0)，振蕩約15min溶解沉淀。立即于酶標(biāo)儀上檢測O.D.(吸光度）值，波長 490nm〇
[0043] 5)懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)方法：分別將處于對數(shù)生長期且生長狀態(tài)良好的HL60和S180 細(xì)胞以5 X 104個/mL的密度接種于96孔板，每孔100 μ L，37 °C、5 % C0 2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 8-10h，按預(yù)設(shè)的濃度梯度加入受試樣品（受試樣品經(jīng)過預(yù)先滅菌），對照組加入等體積的 溶解樣品的溶劑。繼續(xù)培養(yǎng)48h (24h觀察細(xì)胞狀態(tài)），每孔加25 μ L濃度為5mg/mL的MTT 溶液，置于37°C孵育4h，離心，3000rpm，5min，排槍小心吸去上清液后每孔加入100 μ L的二 甲基亞砜（DMS0)，振蕩約15min溶解沉淀。立即于酶標(biāo)儀上檢測0. D.(吸光度）值，波長 490nm〇
[0044] 6)按照以下計算公式求出每個樣品濃度下的樣品對腫瘤細(xì)胞的抑制率：
[0045] 生長抑制率=[(空白組平均O.D.值一樣品組平均O.D.值）/空白組平均 O.D.值]X 100%，每個濃度下實驗重復(fù)三次，取平均值。平均抑制率對藥物濃度作圖，并求 出IC5。值，結(jié)果列入表1?；衔?抑制5種腫瘤細(xì)胞增殖的1C 5。均大于100 μ M，沒有細(xì)胞 毒作用。
[0046] 表1化合物2的體外抗腫瘤細(xì)胞增殖活性（IC5。。（?ΧΟμΜ))
[0047]
[0048] 實驗例3評價化合物2的抗腫瘤活性
[0049] 受試化合物：1-乙?；?β -咔啉酰-色氨酸芐酯，化合物2 ;
[0050] 實驗動物：ICR小鼠，雄性，體重20±2g(x土SD);北京維通利華動物實驗技術(shù)有限 公司提供。給藥組每組12只小鼠，空白及陽性對照組每組各15只小鼠。
[0051] 瘤源：小鼠 S180肉瘤，北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動物實驗中心提供，自行傳代維持。
[0052] 溶劑：受試化合物懸浮于0. 5%羧甲基纖維素鈉（CMCNa)溶液。阿霉素溶于生理 鹽水。
[0053] 化合物2a_c組的S180小鼠口服給藥，每天給藥一次，劑量為0. 1 μπιο?/kg，連續(xù)給 藥10天。陰性對照組的S180小鼠口服生理鹽水，每次0.2mL/只，連續(xù)給10天。陽性對照 組的S180小鼠腹腔注射阿霉素，每天給藥一次，劑量為2 μ mol/kg，連續(xù)給藥10天。
[0054] 采用自行傳代的S180腹水瘤模型小鼠，取小鼠腹水S180瘤液，離心、去除雜質(zhì) 后，接種于健康小鼠腋下，構(gòu)建S180實體瘤模型：在無菌條件下，處死腹水瘤小鼠，于75% 酒精中浸泡l〇min消毒，取出小鼠于表面皿中晾干酒精，打開腹腔，抽取接種7天后生長旺 盛S180腹水瘤瘤液，用生理鹽水稀釋成（瘤液：生理鹽水=1 : 2)的液體，混合，離心 5min (1000轉(zhuǎn)），去除細(xì)胞碎片，取細(xì)胞液于生理鹽水中，用新鮮配制的0. 2%臺盼藍(lán)染色， 混勻后按細(xì)胞計數(shù)方法計數(shù)，染藍(lán)色者為死細(xì)胞，不染色者為活細(xì)胞，按如下公式計算細(xì)胞 濃度和細(xì)胞存活率；
[0055] 細(xì)胞濃度=4大方格內(nèi)活細(xì)胞數(shù)/4X 104X稀釋倍數(shù)=細(xì)胞數(shù)/mL ;
[0056] 細(xì)胞存活率=活細(xì)胞數(shù)八活細(xì)胞數(shù)+死細(xì)胞數(shù)）X 100% ;
[0057] 將存活率大于90%的瘤液用勻漿法制備成IX 107個/mL的細(xì)胞懸液，于健康小鼠 腋皮下接種〇. 2mL/只，小鼠體重為20±2g。
[0058] 每天觀察各給藥組動物的反應(yīng)：小鼠的自主活動能力、精神狀態(tài)、毛發(fā)顏色、呼吸 狀態(tài)、飲食情況、糞便性狀。
[0059] 每組連續(xù)給藥7天后，于第8天稱取小鼠體重，乙醚麻醉并脫頸椎處死，然后用鑷 子固定小鼠右腋腫瘤生長部位，剪開皮膚使腫瘤完全暴露，鈍性剝離，稱瘤重，以i±SD g 表示，結(jié)果列入表2。數(shù)據(jù)統(tǒng)計均采用t檢驗和方差分析。
[0060] 可以看出，在化合物2的給藥劑量為0. 1 μ mol/kg時對治療小鼠的瘤重有顯著影 響?？梢?，化合物2的抗腫瘤作用的有效劑量為0. 1 μ mol/kg。
[0061] 表2化合物2對S180荷瘤小鼠瘤重的影響
[0062]
[0063] η = 12 ;a)與生理鹽水組比P < 0· 01
[0064] 實驗例4化合物2抗腫瘤細(xì)胞粘附的活性
[0065] 1)受試樣品
[0066] 化合物2用含(λ 1 % DMS0的DMEM培養(yǎng)基配制成100 μ Μ濃度。
[0067] 2)細(xì)胞株
[0068] 高轉(zhuǎn)移的HCC-LM3細(xì)胞。
[0069] 3)主要試劑
[0070] DMEM培養(yǎng)基干粉：購自Gibco公司；
[0071] PBS 緩沖液：每 1L 溶液中含有 NaCl 8. 2g、KC1 0· 2g、Na2HP04 · H20 1. 56g、ΚΗ2Ρ04 0· 2g，PH 值 7. 4 ;
[0072] 胎牛血清：購自Hyclone公司；
[0073] 0· 25%胰酶溶液：購自Hyclone公司；
[0074] 青霉素、鏈霉素：購自石藥集團(tuán)中諾藥業(yè)（石家莊）有限公司；
[0075] MTT (四噻唑藍(lán)）：購自solarbio公司，溶于PBS溶液中，制成5mg/mL的溶液，過濾 除菌后使用，避光保存；
[0076] DMS0(二甲基亞諷）：購自Hyclone公司；
[0077] Fn (人纖維連接蛋白）：購自Sigma公司。
[0078] 4)實驗方法
[0079] 用PBS配制100 μ g/mL的Fn溶液，按100 μ L/孔加入96孔培養(yǎng)板中，將培養(yǎng)板置 于4°C冰箱過夜。次日，吸除未包被的Fn溶液，用PBS洗一次，每孔加入含2% FBS的PBS溶 液30 μ L封板，在37°C和5% 0)2的培養(yǎng)箱中孵育3小時，棄去各孔溶液。將生長狀態(tài)良好、 處于對數(shù)生長期的HCC-LM3細(xì)胞以5X 104個/mL的密度接種于包被Fn的96孔板中，每孔 100 μ L，同時加入2a-c 25 μ L，使其終濃度為20nM，在37°C、5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2小時， 用PBS洗去未粘附的細(xì)胞，棄去PBS后每孔加25 μ L濃度為5mg/mL的MTT溶液，置于37°C、 5% C02培養(yǎng)箱中孵育4個小時，小心除去上清液后每孔加入100 μ L的DMS0,振蕩約10min 溶解沉淀，立即于酶標(biāo)儀570nm波長下檢測O.D.(吸光度）值。粘附抑制率的計算公式如 下：粘附抑制率（％ ) = [l-(2a-c組細(xì)胞0D值/空白組細(xì)胞0D值）]X 100%;實驗數(shù)據(jù)統(tǒng) 計均采用t檢驗和方差分析，粘附抑制率以±SD)表示。
[0080] 6)實驗結(jié)果
[0081] 化合物2的抗細(xì)胞粘附實驗結(jié)果列入表3。從結(jié)果中可以看出，化合物2在2uM時 有較弱的抗HCC-LM3細(xì)胞與FN粘附的作用，當(dāng)濃度增大到20 μ Μ時，化合物2抗HCC-LM3 細(xì)胞與FN粘附的作用明顯增強(qiáng)。
[0082] 表3化合物2的體外抗腫瘤細(xì)胞粘附評價
[0083]
[0084] 實驗例5化合物2抗腫瘤細(xì)胞侵襲的活性
[0085] 1)化合物2用含0. 1 % DMS0的DMEM培養(yǎng)基配制成濃度為100 μ Μ的溶液。
[0086] 2)細(xì)胞為高轉(zhuǎn)移HCC-LM3。
[0087] 3)基質(zhì)膠為 matrigel〇
[0088] 4)實驗方法
[0089] 將凍存于_20°C冰箱的基質(zhì)膠matrigel 4°C過夜，變成液態(tài)；取720 yL無血清 DMEM培養(yǎng)基，加入180 μ L Matrigel，混勾，加入至Transwell小室的聚碳酸酯膜上室， 100 μ L/個，放入37°C和5% C02培養(yǎng)箱中孵育5h。吸除小室中殘留液體，每孔加入50 μ L DMEM培養(yǎng)基，37°C和5% C02培養(yǎng)箱中孵育30min。
[0090] HCC-LM3細(xì)胞消化之后，用無血清DMEM培養(yǎng)基洗3次，計數(shù)，配成細(xì)胞懸液，密度 為2 X 105個/mL。每孔加入100 μ L細(xì)胞懸液，同時加入25 μ L化合物2a-c的溶液，使其 終濃度為20 μ M?？瞻讓φ占?5 μ L含0. 1 % DMS0的DMEM培養(yǎng)基配制的溶液。下室加入 600 μ L無血清DMEM培養(yǎng)基，在37°C和5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時。
[0091] 用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細(xì)胞之后，用4%的多聚甲醛固定細(xì)胞30min。吸除 固定液，用PBS洗3次，用0. 1 %的結(jié)晶紫染液染色30min。吸除染色液，用PBS洗3次。
[0092] 在每個小室選取9個大致相同的視野觀察，拍照，計數(shù)。實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計均采用t檢 驗和方差分析，侵襲的細(xì)胞數(shù)以均值土SD表示。
[0093] 5)結(jié)果見表4?？梢钥闯?，化合物2的濃度為20μΜ時與空白對照組相比，具有明 顯的抗HCC-LM3細(xì)胞侵襲作用。與發(fā)明人公開的Lys-Glu抑制SACC-LM細(xì)胞侵襲的有效濃 度為ImM相比，化合物2的有效濃度降低了 50倍。
[0094] 表4化合物2的體外抗腫瘤細(xì)胞侵襲活性
[0095]
[0096] η = 9 ;a)與空白對照組組比p < 0· 01.
[0097] 實驗例6化合物2抗腫瘤細(xì)胞迀移的活性
[0098] 1)化合物2用含0. 1 % DMS0的DMEM培養(yǎng)基配制成濃度為100 μ Μ的溶液。
[0099] 2)細(xì)胞為高轉(zhuǎn)移HCC-LM3。
[0100] 3)實驗方法
[0101 ] HCC-LM3細(xì)胞消化之后，用無血清DMEM培養(yǎng)基洗3次，計數(shù)，配成細(xì)胞懸液，密度為 5 X 105個/mL。每孔加入100 μ L細(xì)胞懸液，同時加入25 μ L同時加入25 μ L化合物2a-c的 溶液，使其終濃度為20 μ M?？瞻讓φ占?5 μ L含0. 1 % DMS0的DMEM培養(yǎng)基配制的溶液。 下室加入600 μ L無血清DMHM培養(yǎng)基，在37°C和5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8小時。
[0102] 用棉簽擦去上室內(nèi)的細(xì)胞之后，用4%的多聚甲醛固定細(xì)胞30min。吸除固定液， 用PBS洗3次，用0. 1 %的結(jié)晶紫染液染色30min。吸除染色液，用PBS洗3次。
[0103] 在每個小室選取9個大致相同的視野觀察，拍照，計數(shù)。實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計均采用t檢 驗和方差分析，侵襲的細(xì)胞數(shù)以均值土SD表示。
[0104] 4)結(jié)果見表5?？梢钥闯?，在20μΜ濃度下化合物2與空白對照組比，發(fā)生迀移的 細(xì)胞數(shù)均顯著減少，說明在該條件下化合物2具有明顯的抗HCC-LM3細(xì)胞迀移作用。與發(fā) 明人公開的Lys-Glu抑制HCC-LM3細(xì)胞迀移的有效濃度為ImM相比，化合物2的有效濃度 降低了 50倍。
[0105] 表5化合物2的體外抗腫瘤細(xì)胞迀移活性
[0106]
[0107] η = 9 ;a)與空白對照組組比p < 0· 01.
[0108] 實驗例7化合物2抗腫瘤轉(zhuǎn)移的活性
[0109] 受試化合物化合物2
[0110] 陽性對照藥阿霉素
[0111] 實驗動物C57BL/6小鼠，SPF級，雄性C57BL小鼠，體重18-20g，6-8周，購于北京 維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。接種C57BL/6小鼠的瘤源為Lewis小鼠肺癌細(xì)胞（LLC)， 由體外細(xì)胞培養(yǎng)，自行傳代維持。
[0112] 化合物2加入少量的吐溫80潤濕助溶，逐漸加入0. 5% CMCNa水溶液至所需要濃 度即可。
[0113] 化合物2組小鼠口服給藥。每天給藥一次，給藥劑量為0. 1 μ mol/kg，連續(xù)給藥10 天。陰性對照組小鼠口服生理鹽水。每天給藥一次，劑量為〇.2mL/只，連續(xù)給10天。陽性 對照劑量為以腹腔注射阿霉素。每天給藥一次，給藥劑量為2 μmol/kg，連續(xù)給藥10天。
[0114] 動物模型
[0115] l)Lewis小鼠肺癌細(xì)胞（LLC)，購自ATCC。選用DMEM培養(yǎng)，其中含10%經(jīng)滅活的 胎牛血清和1 X l〇5U/L青霉素和100mg/L鏈霉素培養(yǎng)LLC細(xì)胞。按照貼壁細(xì)胞培養(yǎng)方法， 每兩天傳代一次，富集細(xì)胞。
[0116] 2)待細(xì)胞生長狀態(tài)良好、處于對數(shù)生長期時，消化細(xì)胞。用生理鹽水調(diào)整細(xì)胞濃度 至lXl〇7mL，胎盤藍(lán)（Tryanblue)拒染實驗示活細(xì)胞數(shù)> 95%。取近交系C57BL/6小鼠， 雄性，左手固定小鼠，用75%乙醇消毒小鼠右前肢腋窩皮膚，右手持ImL無菌注射器于小鼠 腋部皮下注射瘤細(xì)胞懸液〇. 2mL/只（含腫瘤細(xì)胞數(shù)約為2X 106/mL)。接種后8-10天可以 生長成綠豆粒大的腫瘤，給藥備用。
[0117] 3)取接種8-10天生長良好的Lewis肺癌荷瘤小鼠，頸椎脫臼，用75%乙醇浸泡消 毒lOmin，在超凈工作臺上剝離瘤體，選擇生長良好的瘤組織，在無菌平皿中剪碎，放置于玻 璃組織勻漿器內(nèi)，按瘤塊重（g):生理鹽水體積（mL)為1 : 3的比例加入4°C預(yù)冷的生理 鹽水輕輕研磨，制成細(xì)胞懸液，過200目尼龍網(wǎng)制成單細(xì)胞懸液，用生理鹽水調(diào)整細(xì)胞濃度 至lX10 7/mL，胎盤藍(lán)（Tryanblue)拒染試驗示活細(xì)胞數(shù)> 95%。
[0118] 4)取近交系C57BL/6小鼠，雄性，左手固定小鼠，用75%乙醇消毒小鼠右前肢腋窩 皮膚，右手持lmL無菌注射器于小鼠腋部皮下注射瘤細(xì)胞懸液0. 2mL (含腫瘤細(xì)胞數(shù)約為 2X 106/mL)。接種后8-10天可以生長成綠豆粒大的腫瘤，測量腫瘤體積，按腫瘤平均體積 分組進(jìn)行給藥。
[0119] 5)每天觀察各給藥組小鼠的自主活動能力、精神狀態(tài)、毛發(fā)顏色、呼吸狀態(tài)、飲食 情況、糞便性狀。
[0120] 6)每組連續(xù)給藥10天后，于第11天稱取小鼠體重，乙醚麻醉并脫頸椎處死小鼠， 然后用鑷子固定小鼠右腋腫瘤生長部位，剪開皮膚使腫瘤完全暴露，鈍性剝離，稱重。
[0121] 7)用鑷子固定小鼠右腋部位，剪開皮膚使雙肺完全暴露，鈍性剝離雙肺，稱重，并 迅速放入生理鹽水中保存。統(tǒng)計雙肺的瘤節(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)和轉(zhuǎn)移例數(shù)。
[0122] 8)實驗結(jié)果列入表6和表7。從表7可知，在0. 1 μ mol/kg的給藥劑量下，化合物 2有效地抑制Lewis瘤生長。劑量比阿霉素低20倍時，化合物2抑制Lewis瘤生長的活性 與阿霉素沒有統(tǒng)計學(xué)差異?？梢?，化合物2抑制Lewis瘤生長的活性是阿霉素的20倍。從 表7可知，在0. 1 μ mol/kg的給藥劑量下，化合物2有效地減少瘤節(jié)轉(zhuǎn)移例數(shù)和轉(zhuǎn)移個數(shù)。
[0123] 表6化合物2抑制Lewis肺癌的活性
[0126] η = 12 ;a)與生理鹽水組比P < 0.01，與阿霉素，組比P > 0.05。
[0127] 表7化合物2在Lewis肺癌轉(zhuǎn)移模型中的轉(zhuǎn)移瘤節(jié)和轉(zhuǎn)移例數(shù)
[0128]
[0129] η = 12 ;a)與生理鹽水組比P < 0. 01。
【主權(quán)項】
1. 下面結(jié)構(gòu)的Lys-Glu修飾的1-乙?；?β -咔啉酰-色氨酸2. 權(quán)利要求1的Lys-Glu修飾的1-乙?；?β -咔啉酰-色氨酸的制備方法，該方法 由以下步驟構(gòu)成： (1) 室溫下，L-Trp-OMe與1，3-二羥基丙酮在稀鹽酸條件下反應(yīng)48h，過濾得到濾餅， 濾餅溶解于二氧六環(huán)，得到的溶液在冰鹽浴下用2N的NaOH水溶液調(diào)節(jié)pH至12,反應(yīng)10h， 得到1-乙?；?β -咔啉酰-3-羧酸； (2) 1-乙?；?β -咔啉酰-3-羧酸與L-Trp-OBzl反應(yīng)并皂化制備1-乙?；?β -咔 啉酰-3-色氨酸； (3) 將Lys (Fmoc)-Glu (OBzl)-OBzl與1-乙醜基-β -味琳醜_3_色氛酸偶聯(lián)，制備 卜乙?；?β - P專啉酰-色氨酰-Lys (Fmoc) -Glu (OBzl) -OBzl ; (4) 將1-乙?；?β -咔啉酰-色氨酰-Lys (Fmoc) -Glu (OBzl) -OBzl脫保護(hù)制備1-乙 ?；?β -味啉酰-色氨酰-Lys-Glu。3. 權(quán)利要求1的Lys-Glu修飾的1-乙?；?β -咔啉酰-色氨酸的納米結(jié)構(gòu)。4. 權(quán)利要求1的Lys-Glu修飾的1-乙?；?β -咔啉酰-色氨酸在制備抗腫瘤藥物中 的應(yīng)用。5. 權(quán)利要求1的Lys-Glu修飾的1-乙?；?β -咔啉酰-色氨酸在制備抗腫瘤細(xì)胞粘 附，迀移和侵襲藥物中的應(yīng)用。6. 權(quán)利要求1的Lys-Glu修飾的1-乙?；?β -咔啉酰-色氨酸在制備抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥 物中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61K38/07GK105884860SQ201410772091
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2014年12月16日
【發(fā)明人】彭師奇, 趙明, 王玉記, 吳建輝, 于翔
【申請人】首都醫(yī)科大學(xué)