一種小麥完整葉綠體的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及植物完整細胞器分離純化技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種簡便快捷的小麥完整葉綠體的制備方法。步驟如下：（1）制備Percoll梯度；（2）小麥樣品的預處理；（3）小麥樣品的密度梯度離心；（4）完整葉綠體的提取。本發(fā)明以Percoll為介質(zhì)進行梯度離心，不僅可以區(qū)分小麥完整及破損葉綠體，而且制備時間短，程序簡便，獲得充足的完整的葉綠體，進行定量測定后，可以精確的運用于葉綠體功能、膜蛋白、基質(zhì)蛋白及葉綠體DNA的提取及各種后續(xù)研究。
【專利說明】
一種小麥完整葉綠體的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及植物完整細胞器分離純化技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種簡便快捷的小麥完整葉綠體的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]葉綠體是植物細胞最重要的細胞器，是植物進行光合作用和氮素同化的場所，是大自然一切有機物的最初來源，與植物生長發(fā)育及作物產(chǎn)量密切相關(guān)，獲得完整的葉綠體對于研究葉綠體功能、葉綠體可溶蛋白及膜蛋白、葉綠體基因等的必備條件。傳統(tǒng)分離純化葉綠體常采用蔗糖密度梯度離心及差速離心，不僅耗時長，僅密度梯度離心就需要5個小時以上，而且這種方法無法區(qū)分完整及破損葉綠體(圖1B)，無法獲得充足的基質(zhì)蛋白，可能導致葉綠體DNA流失，嚴重影響后續(xù)研究。本技術(shù)以Percoll為介質(zhì)進行梯度離心，不僅可以區(qū)分小麥完整及破損葉綠體，而且制備時間短，密度梯度離心僅10分鐘;程序簡便，獲得充足的完整葉綠體，進行定量測定后，可以精確的運用于各種后續(xù)研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明介紹了一種從小麥葉片分離純化完整葉綠體的方法，該方法簡便、快捷、效果好，完整葉綠體得率高。
[0004]為實現(xiàn)上述目的本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
一種小麥完整葉綠體的制備方法，步驟如下:
(1)制備Percoll梯度；
(2)小麥樣品的預處理；
(3 )小麥樣品的密度梯度離心；
(4)完整葉綠體的提取。
[0005]所述步驟(I)中Percoll梯度的制備方法為:稱取異抗壞血酸和谷胱甘肽各稱10mg，置于離心管中，加入15mL 2XGB緩沖液，加入15 mL Percoll混勻；于4°C、37，000g離心30min(注意:brake on)，離心完成后，小心取出離心管，置于冰上備用。
[0006]所述步驟(2)的操作為:取小麥新鮮葉片20-30克，剪碎后，于4°C條件下粉碎，加入150-180mL的I X GB緩沖液浸沒小麥組織，以1，000-12，OOOrpm的速度粉碎I秒，接著間隔I秒的模式處理樣品，重復該模式6-7次，粉碎樣品;然后以4，000-6，OOOrpm的速度，連續(xù)粉碎4-6秒，制得組織勻漿;大田生長的小麥樣品以I秒高速+1秒間隔模式重復7次粉碎樣品，然后低速連續(xù)勻漿6秒，制得組織勻漿;將上述組織勻漿倒入醫(yī)用紗布中，擠壓過濾，濾液擠入預冷的50mL離心管中，于4°C、3000g條件下，離心5min;棄上清，向沉淀中加入700yL的I XGB緩沖液，用軟毛筆將沉淀懸浮，合并到I個離心管中，制得葉綠體溶液。
[0007]所述步驟(3)的操作為:用膠頭滴管將步驟(2)中的葉綠體溶液沿管壁緩慢加到步驟(I)制備的Perco 11梯度上面;于4 °C、8000g條件下，離心1min，小心取出離心管，得到兩個綠色條帶，下面的是完整的葉綠體。
[0008]所述步驟(4)的操作為:吸取步驟(3)得到的完整葉綠體條帶，放入50mL離心管中，加滿I X IB提取緩沖液，4°C、1500g條件下，離心5min;棄上清，用I X IB提取緩沖液懸浮沉淀，重復洗一次葉綠體，用400 yL的I X IB提取緩沖液懸浮沉淀，轉(zhuǎn)移到1.5mL的EP管中，置于冰上，于黑暗中保存。
[0009]所述IXGB緩沖液的配方為:0.1M Κ-Hepes、0.66M山梨醇、2mM MgCl2、2mM MnCl2、4mM Na2EDTA和0.2% BSA，pH調(diào)至7.3，制得2 X GB緩沖液的貯液，于4°C保存，稀釋一倍即得IX GB緩沖液。
[0010]所述IXIB提取緩沖液的配方為:0.1Μ K-tricine和0.66M山梨醇，pH調(diào)至8.0，制得2 X IB提取緩沖液的貯液，稀釋一倍即得I X IB提取緩沖液。
[0011]所述藥品和溶液均于4°C下保存。
[0012]本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明以Percoll為介質(zhì)進行梯度離心，不僅可以區(qū)分小麥完整及破損葉綠體，而且制備時間短，程序簡便，獲得充足葉綠體，進行定量測定后，可以精確的運用于各種后續(xù)研究。
【附圖說明】
[0013]圖1為利用不同密度梯度技術(shù)分離純化的小麥葉綠體條帶示意圖；其中A為利用Percoll梯度制備顯示完整與破損葉綠體所處的位置;B為常規(guī)的蔗糖密度梯度顯示的葉綠體條帶位置。
【具體實施方式】
[0014]實施例1
1.制備Per CO 11梯度:
(1)異抗壞血酸和谷胱甘肽(4°C保存)各稱10mg放入50mL圓底半透明聚乙烯離心管；
(2)加入15mL 2\68(研磨緩沖液卩!17.3，含0.1]\1 K_Hepes、0.66Μ 山梨醇、2mM MgCl2'2mM MnCl2、4mM Na2EDTA 和0.2% BSA，4°C保存)進行溶解；
(3)加入15 mL Percoll(4°C保存)混勻；
(4)于4°0、37,OOOg離心30min(注意:brake on)，離心完成后，小心取出離心管，置于冰上備用。
[0015]2.葉綠體制備(可以在步驟I離心時同步進行，所有操作低溫進行):
(I)器皿準備:取2個250mL的三角瓶分別標注GB和IB、4個50mL圓底離心管、一個燒杯和I個塑料漏斗、I把剪刀置于冰上。將4層紗布用滅菌蒸餾水浸濕，置于漏斗上。
[0016](2)試劑準備:利用4°C dd H20，由2XGB貯液制備200 mL的I XGB緩沖液，由2X IB貯液(提取緩沖液PH8.0，含0.1M K-tricine和0.661山梨醇)制備100 mL的I X IB緩沖液。分別放入冰上相應的三角瓶中。
[0017](3)取培養(yǎng)箱中生長的小麥新鮮葉片約30g，剪碎放入40C保存的粉碎機中，加入約180mL的I XGB緩沖液浸沒小麥組織，6x( I秒高速+1秒間隔)，然后低速連續(xù)勻漿4秒。
[0018](4)將上述組織勻漿倒入醫(yī)用紗布中，輕輕將溶液擠進4個預冷的50mL離心管中，于4°C、3000g下，離心5min。
[0019](5)棄上清，在沉淀中加入700yL的I XGB，用小的軟毛筆將沉淀輕輕懸浮，合并到I個離心管，大約2-4mL。
[0020](6)密度梯度離心:用膠頭滴管小心的將上述葉綠體溶液沿管壁緩慢加到PercolI梯度的上面，于4°C、8000g離心lOmin。小心取出離心管，如圖1所示可以看到兩個綠色條帶，下面的是完整的葉綠體。
[0021](7)小心吸取下面的綠色條帶，放入干凈的50mL離心管中，加滿I X IB提取緩沖液，4°C、1500g下，離心5min ；棄上清，輕輕懸浮沉淀，重復洗一次葉綠體。用400 yL的I X IB懸浮沉淀，轉(zhuǎn)移到1.5mL的EP管中，置于冰上，于黑暗中保存。
[0022]3.葉綠體定量測定
(I)取上述溶液2 yL加入ImL 80%的丙酮，搖勻后，于13，000g離心5min。
[0023](2)以80%的丙酮溶液調(diào)零，用微量比色杯(10yL)分別測定波長720、663及645nm的光密度分別為0.01、0.24和0.09。
[0024](3)葉綠體的濃度(mg/mL)=0.1 X {「40.2 X (A663-A720)」+「101.4Χ (Α645-Α720)」}=1.86 mg/mLo
[0025]4.葉綠體可溶蛋白及膜蛋白制備:將上述葉綠體溶液于500g下離心5min;沉淀用400yL可溶蛋白提取緩沖液(pH 7.6，10mM Tris-HCUlmM EDTA、lmM MgC12 和 10 mM β巰基乙醇)懸浮，冰浴1min，裂解葉綠體。于12，000 g離心1min，上清為葉綠體基質(zhì)可溶蛋白，可直接用于各種蛋白質(zhì)分析；沉淀為葉綠體膜蛋白，用10yL膜蛋白溶解緩沖液(pH7.0，50mM NaCl、50mM 咪唑，2mM 6-氨基己酸和ImM EDTA)懸浮沉淀，加入5 yL 20% TritonX-100或10 yL 20%毛地黃皂苷混勻后，水化1min;加入1yL 50%的甘油，可用于BNE或CNE進行膜蛋白分離等相關(guān)研究。
[0026]實施例2
1.制備Per Co 11梯度:
(1)異抗壞血酸和谷胱甘肽(4°C保存)各稱10mg放入50mL圓底半透明聚乙烯離心管；
(2)加入15mL 2XGB(研磨緩沖液 pH7.3，含 0.1M K_Hepes、0.66Μ 山梨醇、2mM MgCl2'2mM MnCl2、4mM Na2EDTA 和0.2% BSA，4°C保存)進行溶解；
(3)加入15 mL Percoll(4°C保存)混勻；
(4)于4°0、37，000g離心30min(注意:brakeon)，離心完成后，小心取出離心管，置于冰上備用。
[0027]2.葉綠體制備(可以在步驟I離心時同步進行，所有操作低溫進行):
(I)器皿準備:取2個250mL的三角瓶分別標注GB和IB、4個50mL圓底離心管、一個燒杯和I個塑料漏斗、I把剪刀置于冰上。將4層紗布用滅菌蒸餾水浸濕，置于漏斗上。
[0028](2)試劑準備:利用4°C dd H20，由2XGB貯液制備200 mL的I XGB緩沖液，由2X IB貯液(提取緩沖液PH8.0，含0.1M K-tricine和0.661山梨醇)制備100 mL的I X IB緩沖液。分別放入冰上相應的三角瓶中。
[0029](3)取大田小麥新鮮葉片20g，剪碎放入4°C保存的粉碎機中，加入約180mL的I XGB緩沖液浸沒小麥組織，培養(yǎng)箱樣品7x(l秒高速+1秒間隔)，然后低速連續(xù)勻漿6秒。
[0030](4)將上述組織勻漿倒入醫(yī)用紗布中，輕輕將溶液擠進4個預冷的50mL離心管中，于4°C、3000g下，離心5min。
[0031 ] (5)棄上清，在沉淀中加入700yL的I XGB，用小的軟毛筆將沉淀輕輕懸浮，合并到I個離心管，大約2-4mL。
[0032](6)密度梯度離心:用膠頭滴管小心的將上述葉綠體溶液沿管壁緩慢加到PercolI梯度的上面，于4°C、8000g離心lOmin。小心取出離心管，如圖1所示可以看到兩個綠色條帶，經(jīng)顯微觀察得，下面的是完整的葉綠體。
[0033](7)小心吸取下面的綠色條帶，放入空的離心管中，加滿I X IB提取緩沖液，4°C、1500g下，離心5min;棄上清，輕輕懸浮沉淀，重復洗一次葉綠體。用400 yL的I X IB懸浮沉淀，置于冰上，于黑暗中保存。
[0034]3.葉綠體定量測定
(I)取上述溶液2 yL加入ImL 80%的丙酮，搖勻后，于13，000g離心5min。
[0035](2)以80%的丙酮溶液調(diào)零，用微量比色杯(10yL)分別測定波長720、663及645nm的光密度為-0.001、0.281和0.101。
[0036](3)葉綠體的濃度(mg/mL)=0.1 X {「40.2 X (A663-A720)」+「101.4Χ (Α645-Α720)」}=2.17 mg/mLo
[0037]4.葉綠體可溶蛋白及膜蛋白制備:將上述葉綠體溶液于500g下離心5min;沉淀用400yL可溶蛋白提取緩沖液(pH 7.6，10mM Tris-HCUlmM EDTA、ImM MgCl2 和 10 mM β巰基乙醇)懸浮，冰浴1min，裂解葉綠體。于12，000 g離心1min，上清為葉綠體基質(zhì)可溶蛋白，可直接用于各種蛋白質(zhì)分析；沉淀為葉綠體膜蛋白，用10yL膜蛋白溶解緩沖液(pH7.0，50mM NaCl、50mM 咪唑，2mM 6-氨基己酸和ImM EDTA)懸浮沉淀，加入5 yL 20% TritonX-100或10 yL 20%毛地黃皂苷混勻后，水化1min;加入1yL 50%的甘油，可用于BNE或CNE進行膜蛋白分離等相關(guān)研究。
【主權(quán)項】
1.一種小麥完整葉綠體的制備方法，其特征在于:步驟如下: (1)制備PercolI梯度； (2)小麥樣品的預處理； (3 )小麥樣品的密度梯度離心； (4)完整葉綠體的提取。2.如權(quán)利要求1所述的小麥完整葉綠體的制備方法，其特征在于:所述步驟(I)中Percoll梯度的制備方法為:稱取異抗壞血酸和谷胱甘肽各10 mg，置于離心管中，加入15mL2XGB緩沖液，加入15 mL Percoll混勾；于4°C、37,OOOg離心30min，離心完成后，小心取出離心管，置于冰上備用。3.如權(quán)利要求1所述的小麥完整葉綠體的制備方法，其特征在于:所述步驟(2)的操作為:取小麥新鮮葉片20-30克，剪碎后，于4°C條件下粉碎，加入150-180mL的I X GB緩沖液浸沒小麥組織，以10，000-12,OOOrpm的速度粉碎I秒，接著間隔I秒的模式處理樣品，重復該模式6-7次，粉碎樣品；然后以4，000-6，OOOrpm的速度，連續(xù)粉碎4_6秒，制得組織勻漿;將上述組織勻漿倒入醫(yī)用紗布中，擠壓過濾，濾液擠入預冷的50mL離心管中，于4°C、3000g條件下，離心5min;棄上清，向沉淀中加入700yL的I X GB緩沖液，用軟毛筆將沉淀懸浮，合并到I個離心管中，制得葉綠體溶液。4.如權(quán)利要求1所述的小麥完整葉綠體的制備方法，其特征在于:所述步驟(3)的操作為:用膠頭滴管將步驟(2)中的葉綠體溶液沿管壁緩慢加到步驟(I)制備的Percoll梯度上面;于4°C、8000g條件下，離心lOmin，小心取出離心管，得到兩個綠色條帶，下面的是完整的葉綠體。5.如權(quán)利要求1所述的小麥完整葉綠體的制備方法，其特征在于:所述步驟(4)的操作為:吸取步驟(3)得到的完整葉綠體條帶，放入50mL離心管中，加滿I X IB提取緩沖液，4°C、1500g條件下，離心5min;棄上清，用I X IB提取緩沖液懸浮沉淀，重復洗一次葉綠體，用400yL的I X IB提取緩沖液懸浮沉淀，轉(zhuǎn)移到1.5mL的EP管中，置于冰上，于黑暗中保存。6.如權(quán)利要求2或3所述的小麥完整葉綠體的制備方法，其特征在于:所述IXGB緩沖液的配方為:0.1M K-Hepes、0.66M山梨醇、2mM MgCl2、2mM MnCl2、4mM Na2EDTA和0.2% BSA，pH調(diào)至7.3，制得2XGB緩沖液的貯液，于4°C保存，稀釋一倍即得I XGB緩沖液。7.如權(quán)利要求5所述的小麥完整葉綠體的制備方法，其特征在于:所述IX IB提取緩沖液的配方為:0.1M K-tricine和0.66M山梨醇，pH調(diào)至8.0，制得2 X IB提取緩沖液的貯液，稀釋一倍即得I X IB提取緩沖液。8.如權(quán)利要求2至7所述的小麥完整葉綠體的制備方法，其特征在于:所述藥品和溶液均于4°C下保存。
【文檔編號】C12N5/04GK105907697SQ201610414277
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年6月15日
【發(fā)明人】王小純, 張浩然, 韋昊, 韋一昊, 熊淑萍, 馬新明
【申請人】河南農(nóng)業(yè)大學