細(xì)胞篩選芯片及微流控聯(lián)合芯片的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種細(xì)胞篩選芯片及微流控聯(lián)合芯片，所述細(xì)胞篩選芯片包括物理篩選單元及親和性篩選單元，所述物理篩選單元包括n個(gè)并聯(lián)的第一篩選腔室，n≥1，所述篩選管道內(nèi)部設(shè)有多排立柱，相鄰兩個(gè)立柱間錯(cuò)開(kāi)的距離d=1/3λ，同一排每相鄰兩個(gè)立柱間的間隙寬度G=λ?2R，上一排立柱與下一排立柱夾角α=arctan1/3，其中λ指相鄰兩個(gè)立柱的中心距離，R指立柱的直徑；所述親和性篩選單元包括第二篩選腔室，所述第一排出通道的入口連接物理篩選單元，出口連接親和性篩選單元。所述微流控聯(lián)合芯片，包括物理篩選單元及親和性篩選單元、細(xì)胞培養(yǎng)單元、閥門；可以對(duì)各種細(xì)胞的表型進(jìn)行實(shí)時(shí)觀測(cè)，免去了應(yīng)用大型設(shè)備進(jìn)行異種細(xì)胞分離，節(jié)省人力物力。
【專利說(shuō)明】
細(xì)胞篩選芯片及微流控聯(lián)合芯片
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于細(xì)胞篩選及細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于細(xì)胞篩選的微流控芯片，以及能夠同時(shí)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞篩選及細(xì)胞培養(yǎng)的微流控聯(lián)合芯片。【背景技術(shù)】
[0002]當(dāng)前微流控芯片借助其成本低、設(shè)備小等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用到醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。特別是微流控技術(shù)還具有消耗樣品量少、有較高的分辨精度及靈敏度、易于集成及微型化等優(yōu)點(diǎn)被廣泛地應(yīng)用于循環(huán)腫瘤細(xì)胞分選研究中，并表現(xiàn)出良好的發(fā)展前景。
[0003]目前的腫瘤細(xì)胞篩選方法為被動(dòng)分選方法、主動(dòng)分選方法以及多種分選方法。被動(dòng)分選方法是依據(jù)不同種類的細(xì)胞在尺寸、密度、形狀、可變形性及親和性等物理、生物特性上各不相同進(jìn)行分選，如微結(jié)構(gòu)過(guò)濾、場(chǎng)流及水力分選、確定性側(cè)向偏移、慣性分選、仿生分選及親和性分選。主動(dòng)分選方法是通過(guò)外力場(chǎng)對(duì)樣品流中的細(xì)胞施加作用力，從而致使其分離，其分選精度往往高于被動(dòng)分選技術(shù)，如介電泳分選、磁分選等。多級(jí)分選方法是將上述方法集中到一起將細(xì)胞進(jìn)行分離。
[0004]目前的微流控篩選平臺(tái)主要是采用被動(dòng)分離的方式，通常存在以下幾個(gè)問(wèn)題:(1) 篩選通道易阻塞，導(dǎo)致篩選通量低，捕獲率低，篩選特性不高；(2)被捕獲的細(xì)胞難以被釋放，即使釋放的細(xì)胞無(wú)法保證細(xì)胞活性，影響細(xì)胞活性的表達(dá)；(3)篩選平臺(tái)與共培養(yǎng)平臺(tái)分離，導(dǎo)致操作過(guò)程繁瑣復(fù)雜。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供了一種集合了物理篩選與抗體親和性篩選為一體的細(xì)胞篩選芯片，克服了篩選通量低，捕獲率低，篩選特性不高的技術(shù)缺陷;還提供了一種集合了細(xì)胞篩選及細(xì)胞培養(yǎng)的微流控芯片，克服了篩選平臺(tái)與共培養(yǎng)平臺(tái)分離，操作過(guò)程繁瑣復(fù)雜的技術(shù)缺陷。
[0006]本發(fā)明的一種用于細(xì)胞篩選的微流控芯片，包括物理篩選單元及親和性篩選單元，所述物理篩選單元包括n個(gè)并聯(lián)的第一篩選腔室，n多1，所述第一篩選腔室的入口連接第一灌入口，所述第一篩選腔室的出口同時(shí)連接第一廢液收集通道和第一排出通道;所述篩選管道內(nèi)部設(shè)有多排立柱，相鄰兩個(gè)立柱間錯(cuò)開(kāi)的距離d=l/3A，同一排每相鄰兩個(gè)立柱間的間隙寬度G=A-2R，上一排立柱與下一排立柱夾角a=arCtanl/3，其中A指相鄰兩個(gè)立柱的中心距離，R指立柱的直徑;所述親和性篩選單元包括第二篩選腔室，所述第二篩選腔室的上游設(shè)有抗體灌入口、第二灌入口，下游設(shè)有第二廢液收集通道、第二排出通道;所述第一排出通道的入口連接物理篩選單元，出口連接親和性篩選單元。
[0007]優(yōu)選的相鄰兩個(gè)立柱的中心距離人=0.057-0.075mm。
[0008]為了改變第二篩選腔室內(nèi)部的流體方式，使流體由層流變?yōu)橥牧骰蛘邷u流，所述第二篩選腔室的頂部設(shè)有擾流層，所述擾流層由多個(gè)平行排列的擾流棒組成，相鄰兩個(gè)擾流棒之間的間距為100-300M1;所述擾流棒為直線結(jié)構(gòu)或曲線結(jié)構(gòu)。
[0009]為了進(jìn)一步增加第二篩選腔室內(nèi)樣本與抗體的接觸率，提高特異性捕獲率，所述擾流層呈魚骨結(jié)構(gòu)，每一個(gè)擾流棒包括依次連接的長(zhǎng)波和短波，所述長(zhǎng)波的垂直高度a等于兩個(gè)擾流棒之間的距離b，所述短波的垂直高度c等于長(zhǎng)波垂直高度a的一半。
[0010]為了支撐整個(gè)腔室，防止其塌陷，所述第二篩選腔室的內(nèi)部設(shè)有多個(gè)支撐柱。
[0011]優(yōu)選的第一廢液收集通道或第二廢液收集通道的形狀為倒L形收集通道、箭頭形收集通道或鏡像倒L形收集通道;所述倒L形收集通道或箭頭形收集通道與廢液收集口連接處為漏斗型結(jié)構(gòu);所述鏡像倒L形收集通道與廢液收集口連接處為弧形結(jié)構(gòu)。
[0012]為了實(shí)現(xiàn)對(duì)樣本細(xì)胞的特異性篩選，增加篩選的純度，所述第二篩選腔室內(nèi)部鑲嵌有抗體;首先，將鏈霉親和素包被到第二篩選腔室內(nèi)，再將生物素化抗體灌入到第二篩選腔室內(nèi)，孵化10-20min，使生物素化抗體與鏈霉親和素結(jié)合，最后封閉通道。
[0013]本發(fā)明的一種微流控聯(lián)合芯片，包括所述的物理篩選單元、親和性篩選單元，還包括細(xì)胞培養(yǎng)單元，以及控制親和性篩選單元、細(xì)胞培養(yǎng)單元之間聯(lián)通或阻斷的閥門；所述親和性篩選單元通過(guò)第二排出通道與細(xì)胞培養(yǎng)單元連接，所述閥門位于第二排出通道上。
[0014]優(yōu)選的閥門的結(jié)構(gòu)為圓柱形小口，內(nèi)部有可上下移動(dòng)的橡膠管，上移橡膠管則閥門打開(kāi)，細(xì)胞培養(yǎng)單元與親和性篩選單元連通;下移橡膠管則閥門關(guān)閉，細(xì)胞培養(yǎng)單元與親和性篩選單元斷開(kāi)。
[0015]為了模擬實(shí)體狀態(tài)下的細(xì)胞微環(huán)境，所述細(xì)胞培養(yǎng)單元包括營(yíng)養(yǎng)液灌注單元、生物膠灌注單元及細(xì)胞培養(yǎng)室;為了保證營(yíng)養(yǎng)液灌流通道中的小分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及化療藥物，以及各個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)室中的細(xì)胞因子相互影響，三者之間通過(guò)微橋連通，所述生物膠灌注單元及微橋內(nèi)灌注基質(zhì)膠。
[0016]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是:本發(fā)明的一種細(xì)胞篩選芯片，具有多個(gè)并聯(lián)的第一篩選腔室同時(shí)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行篩選，實(shí)現(xiàn)高通量篩選，并可以根據(jù)所需通量調(diào)整第一篩選腔室的數(shù)量。在第一篩選腔室中借助于物理方法對(duì)樣本進(jìn)行初篩，初篩完的樣本灌注到親和性篩選單元，利用抗體對(duì)樣本進(jìn)行特異性篩選，實(shí)現(xiàn)二次篩選，增加了篩選的純度，捕獲的細(xì)胞留在抗體篩選的表面，廢液經(jīng)廢液收集口收集。再將略高濃度的抗體灌注到第二篩選腔室中，與已有的抗體競(jìng)爭(zhēng)抗原表位，使細(xì)胞能夠從包被到芯片上的抗體中釋放出來(lái)，并且對(duì)細(xì)胞無(wú)任何損傷。
[0017]本發(fā)明的一種微流控聯(lián)合芯片，包括篩選單元和多個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)單元，通過(guò)閥門控制兩個(gè)單元的連通和斷開(kāi)，經(jīng)篩選后的目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)入到細(xì)胞培養(yǎng)單元，并且和多種細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)，多種細(xì)胞產(chǎn)生的生物因子可彌散至整個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)平臺(tái)，最大限度的模擬立體細(xì)胞在體內(nèi)生長(zhǎng)的微環(huán)境;應(yīng)用此芯片可以對(duì)各種細(xì)胞的表型進(jìn)行實(shí)時(shí)觀測(cè)，免去了應(yīng)用大型設(shè)備進(jìn)行異種細(xì)胞分離，節(jié)省人力物力。
[0018]
【附圖說(shuō)明】
[0019]圖1.本實(shí)施例的用于細(xì)胞篩選的微流控芯片的結(jié)構(gòu)示意圖；
圖2.如圖1中物理篩選單元的結(jié)構(gòu)示意圖；
圖3.如圖2中第一篩選腔室內(nèi)部立柱的結(jié)構(gòu)示意圖；
圖4.如圖3中第一篩選腔室內(nèi)部立柱的放大示意圖；
圖5.如圖1中親和性篩選單元的結(jié)構(gòu)示意圖； 圖6.如圖5中親和性篩選單元頂部擾流層的一種結(jié)構(gòu)示意圖；
圖7.如圖6中親和性篩選單元頂部擾流層的放大示意圖；
圖8.如圖1中三種形狀的第一及第二廢液收集通道、第一及第二廢液收集口的結(jié)構(gòu)示意圖；其中I為L(zhǎng)型收集通道及收集口，11為箭頭型收集通道及收集口，ΙΠ為鏡像倒L型收集通道及收集口；
圖9.本實(shí)施例的微流控聯(lián)合芯片的三維示意圖；
圖10.本實(shí)施例的微流控聯(lián)合芯片的結(jié)構(gòu)示意圖；
圖11.如圖10中細(xì)胞培養(yǎng)單元的結(jié)構(gòu)示意圖；
圖12.如圖11中營(yíng)養(yǎng)液灌注單元的結(jié)構(gòu)示意圖；
圖13.如圖11中生物膠灌注單元的結(jié)構(gòu)示意圖；
圖14.如圖11中細(xì)胞培養(yǎng)室的結(jié)構(gòu)示意圖；
圖15.實(shí)施例2的實(shí)驗(yàn)流程圖；
圖中標(biāo)注:物理篩選單元A，第一灌入口 Al，第一灌入通道A2，第一篩選腔室A3，第一廢液收集口 A4，第一廢液收集通道A5，第一排出通道A6;親和性篩選單元B，抗體灌入口 BI，第二灌入口 B2，第二篩選腔室B3，第二廢液收集口 B4，第二排出通道B5，抗體灌入通道B6，第二廢液收集通道B7，支撐柱B8 ;閥門C;細(xì)胞培養(yǎng)單元D，營(yíng)養(yǎng)液灌注單元D100，營(yíng)養(yǎng)液灌入口DlOI，營(yíng)養(yǎng)液出口D102，生物膠灌注單元D200，生物膠灌入口 D201，生物膠出口D202，第一細(xì)胞培養(yǎng)室D310，第二細(xì)胞培養(yǎng)室D320，第三細(xì)胞培養(yǎng)室D330，第一細(xì)胞及第三細(xì)胞入口D301，細(xì)胞通道D302，細(xì)胞培養(yǎng)小室D303，第一及第三細(xì)胞出口 D304，第二細(xì)胞出口 D305，微橋D6;進(jìn)液柱G，負(fù)壓吸引裝置H。
[0020]
【具體實(shí)施方式】
[0021]下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】，以膀胱癌細(xì)胞為例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。
[0022]—種用于細(xì)胞篩選的微流控芯片，整體結(jié)構(gòu)包括殼體、載體、微結(jié)構(gòu)和灌流系統(tǒng)。所述殼體與載體封接而成，材料均為聚二甲基硅氧烷(PDMS)，該材料具有可塑性好、理化性質(zhì)穩(wěn)定、無(wú)毒無(wú)味、透明、通氣性良好的優(yōu)良性能。所述殼體的厚度為3-5_。
[0023]所述微結(jié)構(gòu)是在殼體與載體之間的腔道，所述腔道的高度為50-100μ m，是完成細(xì)胞篩選的主體結(jié)構(gòu)，包括物理篩選單元A、親和性篩選單元B，如圖1所示。
[0024]樣本細(xì)胞通過(guò)灌流系統(tǒng)，由第一灌入口Al灌入到物理篩選單元A中，如圖2所示，通過(guò)第一灌入通道A2進(jìn)入第一篩選腔室A3，樣本細(xì)胞經(jīng)初步的物理篩選后，由第一排出通道A6排出，進(jìn)入親和性篩選單元B，并由第一廢液收集通道A5和第一廢液收集口 A4排出廢液。
[0025]所述灌流系統(tǒng)可以是注射式進(jìn)液柱。所述進(jìn)液柱為上寬下窄的瓶體，容量200-300ul，所述瓶體的下口直徑為0.8-lmm，上口直徑為4_6mm，瓶體高度為40_45mm，灌流時(shí)進(jìn)液柱的液面高度為25-35mm。
[0026]整個(gè)物理篩選單元A包括η個(gè)并聯(lián)的第一篩選腔室A3，n多I。優(yōu)選的η為2的整數(shù)倍，兩個(gè)第一篩選腔室為一組，共用一個(gè)灌入通道、一個(gè)廢液收集通道、一個(gè)排出通道;可以節(jié)約空間利用率，如圖1和圖2所示為8個(gè)第一篩選腔室A3并聯(lián)，可以實(shí)現(xiàn)高通量篩選。[0027 ]所述第一篩選腔室A3內(nèi)部根據(jù)確定性橫向迀移原理(DLD )設(shè)計(jì)，確定性橫向迀移(DLD)是一種利用微米尺寸障礙物陣列對(duì)含有顆?；蚍肿踊旌衔锏囊毫髟跈M跨流體方向上進(jìn)行連續(xù)分離的技術(shù)。所述第一篩選腔室A3內(nèi)部設(shè)有一排排立柱組成，每排立柱較上一排偏離三分之一相鄰立柱中心距的距離，由此三排形成一個(gè)周期。如圖3所示，流經(jīng)相鄰立柱間的流體在下一排處遇上阻礙，并沿立柱分岔繞行，據(jù)此可將相鄰立柱間的流體分成三條流線。當(dāng)小粒子中心處于流線I中時(shí)，其將沿著同一條流線前行，運(yùn)動(dòng)軌跡為1-3-2-1，即主流動(dòng)方向；而對(duì)于半徑大于柱間流線I寬度的大粒子，其每經(jīng)過(guò)下一排陣列時(shí)都會(huì)從流線I橫向迀移至流線2中，運(yùn)動(dòng)軌跡為2-2-2-2，即沿著與主流動(dòng)呈一定角度的方向移動(dòng)。進(jìn)一步的，所述物理篩選單元的每個(gè)第一篩選腔室A3為30mmX4mmX0.1mm的長(zhǎng)方體結(jié)構(gòu)。
[0028]如圖4所示，內(nèi)部立柱半徑為R=0.025mm，高度與第一篩選腔室A3的高度相同，兩相鄰立柱中心距離λ=0.057-0.075mm。相鄰兩柱間錯(cuò)開(kāi)的距離d=I/3λ，即在本實(shí)施例中d=
0.019-0.025mm，同一排每相鄰兩個(gè)立柱間的間隙寬度G=X-2R，即在本實(shí)施例中G= 0.007-
0.025mm ；優(yōu)選的λ=0.075mm，d=0.025mm，G=0.025mm。上一排立柱與下一排立柱夾角α =arctan[(l/3A)/A] =ar c tan I /3=18.44°。所述間隙寬度G的大小決定了細(xì)胞的臨界尺寸，計(jì)算公式為:臨界尺寸=2X20%XG，小于臨界尺寸的粒子穿越柱間間隙繼續(xù)沿主流動(dòng)方向運(yùn)動(dòng)，而大于臨界尺寸的粒子在每一排處都會(huì)橫向迀移至相鄰的流線中，從而能沿著與主流動(dòng)方向成一定角度的軌跡運(yùn)動(dòng)，實(shí)現(xiàn)兩者的連續(xù)分離。因此相對(duì)于傳統(tǒng)微尺寸過(guò)濾中的柱狀陣列只允許小粒子通過(guò)而阻止大粒子的技術(shù)缺陷，本實(shí)施例的立柱排布方式，能夠?qū)崿F(xiàn)大分子和小分子的連續(xù)分離。
[0029]經(jīng)初步篩選后的樣本細(xì)胞，由第一排出通道A6排出，如圖5所示，由第二灌入口B2進(jìn)入親和性篩選單元B的第二篩選腔室B3;即所述第一排出通道A6的入口連接物理篩選單元A，出口連接親和性篩選單元B?？贵w由抗體灌入口BI經(jīng)抗體灌入通道B6進(jìn)入第二篩選腔室B3。初步篩選后的樣本細(xì)胞再進(jìn)行抗體篩選后，由第二排出通道B5排出該芯片，并由第二廢液收集通道B7和第二廢液收集口 B4排出廢液。
[0030]所述第二篩選腔室B3的內(nèi)部設(shè)有多個(gè)支撐柱B8，用于支撐整個(gè)腔室，防止其塌陷。所述第二篩選腔室的頂面設(shè)有擾流層，作用是改變流體方式，使流體由層流變?yōu)橥牧骰蛘邷u流，增加樣本與抗體的接觸率，提高特異性捕獲率;所述擾流層是由多個(gè)平行排列的擾流棒組成的，相鄰兩個(gè)擾流棒之間的間距b為100-300μπι;所述擾流棒為直線結(jié)構(gòu)或曲線結(jié)構(gòu)。優(yōu)選的一種擾流層如圖6和圖7所示，類似為魚骨結(jié)構(gòu)，每一個(gè)擾流棒包括依次連接的長(zhǎng)波和短波，所述長(zhǎng)波的垂直高度a等于兩個(gè)擾流棒之間的距離b，所述短波的垂直高度c等于長(zhǎng)波垂直高度a的一半。
[0031]所述第二篩選腔室B3內(nèi)部鑲嵌有相應(yīng)抗體。首先，將鏈霉親和素包被到第二篩選腔室內(nèi)，再將生物素化抗體灌入到第二篩選腔室內(nèi)，孵化10-20min，使生物素化抗體與鏈霉親和素結(jié)合，最后用含牛血清蛋白和吐溫20的磷酸緩沖鹽溶液封閉親和性篩選單元B，使未與抗體結(jié)合的部分不再非特異性吸附其他物質(zhì)。
[0032]所述第一及第二廢液收集通道及廢液收集口即為將經(jīng)物理篩選及親和性篩選處理后無(wú)用的血液收集口，同時(shí)在抗體篩選單元內(nèi)也是抗體的出口。如圖8所示，第一或第二廢液收集通道(A5、B7)包括三種形式:倒L形收集通道、箭頭形收集通道、鏡像倒L形收集通道。其中倒L形收集通道用于物理篩選單元A中左右兩側(cè)第一篩選腔室A3中廢液的收集，箭頭形收集通道用于物理篩選單元A中左右中間部分的第一篩選腔室A3中廢液的收集，鏡像倒L形收集通道用于親和性篩選單元B中。其中倒L形收集通道和箭頭形收集通道與廢液收集口的連接處為漏斗樣結(jié)構(gòu)，優(yōu)選的漏斗結(jié)構(gòu)的尺寸為長(zhǎng)4mm，兩側(cè)寬0.3_，中間寬0.2_;鏡像倒L形收集通道與廢液收集口連接處為弧形結(jié)構(gòu)。第一及第二廢液收集口(A4、B4)可以是長(zhǎng)方體收集口，A4處長(zhǎng)方體收集口的尺寸可以是0.6mmX0.6mmX0.lmm,B4處長(zhǎng)方體收集口的尺寸可以是Imm X 1.5mm X 0.1mm0
[0033]所述用于細(xì)胞篩選的微流控芯片借助確定性偏移原理，通過(guò)一排排交錯(cuò)排列的微柱陣列，依據(jù)粒子或細(xì)胞尺寸的不同，實(shí)現(xiàn)連續(xù)的物理分離;在經(jīng)過(guò)親和性篩選，通過(guò)固定在微流控裝置內(nèi)的特定分子，與樣品流中的目標(biāo)細(xì)胞相黏合，從而將其捕捉、富集，實(shí)現(xiàn)與其他細(xì)胞的分離，篩選的通量高、捕獲率高，篩選特異性強(qiáng);釋放的細(xì)胞能夠正常表達(dá)細(xì)胞活性。
[0034]
本實(shí)施例還提供了一種微流控聯(lián)合芯片，如圖9所示，整體結(jié)構(gòu)包括殼體、載體、微結(jié)構(gòu)和灌流系統(tǒng)。所述殼體與載體封接而成，材料均為聚二甲基硅氧烷(PDMS)。
[0035]如圖10所示，所述微結(jié)構(gòu)是在殼體與載體之間的腔道，是完成細(xì)胞篩選和細(xì)胞培養(yǎng)的主體結(jié)構(gòu)，包括依次連接的物理篩選單元A、親和性篩選單元B、閥門C、細(xì)胞培養(yǎng)單元D。物理篩選單元A、親和性篩選單元B的結(jié)構(gòu)與上述用于細(xì)胞篩選的微流控芯片的結(jié)構(gòu)相同。
[0036]如圖11所示，所述細(xì)胞培養(yǎng)單元D包括營(yíng)養(yǎng)液灌注單元DlOO(圖12)、生物膠灌注單元D200(圖13)及多個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)室(圖14)，三者之間通過(guò)微橋D6連通。具體的:所述營(yíng)養(yǎng)液灌注單元DlOO位于生物膠灌注單元D200的外圍，所述生物膠灌注單元D200位于細(xì)胞培養(yǎng)室的外圍，所述生物膠灌注單元D200上設(shè)有微橋，每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)室之間以及細(xì)胞培養(yǎng)室與營(yíng)養(yǎng)液灌注單元、生物膠灌注單元之間均通過(guò)微橋連通。
[0037]所述生物膠灌注單元及微橋內(nèi)灌注基質(zhì)膠，所述基質(zhì)膠為溫度敏感性生物膠，在0-4 °C時(shí)為液體狀態(tài)，此時(shí)灌注于生物膠灌注單元中，使其充滿膠體流道及各個(gè)微橋，在37 °C維持8-12h，開(kāi)始呈凝膠狀，具有一定的強(qiáng)度。凝膠狀的基質(zhì)膠可以允許營(yíng)養(yǎng)液灌流通道中的小分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及化療藥物通過(guò)，而不允許細(xì)胞通過(guò)，從而可以充分保障營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和化療藥物彌散至細(xì)胞培養(yǎng)室中；也可以允許細(xì)胞因子通過(guò)，如細(xì)胞代謝產(chǎn)生的生物蛋白、小分子有機(jī)物及無(wú)機(jī)物，使得不同細(xì)胞培養(yǎng)室內(nèi)的不同細(xì)胞相互影響。
[0038]所述基質(zhì)膠的濃度以及微橋的長(zhǎng)度、寬度以及膠體流道的長(zhǎng)度、寬度設(shè)計(jì)，均為了保證基質(zhì)膠可以剛好充滿微橋，由于表面張力的作用，基質(zhì)膠不會(huì)溢出微橋。因此，設(shè)置微橋長(zhǎng)為80-120μπι、寬為30-60μπι，兩個(gè)微橋的間距為150-250μπι，膠體流道的寬度為150 -250
μ??ο
[0039]所述細(xì)胞培養(yǎng)單元內(nèi)灌注稀釋膠和細(xì)胞的混合物，所述稀釋膠是使用完全培養(yǎng)液將基質(zhì)膠稀釋4-8倍后得到的。所述完全培養(yǎng)液也習(xí)慣性稱為完全培養(yǎng)基，完全培養(yǎng)基(Complete Medium)這是一種在基本培養(yǎng)基內(nèi)加入一些富含氨基酸、維生素和堿基之類的天然物質(zhì)，即加入生長(zhǎng)因子而制成的各種營(yíng)養(yǎng)基，可用來(lái)滿足微生物的各種營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的生長(zhǎng)需要，是微生物學(xué)上常用的一種培養(yǎng)基。
[0040]所述多個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)室中，每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)室可以培養(yǎng)一種細(xì)胞，多種細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)，多種細(xì)胞產(chǎn)生的生物因子可通過(guò)微橋彌散至整個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)單元。其中一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)室的細(xì)胞入口通過(guò)閥門C與親和性篩選單元的第二排出通道B5連接;也即閥門C控制細(xì)胞培養(yǎng)單元D與親和性篩選單元B的連通或斷開(kāi)。所述閥門可以設(shè)置為圓柱形小口，內(nèi)有可上下移動(dòng)的橡膠管，上移橡膠管則閥門打開(kāi)，細(xì)胞培養(yǎng)單元D與親和性篩選單元B連通，經(jīng)篩選后的樣本細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)室進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng);下移橡膠管則閥門關(guān)閉，細(xì)胞培養(yǎng)單元D與親和性篩選單元B斷開(kāi)，成為兩個(gè)獨(dú)立的系統(tǒng)。
[0041]
實(shí)施例1
如圖14所示是細(xì)胞培養(yǎng)單元D的一種結(jié)構(gòu)，包括三個(gè)并列的細(xì)胞培養(yǎng)室D310、D320、D330，每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)室設(shè)有細(xì)胞入口和細(xì)胞出口，細(xì)胞培養(yǎng)室呈四邊形，內(nèi)部設(shè)有4-8個(gè)支撐柱。生物膠灌注單元D200包圍在每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)室D310、D320、D330的外圍，將基質(zhì)膠由生物膠灌入口D201灌入，充滿整個(gè)膠體通道及微橋，包圍細(xì)胞培養(yǎng)室后由出膠口D202排出。所述營(yíng)養(yǎng)液灌注單元DlOO包圍在生物膠灌注單元D200外圍，營(yíng)養(yǎng)液由營(yíng)養(yǎng)液灌入口DlOl灌入，在營(yíng)養(yǎng)液出口 D102處設(shè)有負(fù)壓吸引裝置(可以是負(fù)壓吸引微量注射器)為營(yíng)養(yǎng)液灌注提供負(fù)壓，使得營(yíng)養(yǎng)液充滿整個(gè)營(yíng)養(yǎng)液通道。本實(shí)施例中微橋長(zhǎng)為ΙΟΟμπι、寬為50μηι、間距為200μηι，膠體流道的寬度為200μηι。
[0042]本實(shí)施例中細(xì)胞培養(yǎng)室D320通過(guò)閥門與親和性篩選單元的第二排出通道Β5連接，因此，D320為篩選后的目標(biāo)細(xì)胞培養(yǎng)室，細(xì)胞入口連接下方的第二排出通道Β5，上方的長(zhǎng)方形口為第二細(xì)胞出口 D305。兩側(cè)的D310和D330為兩種不同細(xì)胞的培養(yǎng)室，上方的長(zhǎng)方形口是第一及第三細(xì)胞入口 D301，下方是第一及第三細(xì)胞出口 D304。
[0043]將篩選得到的目標(biāo)細(xì)胞以及其他兩種細(xì)胞同時(shí)接種在所述芯片上，不同類型細(xì)胞彼此間不接觸，但其產(chǎn)生的細(xì)胞因子可以通過(guò)微橋中的基質(zhì)膠，彌散到整個(gè)體系中，實(shí)現(xiàn)更接近實(shí)體狀態(tài)下的微環(huán)境模擬，在所述營(yíng)養(yǎng)液灌流單元的不同時(shí)段內(nèi)灌注營(yíng)養(yǎng)液，并通過(guò)生物膠灌注單元上的微橋彌散至細(xì)胞培養(yǎng)池內(nèi)。本芯片可以對(duì)培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞變化進(jìn)行實(shí)時(shí)觀測(cè)，連續(xù)觀察細(xì)胞間的相互作用，可以根據(jù)不同功能需求進(jìn)行相應(yīng)操作。
[0044]
實(shí)施例2
采用所述微流控聯(lián)合芯片對(duì)膀胱癌腫瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選及細(xì)胞培養(yǎng)。
[0045]在實(shí)驗(yàn)前，關(guān)閉閥門C，將親和素-生物素經(jīng)抗體灌入口BI包被到第二篩選腔室Β3，然后將膀胱癌單克隆抗體BCMabl，再經(jīng)抗體灌入口BI灌入到親和性篩選單元，包被抗體。同時(shí)在0-40C時(shí)，將基質(zhì)膠灌注于生物膠灌注單元中，使其充滿膠體流道及各個(gè)微橋，在37°C維持8-12h，開(kāi)始呈凝膠狀。同時(shí)預(yù)先標(biāo)記、處理腫瘤樣本細(xì)胞，制成稀釋膠和細(xì)胞的混合物，細(xì)胞在稀釋膠內(nèi)的濃度為16 -1OVmlo
[0046]BCMabl是一種高特異性的抗膀胱癌單克隆抗體，能夠識(shí)別異常糖基化修飾的整合素a3bl，是一種膀胱癌腫瘤標(biāo)志物。經(jīng)證實(shí)異常糖基化修飾的整合素a3bl只表達(dá)于人膀胱腫瘤的細(xì)胞膜上，并與膀胱癌的腫瘤分期和病理分級(jí)呈正相關(guān)。該抗體在不是很高濃度下對(duì)細(xì)胞無(wú)任何損傷，并且該抗體可被細(xì)胞內(nèi)吞，消化掉。高濃度的抗體可與低濃度抗體競(jìng)爭(zhēng)抗原表位。
[0047]實(shí)驗(yàn)過(guò)程圖如圖15所示，實(shí)驗(yàn)時(shí)將上述預(yù)先標(biāo)記、處理的腫瘤細(xì)胞加入到血液樣本中，由進(jìn)液柱經(jīng)第一灌入口Al和第一灌入通道A2，進(jìn)入第一篩選腔室A3，依據(jù)確定性橫向偏移原理(DLD)，直徑小于臨界尺寸的細(xì)胞穿越柱間間隙繼續(xù)沿主流動(dòng)方向運(yùn)動(dòng)，進(jìn)入第一廢液收集通道A5經(jīng)第一廢液收集口A4收集，而大于臨界尺寸的細(xì)胞在每一排處都會(huì)橫向迀移至相鄰的流線中，從而能沿著與主流動(dòng)方向成一定角度的軌跡運(yùn)動(dòng)，進(jìn)入第一排出通道A6，實(shí)現(xiàn)兩者的連續(xù)分離，完成初步篩選。
[0048]初篩樣本經(jīng)第二灌入口 B2進(jìn)入到親和性篩選單元，樣本細(xì)胞與抗體結(jié)合，停留在第二篩選腔室B3底部，篩選后的廢液經(jīng)第二廢液收集口 B4排出。此時(shí)，依據(jù)BCMabI抗體的特性，將略高濃度的BCMab I抗體經(jīng)抗體灌入口 BI灌入到第二篩選腔室B3，一段時(shí)間后，鏡下觀察細(xì)胞釋放情況。當(dāng)捕獲細(xì)胞釋放之后，即得到目標(biāo)細(xì)胞，然后將閥門打開(kāi)，目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)入到細(xì)胞培養(yǎng)室中(如圖14是進(jìn)入到細(xì)胞培養(yǎng)室D320中)，同時(shí)在其他細(xì)胞培養(yǎng)室中接種制作好的其他兩種細(xì)胞(如圖14是接種到細(xì)胞培養(yǎng)室D310和D330中)。因此在同一個(gè)微流控芯片中完成了細(xì)胞篩選與細(xì)胞培養(yǎng)，簡(jiǎn)化了操作過(guò)程，提高了工作效率。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種用于細(xì)胞篩選的微流控芯片，其特征在于，包括物理篩選單元及親和性篩選單 元，所述物理篩選單元包括n個(gè)并聯(lián)的第一篩選腔室，n多1，所述第一篩選腔室的入口連接 第一灌入口，所述第一篩選腔室的出口同時(shí)連接第一廢液收集通道和第一排出通道;所述 篩選管道內(nèi)部設(shè)有多排立柱，相鄰兩個(gè)立柱間錯(cuò)開(kāi)的距離d=l/3A，同一排每相鄰兩個(gè)立柱 間的間隙寬度G=A-2R，上一排立柱與下一排立柱夾角a=arCtanl/3，其中A指相鄰兩個(gè)立柱 的中心距離，R指立柱的直徑；所述親和性篩選單元包括第二篩選腔室，所述第二篩選腔室的上游設(shè)有抗體灌入口、 第二灌入口，下游設(shè)有第二廢液收集通道、第二排出通道；所述第一排出通道的入口連接物理篩選單元，出口連接親和性篩選單元。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于細(xì)胞篩選的微流控芯片，其特征在于，所述相鄰兩個(gè) 立柱的中心距離人=〇 ? 057-0 ? 075mm。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于細(xì)胞篩選的微流控芯片，其特征在于，所述第二篩 選腔室的頂部設(shè)有擾流層，所述擾流層由多個(gè)平行排列的擾流棒組成，相鄰兩個(gè)擾流棒之 間的間距為100-300M1;所述擾流棒為直線結(jié)構(gòu)或曲線結(jié)構(gòu)。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種用于細(xì)胞篩選的微流控芯片，其特征在于，所述擾流層呈魚骨結(jié)構(gòu)，每一個(gè)擾流棒包括依次連接的長(zhǎng)波和短波，所述長(zhǎng)波的垂直高度a等于兩個(gè)擾流棒之間的距離b，所述短波的垂直高度c等于長(zhǎng)波垂直高度a的一半。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于細(xì)胞篩選的微流控芯片，其特征在于，所述第二篩選 腔室的內(nèi)部設(shè)有多個(gè)支撐柱。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于細(xì)胞篩選的微流控芯片，其特征在于，所述第一廢液 收集通道或第二廢液收集通道的形狀為倒L形收集通道、箭頭形收集通道或鏡像倒L形收集 通道;所述倒L形收集通道或箭頭形收集通道與廢液收集口連接處為漏斗型結(jié)構(gòu);所述鏡像 倒L形收集通道與廢液收集口連接處為弧形結(jié)構(gòu)。7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的一種用于細(xì)胞篩選的微流控芯片，其特征在于，所述 第二篩選腔室內(nèi)部鑲嵌有抗體;首先，將鏈霉親和素包被到第二篩選腔室內(nèi)，再將生物素化 抗體灌入到第二篩選腔室內(nèi)，孵化10_20min，使生物素化抗體與鏈霉親和素結(jié)合，最后封閉 親和性篩選單元。8.—種微流控聯(lián)合芯片，其特征在于，包括權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的物理篩選單元、 親和性篩選單元，還包括細(xì)胞培養(yǎng)單元，以及控制親和性篩選單元、細(xì)胞培養(yǎng)單元之間聯(lián)通 或阻斷的閥門；所述親和性篩選單元通過(guò)第二排出通道與細(xì)胞培養(yǎng)單元連接，所述閥門位 于第二排出通道上。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種微流控聯(lián)合芯片，其特征在于，所述閥門的結(jié)構(gòu)為圓柱形 小口，內(nèi)部有可上下移動(dòng)的橡膠管，上移橡膠管則閥門打開(kāi)，細(xì)胞培養(yǎng)單元與親和性篩選單 元連通;下移橡膠管則閥門關(guān)閉，細(xì)胞培養(yǎng)單元與親和性篩選單元斷開(kāi)。10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種微流控聯(lián)合芯片，其特征在于，所述細(xì)胞培養(yǎng)單元包括 營(yíng)養(yǎng)液灌注單元、生物膠灌注單元及細(xì)胞培養(yǎng)室，三者之間通過(guò)微橋連通;所述生物膠灌注 單元及微橋內(nèi)灌注基質(zhì)膠。
【文檔編號(hào)】C12M3/00GK105950469SQ201610400082
【公開(kāi)日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年6月8日
【發(fā)明人】牛海濤, 王云超, 王建寧
【申請(qǐng)人】牛海濤